利用流式细胞术进行尿液细胞外囊泡的粒径测定与表型分析

摘要

本方案描述了一种从健康人类供体尿液中分离尿液细胞外囊泡（uEVs）的方法，并通过流式细胞术检测其大小和表面标志物表达，对uEVs进行表型表征。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由任何细胞类型在尿液等体液中分泌的具有异质性的脂质膜复合物。这些囊泡的大小各异，直径范围从外泌体的40-100 nm到微囊泡的100-1000 nm。它们还可携带多种分子，这些分子可作为多种疾病预后和诊断的生物标志物。目前已有多种技术用于表征这些囊泡，其中之一是流式细胞术。然而，尚无现有报道阐明如何在检测生物标志物的同时，对EVs的浓度进行定量并按大小进行区分。本研究旨在描述一种利用常规流式细胞仪（无需对其配置进行任何修改）对尿液来源的细胞外囊泡（uEVs）进行分离、定量和表型分析的操作流程。该方法的局限性包括每份样本最多只能标记四种不同的生物标志物，且受限于样本中EVs的数量。尽管存在这些局限性，通过本方案及其后续分析，我们能够获得更多关于肾脏和脑损伤相关疾病中尿液样本内EVs标志物富集程度及其囊泡丰度的信息。

引言

在哺乳动物中，血液会循环通过肾脏250至300次以进行过滤，在此过程中形成尿液。这种生物液体的生成是一系列过程的结果，包括肾小球滤过、肾小管重吸收和分泌。尿液的主要成分为代谢废物和电解质。此外，其他副产物如肽类、功能蛋白以及细胞外囊泡（EVs）也会被排出^1,2,3,4,5,6。最初，尿液中的细胞外囊泡（uEVs）是在患有水平衡障碍患者的尿样中被发现的。这些患者体内存在如水通道蛋白-2（AQP2）等分子，该蛋白随后被用作此类疾病的生物标志物⁷。随后多项研究聚焦于确定uEVs的细胞来源，指出这些结构可由肾脏细胞（如肾小球、足细胞等）以及其他内皮或白细胞谱系的细胞分泌。此外，uEVs的数量及其富集的分子可能与多种疾病和病理状态相关^{8,9,10,11,12,13,14}。

总体而言，细胞外囊泡（EVs）是一类由脂质双分子层包被、通过被动或主动机制释放到不同体液中的高度异质性颗粒。根据其来源，EVs 可分为起源于内体的外泌体或源自质膜的微囊泡/微颗粒。然而，这种分类标准仅在直接观察到颗粒生物发生过程时才适用。因此，该领域多位研究人员已提出采用其他非简单的分类标准，包括物理特性、生化特性和细胞来源等^15,16,17。根据所分析分离物的性质，建议采用不同的分析技术对 EVs 进行表征。例如，针对富集得到的大颗粒 EVs（≥100 nm）或小颗粒 EVs（≤100 nm），分别建议采用流式细胞术或纳米颗粒追踪分析进行定量¹⁸。

如今，细胞外囊泡（EVs）作为多种疾病的生物标志物已受到广泛关注，因此研究人员正在探索不同的来源。其中最有前景的来源之一是尿液，因其易于获取且具有非侵入性。因此，本方案描述了一种通过差速离心法分离尿液细胞外囊泡（uEVs），并使用荧光染料标记抗体进行处理，继而利用常规的双激光四色流式细胞仪进行下游分析的实验流程。

方案

人尿液样本来自已签署知情同意书的健康志愿者。上述操作均经墨西哥国家医学与营养科学研究所Salvador Zubirán研究伦理委员会批准。

1. 尿液细胞外囊泡的分离

注意：尿液细胞外囊泡（uEVs）的分离方案修改自参考文献¹⁹。图1展示了uEVs分离流程的示意图。

图1：尿液细胞外囊泡（uEVs）分离用于流式细胞术分析的流程概览。 本方案中，首先离心晨尿以去除细胞和碎片；随后离心去除大囊泡，并通过处理去除THP蛋白；最后进行超速离心，经一次洗涤即可富集并获得uEVs。图中标注了用于WB验证的尿液组分保留步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 使用健康志愿者的晨尿（15 mL）。在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 10 分钟，以去除所有细胞和碎片。
   注意：优先使用新鲜尿液；若无法获得，则可使用在 -20 °C 下最多保存 3 个月，或在 -70 °C 下最多保存 6 个月的尿液。将尿液样本置于冰上解冻并剧烈涡旋混匀。所有操作均需在冰上或 4 °C 下进行。如需进行 Western 印迹分析，可选步骤为：另取一管，分装 200 µL 晨尿至独立离心管中，标记为“全尿”，于 -20 °C 保存待用，用于检测细胞外囊泡标志物。
2. 将步骤 1.1 中获得的上清液转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 45 分钟。将上清液转移至 8 mL 聚碳酸酯超速离心管中，并置于冰上保存。
   注意：可选步骤为，将步骤 1.1 中获得的上清液分装 200 µL 至另一标记为“无细胞尿液”的离心管中，用于 Western 印迹分析。
   1. 去除 Tamm-Horsfall 蛋白（THP）
      注意：THP 存在于尿液中，在肾病患者中含量较高。已有报道表明，THP 会降低尿源性细胞外囊泡（uEVs）的得率，因其可与 uEVs 结合。为去除该蛋白，需使用还原剂^3,6。
      1. 通过将 250 mM 蔗糖与 10 mM 三乙醇胺混合，配制分离溶液，并将 pH 调整至 7.6。
      2. 将步骤 1.2 所得沉淀与 500 µL 分离溶液混合，然后加入 5 µL β-巯基乙醇。
      3. 将沉淀混合物在 37 °C 下孵育 10 分钟，每 2 分钟涡旋一次。加入 500 µL 分离溶液，然后在 37 °C 下以 17,000 × g 离心 10 分钟。收集所得上清液（含还原态非聚集 THP 及 uEVs）。
3. 将步骤 1.2 和 1.2.1.3 中保留的上清液合并至同一 8 mL 聚碳酸酯超速离心管中，使用固定角转子超速离心机在 4 °C 条件下以 160,000 × g 离心 70 分钟。
   注意：可选步骤为，为进行 Western 印迹分析，将上述所得上清液分装 200 µL 至另一管中，标记为“无囊泡上清液”。该样本在检测细胞外囊泡标志物时可作为阴性对照。
4. 弃去上清液。向 8 mL 聚碳酸酯管中加入预冷的 1× PBS，于 4 °C 条件下以 160,000 × g 离心 70 分钟。
   注意：切勿弃去沉淀，因其含有 uEVs。1× PBS 需经灭菌处理，并使用孔径至少为 0.22 µm 的注射器滤器过滤。
5. 弃去上清液。将剩余上清液加入 8 mL 聚碳酸酯管中，于 4 °C 条件下以 160,000 × g 离心 70 分钟。
6. 弃去上清液，向沉淀中加入 8 mL 预冷的 PBS 以洗涤 uEVs。
7. 弃去上清液。让沉淀干燥后，用 1 mL 预冷的 PBS 重悬。保存于 -70 °C 待用。
   注意：若进行 Western 印迹分析，应使用含蛋白酶抑制剂的 50 µL RIPA 缓冲液重悬另一管中的沉淀，并于 -20 °C 保存待用。

2. 尿液细胞外囊泡（uEVs）的染色

注意：在对尿液细胞外囊泡（uEVs）进行染色和分析之前，必须至少执行一项MISEV2018¹⁸推荐的方法，以验证uEVs的正确分离；此处展示的是蛋白质印迹分析。图2显示了uEVs染色的代表性实验方案。

图2：尿源性细胞外囊泡（uEVs）染色及在流式细胞仪中捕获的总体流程。（A）uEVs染色示意图。取500,000个uEVs，加入抗体混合后于4 °C孵育12小时；随后加入CFSE并于37 °C孵育10分钟。此时uEVs内部含有CFSE，而抗体则结合于抗原表面。使用400 µL冷PBS重悬样本，并以低流速在流式细胞仪中捕获100 µL样本。（B）分析策略。第一个散点图（SSC-H 对 FL-X）显示uEVs的阴性对照，接着为CFSE染色uEVs的散点图，最后为uEVs抗体染色的直方图（黑色线），灰色线表示阴性对照。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 使用任何常规的比色法蛋白质检测试剂盒（如 材料表 中所述）对uEVs的蛋白含量进行定量，以计算uEVs的相对数量。将uEVs样品稀释至1:5，并按照试剂盒说明书中的操作步骤进行。
2. 根据先前报道的公式²⁰，将1 µg/mL的uEVs蛋白含量视为相当于800,000个uEVs/µL。确保在20 µL预冷的PBS中包含500,000个uEVs。
3. 按照 表1 所示标记各离心管。
   注意：所用离心管的数量取决于所使用的抗体种类；对于双激光器/四色流式细胞仪，每管最多可使用4种抗体，因此仅能检测FL1、FL2、FL3和FL4通道的信号，尽管需要进行补偿调节。在这些操作中，流式细胞术可使用1.5 mL微量离心管或5 mL圆底管。所需离心管列于 表1 中。第4管和第5管包含本实验方案中所有待用抗体的混合物。第8管和第9管作为问题对照管示例提供，因此该组对照必须包含各管中实际使用的抗体组合。

试管 1.	Megamix FSC 微球
试管 2.	PBS
试管 3.	含 CFSE 的 PBS
试管 4.	含问题 1 所有抗体的 PBS
试管 5.	含问题 2 所有抗体的 PBS
试管 6.	自发荧光对照	无任何试剂的 uEVs，仅溶于 PBS 中。
试管 7.	#uEVs	含 CFSE 的 uEVs
试管 8.	问题 1	含 CD37 FITC、CD53 PE、ADAM10 APC 的 uEVs
试管 9.	问题 2	含 CD9 FITC、TSPAN33 APC 的 uEVs

表1：试管标记。 示例展示如何标记试管。前几支试管为所需的所有对照。带有抗体-荧光染料的试管则根据染色情况而定。

4. 向已标记的试管中加入含有 500,000 个 uEV 的 20 µL PBS。
5. 按照表 1中所示加入已预先滴定的抗体。在 4 °C 下孵育过夜。
   注意：染色前，建议将抗体在 4 °C 下以最高速度离心至少 5 分钟，以防止形成聚集体。此处使用的抗体是 uEV 中存在的蛋白质的示例，属于目前正在撰写的独立论文内容。
6. 向 3 号试管中加入 0.4 µL 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）[5 nM]。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
   注意：CFSE 是一种用于染色样品中所有 EV 并在进行流式细胞术分析时区分背景噪声的染料。更多信息请参见讨论部分。
7. 向所有试管中加入 400 µL 冰冷的 1× PBS。
8. 将所有试管置于 4 °C 下保存。

3. 使用常规流式细胞仪获取尿液细胞外囊泡（uEVs）

注意：此处描述了流式细胞仪（见材料表）的使用说明。

1. 使用6峰和8峰微球对流式细胞仪进行质量校准。
   注：最后一个峰的%CV值必须低于6；此操作由流式细胞仪技术人员完成。
2. 打开流式细胞仪软件。
   注：软件打开后，将自动新建一个实验，显示一个包含96个样本模板的检测界面、运行参数设置区域，以及一个用于创建散点图或直方图的“空白”区域。
3. 调整运行中软件界面上的参数：设定采集样本体积为100 µL，流速设为慢速，FSC-H阈值设为10,000，SSC-H阈值设为2,000。
   注：此处推荐的阈值仅为示例；实际应根据所分析的样本设定合适的阈值。
4. 按照表1所示，加载1号管（Megamix微球管），采集微球信号。在软件界面的“空白”区域点击散点图选项，创建两个散点图，分别对应图3中的A和B面板。
   注：Megamix荧光微球（用于界定0.1、0.3、0.5和0.9 µm粒径大小并建立粒径模板的微球）可使用FL1（FITC）检测器进行分析。所有散点图和直方图均应以高度值（height）显示。尽可能记录更多事件；工作表中的任何修改均不会改变原始数据。

图3：Megamix FSC微球的点图。 点图由流式细胞仪软件生成；在流式细胞仪中，图像将非常相似。（A）生成的第一个点图用于选择微球，避免背景噪声（SSC-H 对 FL1-H）。（B）通过前一设门选择生成的点图，显示微球的不同尺寸（SSC-H 对 FSC-H）。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 在软件界面的“空白”区域，为每种使用的荧光染料创建点图和直方图；可参考补充图1中的算法示例。操作时，依次点击每种荧光染料对应的点图或直方图选项。
   注意：背景噪声始终存在，如图3A所示。FL1（x轴）0至1,000之间的所有点均位于所设门控区域之外。因此，必须使用所有对照管以获得准确结果。每次上样前，需反向冲洗鞘液并执行一次解堵循环。上样前应轻轻振荡每根试管。连续上样五根试管后，运行100 µL的1x PBS。
6. 上样第2号和第5号试管，以设定阴性阈值。操作时，选择点图下方的矩形门图标，或直方图下方的线形门图标，并将其放置在无信号区域，从而获得与补充图1中所示相似的点图和直方图。
   注意：这些试管中阳性区域的设定不得超过0.70%，因为荧光信号不应超过10³（1,500）。若该区域之外出现任何荧光信号，应稀释所用试剂。因此，在最终检测前对试剂进行滴定至关重要。
7. 上样第6号试管（自发荧光对照管），以设定样本的阴性区域。操作时，选择点图下方的矩形门图标，或直方图下方的线形门图标，并将其放置在无信号区域。
8. 依次上样后续试管（第7至第9号试管，见表1）。
9. 保存实验。
   注意：本实验所用流式细胞仪软件中的保存实验命令，意指保存生成的数据。换句话说，流式细胞仪所获取的所有试管及其各自产生的数据均需保存。为此，必须点击保存实验按钮。
10. 将数据导出为FSC文件格式。

4. 使用流式细胞仪软件分析数据。

注意：本节描述了材料表中所示流式细胞仪软件的使用说明。图4展示了创建尺寸门控的工作区步骤。

图 4：包含开始数据分析所有步骤的工作区界面。所有图像均通过工作区界面截图生成。（A）左侧为添加样本数据后生成的工作区界面，右侧为选择第1管FSC微球后生成的散点图。（B,C）显示坐标轴的修改过程，调整为SSC-H和FSC-H。（D-F）逐步展示两个坐标轴的自定义设置过程。（G-I）显示不同尺寸微球的选择与生成过程。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 打开流式细胞仪软件。通过点击 添加样本 按钮添加样本，并选择导出的 FCS 文件。
2. 点击 Megamix 管 以打开点图 SSC-H（y 轴）对 FSC-H（x 轴）。通过点击 T 按钮（变换数据显示），然后点击 自定义轴，再点击 SSC-H 或 FSSC-H，将坐标轴范围调整为最小值 0、最大值 100,000，以查看 0 到 100,000 的范围（见 图 4A-F）。
3. 在第 4.2 步生成的点图中，设置 0.1、0.3、0.5 和 0.9 µm 的门。选择 矩形门 按钮，创建如 图 4G-I 所示的门。
   注：图 5 显示了创建工作区的步骤，以创建阳性区域并获取荧光染料的平均荧光强度。

图 5：用于分析所获数据的工作区。 所有图像均通过工作区的屏幕截图生成。（A）对所有样本应用了尺寸门控后生成的工作区。（B）选择的自发荧光样本管，点图显示尺寸门控，以及某一选定尺寸（0.1 µm）的直方图，使用该直方图确定每种荧光染料和尺寸的阳性门控。（C）针对每种荧光染料和尺寸设置阳性门控后生成的工作区。（D）为样本生成的工作区（左侧）和布局编辑器（右侧）。在布局编辑器中显示了自发荧光管和阳性管在 FL1-H 通道的直方图，以及如何调出属性面板对其进行修改。（E）该图像展示如何获取平均荧光强度值。（F）为三种不同荧光染料生成的直方图，显示软件允许对统计信息进行的各种调整。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 将生成的门控（0.1、0.3、0.5 和 0.9 µm）应用于所有样本。选择 门控，拖放到 所有样本 选项中，如 图 5A 所示。
5. 点击 自发荧光管。针对每种荧光染料和每个粒径设置阳性区域。打开粒径门控的散点图 SSC-H 对 FSC-H，点击 单一粒径门控。在新窗口中，点击 y 轴 以选择直方图选项。在 x 轴 上选择 FL1-H，然后选择 范围 图标以创建阳性区域。对 FL2-H 和 FL4-H 重复此操作（见 图 5B）。
6. 将门控应用于所有样本。选择 门控，拖放到 所有样本 选项中，如 图 5C 所示。
7. 打开布局编辑器。
8. 将每个样本拖放到编辑器中。选择“自发荧光”管的粒径，拖放，然后选择染色管的相同粒径，拖放。
9. 点击直方图右下角。打开 属性 菜单。点击 图例。添加荧光染料的平均荧光强度。
   注：在 属性 中，还有其他可用工具用于修改直方图的外观。
10. 对剩余的荧光染料和粒径重复相同步骤。

5. 分析以获得每份样本中尿液细胞外囊泡（uEVs）的数量。

注意：图6 显示了获取每个样本中uEV数量的操作步骤工作区。

图6：CFSE样品管的分析工作区。所有图像均通过工作区的屏幕截图生成。（A）通过选择所有尺寸区域生成的工作区，左侧为总uEVs区域，右侧为显示所选门控的点图。（B）自体荧光管中CFSE阴性区域的SSC-H与FL1-H点图。（C）染色管中CFSE的SSC-H与FL1-H点图。（D）CFSE染色统计结果所得表格图像，显示样本中uEVs的数量。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 点击自发荧光管。在散点图SSC-H与FSC-H中结合尺寸门控，创建一个包含所有尺寸的区域。点击新建区域。设定阳性区域（见图6A,B）。
2. 将门控应用于所有样本。选择门控区域，拖动并放置到所有样本选项中。
3. 点击CFSE + uEVs管。打开新区域，并验证CFSE（FL1-H）的阳性区域，如图6C所示。
4. 在图6D的工作区中，复制该管的细胞数量数据。此数值即通过流式细胞术获得的uEV数量（#uEVs FC）。
5. 应用以下公式计算每微升中的uEV数量：
   
6. 若要获得每种荧光染料对应的每微升uEV数量（#uEVs/µL FLX），在工作区中复制FLX-H亚群的统计数值，该数值即为该亚群的百分比（%FLX subset）。
7. 应用以下公式计算每种荧光染料对应的每微升uEV数量。
   
   注意：根据所选门控是针对单一尺寸还是全部uEVs，请核实所选数据。

结果

在整个实验流程中存在多个检查点，均位于uEVs染色之前。因此，首先必须验证uEVs提取物中所含蛋白质的量。所有从事细胞外囊泡研究的科研团队均会对蛋白质进行定量，具体操作如步骤2.1所述。补充图2展示了一块典型的96孔板，其中4E、5E和6E孔含有uEVs组分。1A、2A和3A孔为空白对照，但如果未纯化到uEVs，则这些孔的颜色将与样品孔相近。

此步骤之后，需要验证uEVs的存在。补充图3展示了一块聚丙烯酰胺凝胶的代表性结果，该凝胶经考马斯亮蓝染色，用于显示所收集各组分中的蛋白质含量，并与其他分离uEVs的方法进行比较。在两种不同的还原剂——二硫苏糖醇（DTT）和β-巯基乙醇中，后者显示出更高的蛋白质得率。

另一个重要步骤是使用MISEV2018推荐的任一方法验证uEVs的存在。补充图4展示了在uEVs以及作为阴性对照的收集组分中，CD63和CD9等多种蛋白质富集的代表性结果。在uEVs组分中，未见这些蛋白质的明显条带，表明未实...

讨论

如今，细胞外囊泡作为多种疾病的生物标志物的应用日益增多，尤其是那些可从尿液等非侵入性来源分离的囊泡^{5,21,22,23,24}。已有研究证实，尿液细胞外囊泡（uEVs）的分离对于了解健康个体的生理状态，以及多种疾病患者的诊断和预后评估具有重要意义^{6,13,16,25,26,27}。本实验方案展示了如何获取uEVs，并通过流式细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 抗人 CD156c（ADAM10）抗体	BioLegend	352706	加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升数
APC抗人TSPAN33（BAAM）抗体	BioLegend	395406	加入5 µL 至 20 µPBS 中的 uEVs 升数
Avanti 离心机配备 JA-25.5O 固定角转子	Beckman Coulter	J-26S XPI
BD Accuri C6 流式细胞仪	BD 生物科学
β-巯基乙醇	SIGMA-Aldrich	M3148
台式离心机配备 A-4-44 转子	Eppendorf	5804
BLUEstain 2 蛋白 Marker	GOLDBIO	P008
CD9 (C-4) 小鼠单克隆抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118
CD63（MX-49.129.5）小鼠单克隆抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-5275
流式细胞术细胞增殖示踪CFSE试剂盒	赛默飞世尔科技	C34554
Chemidoc XRS+ 系统	伯乐（BIORAD）	5837
FITC 抗人 CD9 抗体	BioLegend	312104	加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升数
FITC 抗人 CD37 抗体	BioLegend	356304	加入5 µL 到 20 µPBS 中的 uEVs 升（L）
荧光黄色颗粒	Spherotech	FP-0252-2
荧光黄色颗粒	Spherotech	FP-0552-2
荧光黄色颗粒	Spherotech	FP-1552-2
FlowJo 软件	Becton, Dickinson and Company
山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP	Dako	P0447
蛋白酶抑制剂混合物停止液	赛默飞世尔科技	78429
Immun-Blot PVDF 膜 0.22µm	BIORAD	1620177
Megamix-Plus FSC 微球	COSMO BIO CO.LTD	7802
NuPAGE LDS 样品缓冲液 4X	赛默飞世尔科技	NP0007
Optima 超速离心机，配备 90Ti 固定角转子 355530	贝克曼库尔特	XPN100
PageBlue 蛋白染色液	赛默飞世尔科技	24620
PE 抗人 CD53 抗体	BioLegend	325406	加入5 µL20 µPBS 中的 uEVs 升数
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23227
Pierce RIPA 裂解液	赛默飞世尔科技	89900
聚碳酸酯厚壁离心管	贝克曼库尔特	355630
Spherotech 8峰校准微球（FL1-FL3）	BD Accuri	653144
Spherotech 6峰校准微球（FL4）	BD Accuri	653145
蔗糖	SIGMA-Aldrich	59378
三乙醇胺	SIGMA-Aldrich	90279