三维脂肪细胞培养作为研究恶病质诱导的白色脂肪组织重塑的模型

摘要

本方案描述了一种三维（3D）磁性打印培养系统，可用于研究癌细胞条件培养基诱导的白色脂肪组织（WAT）重塑过程。利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的UCP1+脂肪细胞的三维培养系统，可研究米色脂肪细胞在脂肪组织重塑中的作用。

摘要

癌症恶病质（cancer cachexia, CC）是一种具有多种表现形式的综合征，可导致明显的多器官代谢失衡。近年来研究表明，恶病质性消耗可能由多种炎性介质所驱动，这些介质可能破坏脂肪组织及其他组织（如脑和肌肉）之间的整合生理功能。在此情况下，肿瘤得以以宿主为代价而存活。近期的临床研究发现，不同脂肪沉积部位消耗程度的加剧与患者生存预后呈负相关。研究还表明，多种代谢紊乱可改变白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）的重塑过程，尤其是在恶病质发展的早期阶段。由组织重塑引起的WAT功能障碍是整体恶病质的重要促成因素，其中WAT的主要改变包括形态与功能变化、脂肪细胞脂解作用增强、免疫细胞积聚、脂肪生成减少、前体细胞群体改变以及 beige/brown样表型的增加 "生态位" 含有米色/褐色脂肪细胞。

为了研究恶病质诱导的白色脂肪组织重塑的各个方面，特别是其变化 前体细胞和米色重塑研究中，二维（2D）培养一直是体外研究的首选方法。然而，该方法无法充分概括白色脂肪组织（WAT）的复杂性。为重建功能性脂肪组织（AT），需要改进的检测方法 离体 有助于理解不同细胞群体之间的生理相互作用。本方案描述了一种基于磁性纳米颗粒的高效三维（3D）打印组织培养系统。该方案针对恶病质诱导因子（CIFs）引起的白色脂肪组织（WAT）重塑研究进行了优化。结果表明，三维培养是体外研究WAT建模的合适工具，可用于功能性筛选，以鉴定针对特定脂肪细胞群体的生物活性分子，并有助于发现基于WAT细胞的抗恶病质疗法。

引言

生物体由处于三维微环境中的细胞构成，细胞之间以及细胞与基质之间存在相互作用，并具有复杂的营养物质和细胞运输动力学^1,2。然而，目前细胞生物学领域获得的大部分基础知识均来源于单层细胞培养（二维培养）。尽管二维培养能够回答某些机制性问题，但该方法无法充分模拟细胞所处的天然环境，可能难以准确预测复杂的药物反应¹。此外，细胞通过机械转导感知其物理环境。事实上，机械力会被转化为生化信号，最终影响基因表达模式和细胞命运。在过去的几十年中，三维组织培养作为一种新的体外工具应运而生，能够更真实地模拟体内微环境，从而避免二维体外培养方法带来的一些机制性缺陷³。

癌症恶病质（CC）被定义为一种具有多种表现的综合征，可导致显著的多器官代谢失衡。在恶病质发展过程中，白色脂肪组织（WAT）会发生多种形态学改变，导致脂肪细胞脂解作用增强、免疫细胞积聚、脂肪生成减少、 前体细胞群体发生变化，以及含有米色/亮色细胞（米色样重塑）的“生态位”"niches"数量增加⁴。然而，利用体外模型重现恶病质影响WAT重塑的机制仍面临重大的技术挑战。事实上，少数尝试研究肿瘤与组织间通讯的研究采用了单层体外细胞培养（2D），从而规避了WAT三维微环境的复杂性。

尽管已有多种实验方法 可生成三维培养物，但目前生成脂肪球体（adipospheroids）主要采用三种不同的组装方法：磁力悬浮或打印⁵、悬滴法⁶以及Matrigel支架系统⁷。尽管这些系统均适用于脂肪球体的构建，但各自具有优缺点，应根据 每个实验设计的具体特征进行选择。基于上述局限性，本研究采用磁力打印法构建三维细胞培养模型⁵。该方法利用由金纳米颗粒和氧化铁组成的磁性纳米颗粒组装体系，使打印技术适用于大多数细胞类型。本实验中，采用三维细胞培养诱导脂肪生成，并利用CIFs模拟CC的 微环境条件。

方案

1. 二维细胞与磁性纳米颗粒的孵育

1. 采用标准细胞培养方法，将贴壁的二维培养物培养至约 70% 汇合度。
2. 准备磁性纳米颗粒复合物：将其从冰箱中取出，在室温（20–25 °C）下静置约 15 分钟，使其恢复至室温¹。
3. 混合培养基：将磁性纳米颗粒直接加入 100 mm 细胞培养皿中的 12 mL 培养基中。反复吹打混匀数次，以确保纳米颗粒均匀分散。
   注意：由于氧化铁呈棕色，培养基会呈现深色。建议使用浓度为 2.5 µL/cm² 培养面积。
4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 100 mm 二维培养皿三次。
5. 向 100 mm 细胞培养皿中加入 12 mL 步骤 1.3 中的混合培养基。将培养皿置于培养箱中孵育过夜（37 °C，5% CO₂），以使磁性纳米颗粒与细胞充分结合。

2. 在96孔板中通过球状体组装构建3D培养

1. 过夜孵育后，用 PBS 轻柔振荡培养板 3 次，每次 10 mL，以洗去残留的培养基和未结合的磁性纳米颗粒。
2. 吸除培养皿中的 PBS，并加入 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，在 37 °C 下孵育 2–5 分钟，使细胞脱落。
3. 在等待细胞脱落的同时，用 70% 乙醇对磁力驱动装置进行消毒¹。
4. 细胞脱落后，加入含血清的培养基，体积为胰蛋白酶-EDTA 溶液体积的 4 倍，以中和胰蛋白酶的活性，然后将细胞悬液转移至锥形管中。
5. 将悬液在 500 × g 条件下离心 10 分钟。小心吸除上清液，避免触碰沉淀。
   注意：离心后，细胞应呈棕色，悬浮于培养基中的细胞悬液颜色应比正常更深。细胞中应可见散布的纳米颗粒¹。
6. 对悬液中的细胞进行计数 ，并计算制备 3D 培养所需的培养基体积。对于脂肪类球体，建议在 96 孔板中每孔使用 5,000 至 10,000 个细胞，总体积为 150 µL。
7. 使用 96 孔生物打印试剂盒，将一块抗细胞黏附的 96 孔板置于类球体驱动装置（Spheroid Drive）上方。
8. 将 150 µL 细胞悬液移入 96 孔板的每个孔中 ，盖上盖子，使细胞在磁场作用下于孔底聚集形成类球体结构。
9. 将该板置于培养箱中的类球体 驱动装置上孵育 1–2 小时，以形成结构完整的类球体。
   注意：这些培养物应呈现致密且呈棕色，并在板内完成打印（图 S1）。图 S2 展示了在 96 孔板中进行类球体组装的 3D 磁性打印主要步骤的流程示意图。

3. 白色脂肪生成诱导

1. 准备维持培养基和诱导培养基⁸；每次使用前新鲜配制诱导培养基。
   1. 配制含有5 µg/mL胰岛素（10 mg/mL母液，4 °C保存一周）和0.5 µM罗格列酮（10 mM二甲基亚砜（DMSO）母液）的维持培养基。
   2. 配制含有125 µM吲哚美辛（0.125 M乙醇母液）、2 µg/mL地塞米松（2 mg/mL乙醇母液）、0.5 mM异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（0.25 M DMSO母液）和0.5 µM罗格列酮（10 mM DMSO母液）的诱导培养基。
      注意：将吲哚美辛加热至60 °C以助溶解。
2. 在打印类球体后24–48小时，将常规完全培养基更换为诱导培养基（第0天）。
3. 48小时后（第2天），将诱导培养基更换为维持培养基。
4. 每3–5天更换一次培养基，直至细胞完全分化。
   ​注意：通常在使用诱导培养基刺激7–8天后，细胞分化为成熟的脂肪细胞，胞内充满脂滴，可在脂肪类球体边缘观察到。

4. 小鼠路易斯肺癌条件培养基（LLC-CM）的制备

1. 在100 mm细胞培养皿中，以6000个细胞/cm²的密度，将LL/2 Lewis肺癌细胞接种于生长培养基中².
   注意：培养基含有含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 2天后，将每块培养板中的培养基更换为新鲜的生长培养基。
   注意：LL/2 细胞包含贴壁细胞（数量较多）和悬浮细胞的混合群体。
3. 2天后（第4天），收集条件培养基，通过离心（500 × g）去除细胞和碎片 g，10 分钟）。
4. 将条件培养基分装后于液氮中冷冻，以备后续使用。
   注意：为了 处理 使用75%新鲜培养基与25%LLC条件培养基的混合液培养类球体。

结果

来自基质血管组分（SVF）细胞三维培养的脂肪球体
使用来自同一只小鼠腹股沟白色脂肪组织（WAT）制备物的相同数量的SVF细胞，分别建立三维（3D）和汇合的二维（2D）培养体系（图1A，图1B），并采用相同的实验方案比较基因表达标志物。用诱导培养基刺激后，球体随时间逐渐扩张。图2B显示二维多房细胞密度增加，表明其向成熟脂肪细胞分化。定量分析脂肪球体体积发现，在成脂诱导开始后10天，其体积显著增加（约1倍），而在非分化生长培养基（DMEM 2%）中培养的球体则未见扩张（图1B（3D-WHITE），图1C）。随后，比较了脂肪球体与二维培养体系中的基因表达。在二维和三维培养体系中均检测到成熟脂肪细胞标志物基因（如Adipoq和...

讨论

本方案建立了一种三维细胞培养系统，用于研究源自白色脂肪组织（WAT）原代基质血管组分（SVF）细胞的脂肪球中脂肪细胞的分化过程。与传统的二维贴壁培养相比，该三维系统更有利于脂肪组织（AT）的重塑，其条件更接近体内环境。近年来的研究表明，与二维培养系统相比，三维培养可导致细胞形态和信号传导的显著差异³。成纤维细胞在三维环境中的形态与二维条件下明显不同¹⁴。在乳腺上皮细胞中，三维培养可诱导组织特异性的分化¹⁵。对于乳腺癌细胞多细胞耐药性的研究，只有在三维培养的细胞中进行分析才具有高效性，而使用传统二维培养进行评估则效果较差¹⁶。 

恶病质是一种非常复杂的综合征，用于机制研究的体外模型十分有限。Lopes 等人¹²在共培养系统中表明，LLC 会损害脂肪生成，表现为体外培养的 3T3-L1 细胞中脂滴体积减小。本研究显示，在 2D 和 3D 培...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	细胞培养
96孔生物打印试剂盒，黑色	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	细胞培养
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 片段 驴抗兔 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	免疫荧光染色，二抗，TBS 缓冲液含 0.1% Tween-20 中 1:400 稀释
细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，平底，µCLEAR，黑色，CELLSTAR，抗细胞粘附表面，带盖，无菌，8 个/袋	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	细胞培养
地塞米松	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	细胞培养
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	细胞培养
胎牛血清 (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	细胞培养
吲哚美辛	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	细胞培养
胰岛素	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	细胞培养
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	小鼠 Lewis 肺癌细胞系
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	细胞培养
NucBlue 固定细胞即用型试剂 (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	免疫荧光染色，按制造商说明书操作
青霉素-链霉素	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	细胞培养
Perilipin-1 (D1D8) XP 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	免疫荧光染色，一抗，TBS 缓冲液含 0.1% Tween-20 中 1:1000 稀释
罗格列酮	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	细胞培养
胰蛋白酶-EDTA，0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	细胞培养
逆转录 PCR 引物
引物	正向	反向
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
小鼠基因分型
引物名称	描述	序列
Cre F	通用 Cre 正向引物	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	通用 Cre 反向引物	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG 正向引物	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG 野生型反向引物	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG 突变型反向引物	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 突变型正向引物	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 突变型反向引物	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 野生型正向引物	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 野生型反向引物	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C