方法文章

高通量深度蛋白质组分析通过16重串联质谱标签标记结合二维色谱与质谱技术

DOI：

10.3791/61684

⸱

2020年8月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文展示了一种利用16重串联质谱标签试剂开发的优化高通量实验方案，可实现对生物样本的定量蛋白质组分析。通过广泛的碱性pH分级分离结合高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测，有效减轻了比值压缩效应，并实现了深度的蛋白质组覆盖。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

同重 tandem 质量标签（TMT）标记技术因其高通量多重检测能力和深度蛋白质组覆盖而被广泛应用于蛋白质组学研究。最近，一种扩展的 16 重 TMT 方法被引入，进一步提高了蛋白质组学研究的通量。本文中，我们介绍了一种优化的 16 重 TMT 基础深度蛋白质组分析流程，包括蛋白质样品制备、酶解消化、TMT 标记反应、二维反相液相色谱（LC/LC）分离、串联质谱（MS/MS）检测以及计算数据处理。文中重点强调了针对 16 重 TMT 分析流程中的关键质量控制步骤和改进措施。该多重分析流程为分析多种复杂样品（如细胞、组织和临床标本）提供了强有力的工具。在单次实验中，可对来自最多 16 个不同样品的极其复杂的生物样品中的超过 10,000 种蛋白质及其翻译后修饰（如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化）进行定量，为基础研究和临床研究提供了高效的技术手段。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

质谱技术的快速发展已使得蛋白质组学应用能够实现高灵敏度和深度的蛋白质组覆盖1,2。尽管取得了这些进展，对于需要分析大量样本队列的研究人员而言，样本多重检测仍是当前的瓶颈。

多重同重标记技术被广泛用于大规模样本的蛋白质组范围内的相对定量分析3,4,5,6。基于串联质谱标签（TMT）的定量方法因其高通量多重检测能力而成为常用选择7,8。TMT试剂最初以6重试剂盒形式推出，可同时定量最多6个样本9。该技术随后扩展至可定量10–11个样本10,11。近期开发的16重TMTpro试剂（以下简称TMT16）进一步将单次实验的多重检测能力提升至16个样本12,13。TMT16试剂采用基于脯氨酸的报告基团，而11重TMT则使用二甲基哌啶衍生的报告基团。TMT11与TMT16均使用相同的胺反应基团，但TMT16的质量平衡基团比TMT11更大，从而可在报告离子中组合8个稳定的C13和N15同位素，实现16种不同的报告标签（图1）。

多重检测能力的提升为设计具有足够重复次数的实验提供了平台，有助于克服统计学上的挑战14。此外，16重TMT中的额外通道有助于减少每个通道所需的起始材料总量，这可能促进新兴的单细胞蛋白质组学的发展15。高通量多重检测能力在翻译后修饰的定量分析中也具有重要价值，因为此类分析通常需要大量的起始材料16,17。

采用TMT技术的蛋白质组学工作流程已得到简化18,19,20，并在过去十年中于样品制备、液相色谱分离、质谱数据采集以及计算分析等方面取得了显著发展21,22,23,24,25,26。我们之前的文章对10重TMT平台提供了深入的概述27。本文所述方案介绍了TMT16的详细且经过优化的方法，包括蛋白质提取与消化、TMT16标记、样品合并与脱盐、碱性pH和酸性pH反相（RP）液相色谱（LC）、高分辨率质谱（MS）以及数据处理（图2）。该方案还强调了为成功完成定量蛋白质组学实验而引入的关键质量控制步骤。该方案可常规用于高重复性地鉴定和定量超过10,000种蛋白质，以研究生物通路、细胞过程及疾病进展20,28,29,30。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究使用的人体组织经由巴纳太阳健康研究所的脑与身体捐赠项目批准获取。

1. 组织蛋白提取与质量控制

注意：为减少样品采集对蛋白质组的影响，应尽可能在低温条件下以最短时间完成样品收集31。这一点在分析翻译后修饰时尤为重要，因为这些修饰通常具有不稳定性，例如某些磷酸化事件的半衰期仅有数秒32,33。

  1. 切除并称量组织样本
    1. 使用分析天平对1.5 mL微量离心管进行去皮，并将该管置于干冰上预冷。
    2. 从特定区域切取冷冻组织（例如人脑组织，约10 mg），切成小块，并立即将组织块转移至预冷的离心管中。
      注意：为减少样本异质性，所有16个样本应使用大小均一且解剖位置一致的组织。通常从组织中获得的蛋白质量为组织重量的5-10%。
    3. 连同样品一起称量离心管，并立即将其放回干冰上。其余15个样本采用相同操作流程处理。组织分离后应立即置于干冰中，并储存于˗80 °C。
  2. 裂解组织样本
    1. 在实验当天新鲜配制裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 8.5，8 M尿素，0.5%脱氧胆酸钠）。应向裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，以维持蛋白的磷酸化状态。
      注意：使用前将裂解缓冲液置于室温，因为8 M尿素在冰上会析出，可能导致样本裂解过程中蛋白变性不完全，降低蛋白消化效率。
    2. 向每个样本中加入裂解缓冲液（每10 mg组织加入100 μL裂解缓冲液，使最终蛋白浓度达到5至10 μg/μL）和玻璃珠（约为裂解液体积的20%，直径0.5 mm）。
    3. 在4 °C下使用搅拌器以速度8裂解组织30秒，暂停5秒，重复操作直至样本完全匀浆（约5个循环）。
  3. 制备裂解液分装样本
    1. 每个样本至少分装两份。小份样本（约10 μL）用于蛋白浓度测定及蛋白质量评估（例如通过Western blot验证阳性对照蛋白）；大份样本（约50 μL）用于蛋白质组分析。
    2. 立即在干冰上冷冻分装样本，并于-80 °C保存，待后续使用。
  4. 测定蛋白浓度
    注意：蛋白浓度可通过BCA法或短时间SDS凝胶染色法测定34（图3A）。由于组织裂解液中非蛋白还原性成分可能影响BCA法的测定结果，建议通过短时间SDS凝胶染色法验证蛋白浓度。此处介绍短时间SDS凝胶染色法。
    1. 将16个分装样本稀释10倍，并制备BSA标准品（例如BSA梯度浓度为0.15、0.5、1.5和3 μg）。
    2. 将样本与BSA标准品上样至10% SDS-PAGE凝胶（26孔），含浓缩胶，电泳至所有蛋白迁移入分离胶约3 mm处停止。
    3. 用考马斯亮蓝染色1小时，随后脱色至空白区域背景清晰。
    4. 扫描凝胶，使用ImageJ软件测量考马斯亮蓝染色蛋白条带的强度，并根据测量值绘制BSA标准曲线。
    5. 依据标准曲线计算各样本的绝对蛋白浓度。
      注意：本实验中各样本的最终蛋白浓度约为5-10 µg/µL。对于基于TMT16的蛋白质组学分析，每样本50 µg蛋白（全蛋白质组分析共需0.8 mg蛋白）已足够。
  5. 样本质量控制
    注意：此质量控制步骤对于在进行TMT分析前识别低质量样本至关重要。对于已知存在蛋白变化的样本，建议通过Western blot验证其变化。同时推荐进行标准SDS-PAGE分析，以检查蛋白谱型并排除严重降解的样本（图3B）。
    1. 从每个小份分装样本中取约10 µg蛋白，上样至梯度SDS-PAGE凝胶，电泳至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部。
    2. 用考马斯亮蓝染色凝胶并进行脱色。检查蛋白质量，剔除严重降解的蛋白样本。
      注意：降解样本的特征为高分子量区域蛋白条带极少，而低分子量区域条带增强（图3B）。

2. 溶液中蛋白质消化、肽段还原与烷基化、消化效率检测及肽段脱盐

  1. 使用 Lys-C 和胰蛋白酶进行蛋白质消化
    1. 从每个样品的大份 aliquot 中取约 50 µg 蛋白质，并加入裂解缓冲液至终体积为 50 µL。
    2. 加入 100% 乙腈（ACN），使终浓度达到 10%。
    3. 按蛋白质与 Lys-C 质量比 100:1（w/w）加入 Lys-C，室温孵育 3 小时，进行 Lys-C 消化。
    4. 用 50 mM HEPES 缓冲液（pH 8.5）将样品稀释至终浓度为 2 M 尿素。
    5. 按蛋白质与胰蛋白酶质量比 50:1（w/w）向每个样品中加入胰蛋白酶，室温消化 3 小时或过夜。
  2. 肽段的还原与烷基化
    1. 加入新配制的二硫苏糖醇（1 M DTT）溶液，使终浓度为 1 mM，室温孵育 1 小时，以还原二硫键。
    2. 加入新配制的碘乙酰胺（1 M IAA）溶液，使终浓度为 10 mM，避光反应 30 分钟，以烷基化半胱氨酸残基。
    3. 加入 1 M DTT 至终浓度 30 mM，淬灭未反应的 IAA，室温再孵育 30 分钟。
  3. 检测消化效率
    1. 取每个样品约 1 μg，按照制造商说明书，使用 C18 树脂包被的移液枪头进行脱盐处理。
    2. 通过短梯度 LC-MS/MS 运行分析每个样品（详见步骤 5）。
    3. 对 MS 原始数据进行数据库搜索（详见步骤 6）。计算至少含有一个胰蛋白酶非特异性切割位点的已鉴定肽段所占百分比，该值通常低于 15%。
    4. 若该百分比大于 15%，需向样品中补充胰蛋白酶并重复消化。
    5. 消化完成后，加入三氟乙酸（TFA）至终浓度 0.5%（v/v）酸化样品，并用 pH 试纸检测，确保 pH 小于 3。
  4. 肽段脱盐
    1. 将酸化后的肽段在 21,000 x g 离心 10 分钟，将上清转移至新管中。
    2. 用 250 μL 100% 甲醇洗涤 C18 脱盐柱（约 25 μL 树脂）两次，每次在 500 x g 离心 30 秒。
      注意：为减少脱盐过程中肽段损失，应选择结合容量与上样量相匹配的脱盐柱。
    3. 使用 250 μL 洗脱缓冲液（60% ACN，0.1% TFA）洗涤柱子两次，每次在 500 x g 离心 30 秒。
    4. 用 250 μL 平衡与洗涤缓冲液（0.1% TFA）平衡柱子两次，每次在 500 x g 离心 30 秒。
    5. 将样品加载至预平衡的柱子上，以 100 x g 离心 6 分钟，使样品充分结合柱子，确保所有溶液均通过柱体。
    6. 用 250 μL 平衡与洗涤缓冲液洗涤柱子三次，每次在 500 x g 离心 30 秒。
    7. 向每根柱子加入 125 μL 洗脱缓冲液，以 100 x g 离心 3 分钟洗脱肽段，检查柱子中无残留溶液。
    8. 将洗脱的肽段在真空浓缩仪中干燥，并于 -80 °C 保存，用于后续 TMT 标记。

3. 肽段的TMT16标记、标记效率检测、样品合并及标记肽段脱盐

  1. 肽段的TMT16标记
    1. 将每份脱盐后的肽样品用50 μL 50 mM HEPES（pH 8.5）重悬，通过多次涡旋或超声溶解，随后使用pH试纸确认pH值。
      注意：如果样品在标记前未完全干燥，可能呈酸性，从而对标记效率产生不利影响。确保pH值在7至8之间。
    2. 每个样本取约 1 μg 未标记的肽段作为阴性对照，用于 TMT 标记效率检测。
    3. 将TMT16试剂溶解于无水乙腈（ACN）中。按TMT:蛋白质量比1.5:1（w/w）加入试剂，室温孵育30分钟，进行标记反应。
      注意：TMT16所用的TMT:蛋白比例比TMT11高50%。这一微小差异可能是由于TMT16试剂的分子质量比TMT11大（1.2倍）所致。蛋白质定量基于未考虑脱盐过程中损失的样品进行估算。
  2. 标记效率检测
    1. 从每个样本中取约 1 μg 标记的肽段用于标记效率检测。剩余样本不淬灭反应，直接置于 -80 °C 保存。
    2. 使用C18树脂包被的移液枪头，按照生产商说明书对约1 μg的TMT16标记和未标记样品进行脱盐处理。
    3. 采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析样品（参见第5节，梯度程序为10分钟）。
    4. 通过分析未标记样品与标记样品之间未标记肽段的MS1强度降低程度，估算标记效率。选择6至10种不同的肽段验证标记效率，以确保所有肽段均被标记。  为实现完全标记， 未标记的肽段未被观察到。
      注意：确保所有样品的完整标记对于后续准确的蛋白质鉴定和定量至关重要。
    5. 如果标记未完全完成，可添加额外的TMT试剂以标记剩余的肽段，并在淬灭前再次检测标记效率。待样品完全标记后，通过加入羟胺至终浓度0.5%，在室温下淬灭反应，并于室温孵育15分钟。
  3. 样本混合与脱盐
    1. 将每份TMT标记的样品取一半混合，制成混合样本。
    2. 从混合物中取1 μg，用C18树脂包被的移液枪头进行脱盐，随后采用短梯度（约30分钟）进行LC-MS/MS分析。
    3. 使用每种TMT16报告离子的平均强度计算相对浓度，并比较16个通道之间的差异。为实现各通道的等量混合，根据计算所得的平均强度将剩余的TMT标记样品加入混合物中。重复调整，直至所有样品达到均一混合。显示样品混合过程的代表性数据如图所示 表1.
      注意：由于移液误差可能影响浓度和蛋白质定量的准确性，确保混合样品量的准确性至关重要。16个样品间的信号强度差异应小于5%。
  4. 标记肽段脱盐
    注意：由于TMT16标记反应中的背景副产物（如羟胺淬灭反应生成的TMTpro-NHOH，以及TMT羟基化生成的TMTpro-OH）具有疏水性，因此对TMT16标记的样品采用较为充分的洗涤条件，以有效去除这些副产物。洗涤时在常规洗涤缓冲液（0.1% TFA）中加入5%乙腈（ACN），并使用10倍柱床体积的洗涤缓冲液。
    1. 酸化合并的样品 通过加入10%三氟乙酸（TFA）调节至pH < 3.
    2. 将混合样品在21,000 × g下离心 x g 孵育10分钟，将上清液转移至新管中。
    3. 使用真空浓缩仪干燥样品以去除乙腈（ACN）。
    4. 使用50 mg固相萃取柱，依次用2 mL 100%甲醇、2 mL洗脱缓冲液（60%乙腈加0.1%三氟乙酸）和2 mL洗涤缓冲液（0.1%三氟乙酸）润洗，对萃取柱进行预处理。
    5. 将样品上样至色谱柱。调节流速至约100 μL/min，以确保多肽充分结合。收集流穿液。
    6. 用1 mL洗涤缓冲液洗涤柱子三次。
    7. 用1 mL洗脱缓冲液洗脱肽段。
    8. 在真空浓缩仪中将洗脱的肽段干燥，并于 -80 °C 保存，用于后续分馏。

4. 离线基本pH液相色谱预分级

  1. 分级系统准备
    1. 为微升级流速高效液相色谱系统配制缓冲液 A（10 mM 甲酸铵，pH 8.0）和缓冲液 B（10 mM 甲酸铵，90% 乙腈，pH 8.0）。
    2. 在微升级流速高效液相色谱系统中安装一根含有桥联亚乙基杂化颗粒的高效液相色谱柱（粒径 3.5 µm，4.6 mm × 25 cm），用于样品分级。
    3. 安装一个 100 μL 的进样环，并依次用 300 μL 甲醇、水和缓冲液 A 清洗进样环。
    4. 使用 100 μL 体积比为 1:1:1:1 的异丙醇 : 甲醇 : 乙腈 : 水混合液清洗色谱柱，然后用 95% 的缓冲液 A 平衡色谱柱 0.5 小时。
  2. 样品准备
    1. 将汇集并脱盐后的 TMT16 样品溶解于 70 μL 缓冲液 A 中，确认样品 pH 值约为 8.0。若仍呈酸性，则使用 28% 氢氧化铵（NH4OH）调节 pH 至 8.0。
      注意：为避免样品损失，样品体积应小于进样环体积的 70%。
    2. 在 21,000 x g 条件下离心 10 分钟，以去除沉淀物。
  3. 分级与合并
    注意：在正式进行样品分级前，强烈建议先进行预实验，以确保液相色谱系统状态良好。可使用少量实际样品（约 5%）或非 TMT 标记的肽段混合物进行测试。
    1. 进样后按以下梯度进行分级：5% 缓冲液 B 维持 10 分钟，5–15% 缓冲液 B 持续 2 分钟，15–45% 缓冲液 B 持续 148 分钟，45–95% 缓冲液 B 持续 5 分钟。流速设为 0.4 mL/min。
    2. 设置馏分收集器每 1 分钟收集一次馏分，并将 160 个馏分通过 4 个循环合并为 40 个馏分。
      注意：合并过程是将相同时间区间内洗脱出的早期、中期和晚期液相色谱馏分组合成一个合并馏分。合并后的馏分在第一维液相色谱中重叠较少，从而提高了第二维液相色谱洗脱窗口的利用效率。此外，经过多轮合并，肽段可在所有合并馏分中更均匀分布。该方法已被证明相较于单独分析各馏分可显著提高蛋白质组覆盖度35,36。
    3. 将所有合并后的馏分在真空浓缩仪中干燥，并将干燥样品于 -80 °C 保存，用于后续 LC-MS/MS 分析。

5. 酸性 pH 反相液相色谱-质谱/质谱分析

  1. 酸性 pH 反相液相色谱-串联质谱（RPLC-MS/MS）系统准备
    1. 将 1.9 μm C18 树脂填充至空柱（内径 75 μm，尖端孔径 15 μm）中，填充长度为 10–15 cm。
    2. 使用蝴蝶式加热器将色谱柱加热至 65 °C，以降低反压。
    3. 用 95% 缓冲液 B（3% 二甲基亚砜、0.2% 甲酸和 67% 乙腈）充分清洗色谱柱，然后用 95% 缓冲液 A（3% 二甲基亚砜和 0.2% 甲酸）完全平衡色谱柱。
    4. 在分析实验样品前，先运行 100 ng 大鼠脑肽段或 BSA 肽段，以检测 LC-MS/MS 系统的性能。
  2. 合并组分的 LC-MS/MS 分析
    1. 将碱性 pH 组分中干燥的肽段用 5% 甲酸（FA）重新溶解，并在 21,000 × g 离心 5 分钟。将每份样品的上清液转移至 HPLC 小瓶插件中。
    2. 将每组分约 1 μg 肽段上样至色谱柱。以 0.25 μL/min 的流速，采用 18–45% 缓冲液 B 的 60 分钟梯度洗脱肽段。
      注意：为获得较高的鉴定数量，可先运行一个组分，并根据首次运行结果调整其余组分的梯度。最佳梯度应使肽段在整个梯度范围内均匀分布（图 4A）。
    3. 采用以下参数操作质谱仪，用于 TMT16 标记样品的分析：MS1 扫描（全扫描范围：450–1600 m/z；Orbitrap 分辨率：60,000；自动增益控制目标值：1 × 106；最大离子时间：50 ms）和 20 次数据依赖性 MS2 扫描（Orbitrap 分辨率：60,000；AGC 目标值：1 × 105；最大离子时间：110 ms；HCD 归一化碰撞能量：32%；隔离窗口：1.0 m/z；隔离偏移：0.2 m/z；动态排斥：10 s）。
      注意：此处使用的参数是在一种类型的质谱仪上优化的（见材料表）。对于不同的质谱仪器，用户应微调仪器参数以获得高质量结果。其中一个设置是监测归一化 HCD 碰撞能量，因为最佳能量可能因仪器不同以及 TMT11 与 TMT16 之间而有所差异。

6. 数据处理

注意：数据分析使用 JUMP 软件套件37,38,39 进行，该套件包括混合型数据库搜索引擎（基于图谱和标签）、用于控制已鉴定肽段/蛋白质假发现率（FDR）的过滤软件，以及用于 TMT 数据集的定量分析软件。根据用户的具体情况，也可使用其他商业或免费程序进行数据分析。

  1. 数据库检索
    1. 将质谱仪生成的 .raw 文件转换为 .mzXML 文件，并将 MS2 谱图搜索比对至非冗余的目标-诱饵数据库40 根据UniProt人类蛋白质序列（或其他合适的物种特异性数据库）生成，用于计算已鉴定蛋白质的错误发现率（FDR）。
      注意：通过整合 Swiss-Prot 和 TrEMBL 数据库中的蛋白质序列来构建非冗余数据库。也可添加上述参考数据库中未包含的自定义蛋白质序列，包括蛋白酶切割的蛋白质、含单核苷酸多态性的蛋白质以及常见污染物蛋白。
    2. 使用以下参数进行搜索：前体离子质量容差：10 ppm；产物离子质量容差：15 ppm；最大漏切位点数：2；最大修饰位点数：3；固定修饰：304.20715 赖氨酸残基和N端TMT16标签的Da值为57.02146 Cys残基上羧甲基化的固定修饰：57.02146 Da；Met残基上氧化的动态修饰：15.99492 Da。
  2. 筛选搜索结果
    1. 根据肽段长度过滤得到的肽段-谱图匹配结果（PSMs）（>6个氨基酸），前体离子的质量精度，以及基于JUMP的匹配得分（Jscore和ΔJn）。随后，肽段根据其长度、胰蛋白酶切割末端、修饰情况、漏切位点和电荷状态进行分组。
    2. 使用匹配得分进一步过滤数据，以在蛋白质（全蛋白质组分析）或肽段（磷酸化蛋白质组分析）水平上实现低于1%的错误发现率（FDR）。
      注意：如果在过滤步骤中缺失阳性对照肽段/蛋白质，则可将错误发现率（FDR）提高至合理水平，以挽回这些肽段/蛋白质。
    3. 对于一个蛋白质家族中多个成员共有的肽段，将匹配的成员聚类为一组。
      注意：根据简约性原则，该组由具有最多共享肽段且其他蛋白质由唯一肽段匹配的同源蛋白质代表。
  3. 蛋白质定量
    1. 使用统计软件套件中的内置程序，对所有匹配的肽谱匹配（PSM）中的TMT报告离子强度进行汇总，以定量蛋白质。
    2. 从每个被接受的 PSM 中提取 TMT 报告离子强度，并根据每种标记试剂的同位素分布对原始强度进行校正（例如，TMT16-126 分别产生 92.6%、7.2% 和 0.2% 的 m/z 为 126、127C 和 128C 的离子），然后基于用户定义的阈值过滤掉低强度和/或噪声较高的 PSM。使用样本的截尾均值（或中位数）强度对定量数据进行归一化，以校正上样偏差。
    3. 对于每个鉴定出的蛋白质，计算其匹配的肽谱匹配（PSM）在各样本间的均值中心化强度（即相对强度），并通过取各样本的平均值来汇总这些PSM的相对强度。通过将相对信号乘以三个最丰富匹配PSM的整体平均强度，将相对信号转换为绝对信号。
    4. 使用先前报道的 y1 离子校正方法进行准确的定量干扰校正37 该方法假设 y1 离子强度与报告离子强度相关。通过从干净的扫描数据中估算 y1 离子与报告离子强度之间的线性关系，推导并校正噪声扫描中受污染的 y1 离子强度所引入的干扰水平。
      注意：对于TMT标记的胰蛋白酶肽段，K-TMT和R残基在MS2谱图中是两个代表性的y1离子（分别为376.27574 Da和175.11895 Da）。若仅检测到其中一个y1离子，且与鉴定出的肽段一致，则该MS2谱图被视为干净的扫描；若两个y1离子均被检测到，则该MS2谱图被视为有噪声的扫描。
    5. 将蛋白定量值转移至电子表格中以进行进一步分析。采用主成分分析（PCA）或聚类分析等无监督数据分析方法来探究样本的分布情况。为鉴定差异表达蛋白，可使用统计学方法，例如 t-检验与方差分析（ANOVA）

7. 质谱数据验证

注意：在进行耗时的生物学实验之前，应使用至少一种验证方法来评估质谱数据的质量。

  1. 手动检查目标蛋白质的 MS/MS 谱图，以验证肽段序列和 TMT 报告离子强度。
  2. 采用基于抗体的方法（如蛋白质印迹或免疫组织化学分析）验证蛋白质水平的变化。为确认天然肽段的存在，可使用合成肽段作为内标物。在相同条件下，这些肽段的 MS/MS 谱图及在 LC-MS/MS 中的保留时间应完全一致。
  3. 采用靶向质谱方法验证蛋白质的变化。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新开发的TMT16方法在标记反应、脱盐及液相色谱-质谱（LC-MS）条件方面已得到系统优化41。此外，我们通过分析相同的人类阿尔茨海默病（AD）样本，直接比较了11重和16重标记方法41。在对TMT16的关键参数进行优化后，TMT11和TMT16方法均能实现相似的蛋白质组覆盖度、蛋白鉴定与定量效果，可鉴定出> 100,000条肽段，对应于> 10,000种人类蛋白质。

由于TMT16试剂比TMT11试剂更具疏水性，TMT16标记的肽段可能比TMT11标记的肽段更疏水，这可能导致在RPLC中出现不同的保留时间（RT）。因此，我们通过LC-MS/MS分析TMT11和TMT16标记的肽段混合物，评估了TMT16相对于TMT11对肽段保留时间的影响。我们发现，TMT16对中等疏水性肽段的保留时间具有显著影响，但对极高或极低疏水性的肽段影响较小。因此，不同TMT标记的肽段在LC梯度中可采用相似的起始和终止缓冲液B浓度。

随后，我们...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于TMT16的深度蛋白质组分析优化方案已在早期的出版物中成功实施12,13,41。采用本方案，可在单次实验中对多达16个不同样本中的10,000多种独特蛋白质进行高精度的常规定量。

为获得高质量的结果，需在整个实验流程中关注关键步骤。除我们之前文章中讨论的所有质控步骤外27，我们增加了针对TMT16流程的额外关键步骤。这些步骤对于确保实验成功至关重要。例如，在脱盐前通过LC-MS/MS分析可检测到明显的单电荷离子形式的TMT反应副产物（如羟胺淬灭反应产生的TMTpro-NHOH和TMT羟基化产生的TMTpro-OH）。在脱盐步骤中去除这些副产物极为关键。我们测试了不同的脱盐条件，发现将5% ACN加入常规洗涤缓冲液并结合10 × 用三倍柱体积的洗涤液洗涤可有效去除衍生物41此外，TMT16 ...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987、RF1AG064909 和 U54NS110435）以及 ALSAC（美国黎巴嫩叙利亚联合慈善协会）的支持。质谱分析在圣裘德儿童研究医院的蛋白质组学与代谢组学中心完成，该中心部分由美国国立卫生研究院癌症中心支持基金（P30CA021765）资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% Criterion TGX 预制中型蛋白凝胶Biorad5671035
10X TGS（Tris/甘氨酸/SDS）缓冲液BioRad161-0772
4–20% Criterion TGX 预制中型蛋白凝胶Biorad5671095
50% 羟胺Thermo Scientific90115
6 X SDS 样品上样缓冲液Boston Bioproducts IncBP-111R
甲酸铵（NH4COOH）Sigma70221-25G-F
氢氧化铵，28%Sigma338818-100ml
Bullet Blender 匀浆仪Next AdvanceBB24-AU
Butterfly Portfolio 加热器Phoenix S&TPST-BPH-20
C18 Ziptips 脱盐柱Harvard Apparatus74-4607用于脱盐
二硫苏糖醇（DTT）SigmaD5545
DMSOSigma41648
甲酸Sigma94318
组分收集器GilsonFC203B
Gel Code Blue 染色试剂Thermo24592
玻璃珠Next AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
高效液相色谱级乙腈Burdick & JacksonAH015-4
高效液相色谱级水Burdick & JacksonAH365-4
碘乙酰胺（IAA）SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
质谱仪Thermo ScientificQ Exactive HF
MassPrep BSA 消化标准品Waters186002329
甲醇Burdick & JacksonAH230-4
纳流UPLCThermo ScientificUltimate 3000
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒Thermo Scientific23225
ReproSil-Pur C18 树脂，1.9 μmDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
自装色谱柱New ObjectivePF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960用于脱盐
脱氧胆酸钠Sigma30970
真空离心浓缩仪（Speedvac）Thermo ScientificSPD11V
TMTpro 16plex 标记试剂组Thermo ScientificA44520
三氟乙酸（TFA）Applied Biosystems400003
胰蛋白酶PromegaV511C
超微量离心柱，C18Harvard apparatus74-7206用于脱盐
尿素SigmaU5378
Xbridge C18 柱Waters186003943用于碱性 pH 液相色谱

参考文献

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