利用高内涵成像分析评估心脏重编程

摘要

我们介绍一种利用高内涵成像分析技术在体外直接定量诱导心肌样细胞（iCMs）的实验方案。该方法可自动化地定量心脏重编程效率，并实现对iCMs的直接可视化观察。

摘要

本实验方案旨在描述一种用于定量诱导性心肌细胞样细胞（iCMs）的方法，这些细胞通过重编程技术在体外直接重编程获得。心脏重编程提供了一种生成新心肌细胞的策略。通过将核心心源性转录因子导入成纤维细胞，可将成纤维细胞直接转化为iCMs，而无需经过多能干细胞状态。然而，成纤维细胞向iCMs的转化效率仍然较低。因此，已有大量研究尝试通过多种附加手段来提高心脏重编程效率。多数研究采用流式细胞术评估心脏重编程效率，同时结合免疫细胞化学染色以可视化iCMs。因此，通常需要至少两组独立的重编程实验才能充分验证iCM重编程的成功。相比之下，自动化高内涵成像分析可在细胞数量相对较少的情况下，同时实现对iCM重编程的定量与定性分析。利用该方法，仅需一次重编程实验即可直接评估iCM的数量与质量。该策略将有助于推动未来需要大规模重编程实验的心脏重编程研究，例如筛选可提高重编程效率的遗传或药理学因子。此外，高内涵成像分析方法的应用不仅限于心脏重编程，还可广泛应用于其他细胞谱系的重编程研究，以及任何需要对免疫染色细胞进行定量与可视化分析的实验。

引言

心脏重编程作为一种替代方法，被开发用于生成新的心肌细胞，以替代基于干细胞的方法。由于该方法不经过干细胞状态，因此有望克服基于干细胞的方法中存在的一些固有局限性。已有研究表明，通过病毒将至少三个或四个心脏发生相关的转录因子导入成纤维细胞，可消除成纤维细胞的基因表达程序，并在成纤维细胞中重建心脏发生相关的转录调控网络，从而将成纤维细胞转化为具有心脏细胞命运的细胞^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}。

自从首项里程碑式的研究在体外证明了心脏重编程以来¹，众多研究已对心脏重编程方案进行了优化^{3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18}。在心脏重编程后，评估成纤维细胞中心脏表型的常用技术方法包括：通过流式细胞术定量表达特异性心肌细胞标志物的细胞，以及通过免疫细胞化学在单细胞水平上对这些细胞进行可视化观察。尽管这两项实验（即流式细胞术和免疫细胞化学）均使用相同的抗体来检测心肌细胞标志物的表达，但必须分别进行。此外，流式细胞术需要相对更多的细胞，从而增加了实验所需的试剂用量。另一种方法是在免疫细胞化学染色后通过人工计数来定量心肌细胞标志物阳性细胞，但这种方法劳动强度大，且准确性通常较低。

本实验方案旨在描述一种通过单次免疫染色结合自动化高内涵成像分析来定量和可视化诱导心肌细胞（iCMs）的方法。由于该方案在24孔板的单个孔中进行，所需起始细胞数量相对较少。可同时使用多达三种不同的标记物，并可对单阳性、双阳性和三阳性细胞进行自动定量。除了对免疫染色细胞进行定量外，高内涵成像分析还能提供高质量的2-100倍物镜图像。如有需要，用于高内涵成像分析的同一批免疫染色细胞可重复用于进一步的成像研究，例如共聚焦显微镜观察。本方案的主要优势在于，不仅能够以更少的细胞数量实现对iCMs的无偏定量，还能实现iCMs的可视化。此外，该方案还可用于评估非心肌谱系重编程（如iPSC、神经元和肝细胞重编程）的效果。

方案

所有动物实验程序均经范德堡大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准。

1. 逆转录病毒的制备与体外心脏重编程

1. 将Platinum E细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素、1 µg/mL嘌呤霉素和10 µg/mL杀稻瘟菌素的DMEM培养基中培养，直至细胞融合度达到70%–80%。
2. 第1天，在首次转染前一天，将约0.55 × 10⁶个细胞（第一孔）和约0.18 × 10⁶个细胞（第二孔）分别接种至12孔板的两个独立孔中，每孔加入1 mL添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。
   注意：可根据实验所需病毒液的量使用不同规格的培养皿。其他实验规模请参见表1。
3. 第2天，将先前研究中描述的编码Mef2c、Gata4、Tbx5和Hand2的四顺反子M-G-T-H逆转录病毒载体⁹或空载体转染至第一孔的Platinum E细胞中。将3 µL转染试剂加入30 µL低血清培养基中，5分钟后，将1 µg逆转录病毒载体或空载体加入转染试剂与低血清培养基的混合物中。室温孵育20分钟后，将混合物加入Platinum E细胞中。
4. 第3天，转染后16–20小时，弃去培养基，并更换为新鲜的添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。
5. 第3天，在首次转染后24小时，对第1天接种Platinum E细胞的第二孔进行第二次转染，操作同步骤1.3）。
6. 第3天，将约5 × 10⁴个来自Titin-GFP报告基因敲入小鼠¹⁹的冻存小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种至24孔板的一个孔中。共需两个24孔板孔（即未感染对照组和M-G-T-H感染组）。
   注意：由于冻存MEFs的复苏率可能因细胞冻存条件不同而有所差异，接种的MEFs数量可能需要调整。接种后一天细胞融合度约为10%时适合进行重编程。使用新鲜未冻存的MEFs可提高重编程效率。
7. 第4天，第二次转染后16–20小时，弃去培养基，并更换为新鲜的添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。
8. 第4天，在首次转染后48小时，使用5 mL注射器收集Platinum E细胞第一孔中的病毒液，并通过0.45 µm聚醚砜（PES）膜滤器过滤。弃去MEFs的成纤维细胞生长培养基，更换为添加了6 µg/mL聚凝胺的病毒液（第一次感染）。
9. 第5天，在第二次转染后48小时，使用第二孔的病毒液按照步骤1.8）进行第二次感染。
10. 第6天，在第二次感染后24小时，将病毒液更换为心肌诱导培养基，该培养基由DMEM/199（4:1）、10% FBS、5%马血清、1%青霉素/链霉素、1%非必需氨基酸、1%必需氨基酸、1% B-27、1%胰岛素-硒-转铁蛋白、1%维生素混合物、1%丙酮酸钠、1 µM SB431542和0.5 µM A83-01组成。每三天更换一次心肌诱导培养基，直至细胞收获。

2. 免疫染色

1. 感染后14–15天，用2%多聚甲醛在24孔板上固定细胞，孵育15分钟。
2. 使用通透缓冲液（含0.05% Triton-X的PBS）对固定后的细胞进行通透处理，每5分钟用通透缓冲液洗涤细胞一次，共洗涤三次。
3. 加入通用封闭缓冲液，室温孵育45分钟。
4. 加入小鼠抗α-肌动蛋白抗体（1:400稀释）和鸡抗GFP抗体（1:400稀释），室温孵育1.5小时。
   注意：约150 µL抗体溶液即可覆盖24孔板一个孔的整个表面。
5. 用通透缓冲液洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤三次。
6. 加入Alexa-555标记的抗小鼠二抗和Alexa-488标记的抗鸡二抗（1:400稀释），室温孵育1小时。
7. 用通透缓冲液洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤三次。
8. 将2.5 µL DAPI溶液加入250 µL通透缓冲液中。

3. 高内涵成像

1. 打开成像系统。
2. 启动配套软件。
3. 登录系统。
4. 在任务栏中，选择 Run a Plate。
5. 点击 Open Door-Eject Plate 以打开仪器门，将培养板放入，并确保板的方向正确。然后点击 Close Door-Load Plate 关闭仪器门。
6. 点击 Load Plate Settings，选择一个模板实验方案，然后点击 Load From DB。
7. 点击 Acquisition Setup。
8. 在 Plate Acquisition Setup 对话框中，点击 Configure。
9. 在 Objective and Camera 选项卡中，选择 10x 物镜。
10. 在 Plate 选项卡中，选择 24 孔板。
11. 在 Sites to Visit 选项卡的 Site Options 中，选择"Fixed number of sites"，通过设定行列数量来确定成像位点数。选择列数为 6、行数为 6，共使用 36 个成像位点。在 Spacing 中设置每个成像位点之间的间距（例如 500 μm）。
12. 在 Acquisition 选项卡中，将波长数量设置为 3。
13. 在 Wavelengths 选项卡的 Illumination 设置中，分别为每个波长选择 DAPI、FITC 或 Texas Red 。
14. 点击 Run 选项卡，然后为该板设置"Folder Name" 和 "Plate Name"。 在板图上点击需要成像的孔位，然后点击 Calculate，为每个波长设置焦距偏移。首先为 DAPI 设置焦距偏移。点击 Auto Expose，自动设置每个波长的曝光时间。最后点击 Acquire Plate，开始对选定的位点进行成像。

4. 高内涵成像分析

1. 完成高内涵成像后，点击 Screening 菜单，选择 Review Plate Data 以选择待分析的孔板。
2. 点击 Select Plate。在 Select Plate for Review 对话框中，打开文件夹并选择保存在数据库中的孔板，然后点击 Select。
   注意：为显示图像，请在 Wavelengths 字段中选择 DAPI、FITC 和 Texas Red；在 Sites 字段中选择 All Sites。在选定的36个位点中点击任意一个位点，即可在各波长图像窗口中显示该位点图像，然后点击 Look-Up Table 为对应波长选择颜色。使用键盘上的 Print Screen 键截屏，并将图像粘贴至图像编辑软件（例如 Paint 或 Photoshop）中保存。
3. 点击 Run Analysis，然后选择一个模板设置。
4. 点击 Configure Settings，然后点击 Number of Wavelengths。选择三个波长（即：DAPI 用于细胞核染色，Texas Red 用于 α-actinin，FITC 用于 Titin-GFP）。
5. 使用工具栏中的 Line 工具，测量细胞短轴方向的宽度。根据所测得的细胞宽度，设置“Approximate min width”和“Approximate max width”，以包含所选成像位点中的大多数细胞。
6. 点击 Preview 检查是否几乎所有细胞核均被选中。被选中的细胞核呈白色，未被选中的细胞核保持蓝色（DAPI 染色）。如有必要，调整“Approximate min width”和“Approximate max width”参数。
7. 为设置 Intensity Above Local Background，将鼠标指针置于细胞内部和外部区域，窗口底部将显示强度值。略微降低弱信号细胞的强度，使每个细胞整个区域内的信号强度呈现均匀分布。将此强度值定义为 Intensity Above Local Background 值。该值需为每个通道单独设置。
8. 点击 Screening 菜单，选择 Plate Data Utilities。在 Plate Data Utilities 对话框中，点击 Run Analysis 以选择待分析的孔板。
9. 在 Settings 字段中，选择已保存的分析设置；选择 Add to Auto Run List，然后点击 OK 开始运行分析。
10. 分析完成后，点击 Screening 菜单并选择 Plate Data Utilities。随后在 Plate Data Utilities 对话框中点击 Export Measurements 导出分析结果。
11. 点击 Cell and Image Measurements，然后点击 OK。
12. 在 Export Measurements Wizard - Step 1 页面中，选择孔板并点击 Next。
13. 在 Export Measurements Wizard - Step 2 页面中，点击 Finish。
14. 在 Configure Data Export 页面中，选择所需的数据类型（即：孔名称、总细胞数、DAPI⁺ 细胞亚群数、Texas Red⁺ 细胞亚群数、FITC⁺ 细胞亚群数、DAPI⁺Texas Red⁺ 细胞亚群数、DAPI⁺FITC⁺ 细胞亚群数、DAPI⁺FITC⁺Texas Red⁺ 细胞亚群数、DAPI⁺ 细胞百分比、DAPI⁺Texas Red⁺ 细胞百分比、DAPI⁺FITC⁺ 细胞百分比，以及 DAPI⁺Texas Red⁺FITC⁺ 细胞百分比），然后点击 OK。
15. 在 Export as text file 页面中，选择文件保存路径并点击 OK。
16. 在 Microsoft Excel 中打开该文件。结果将以每个位点为单位呈现（表 2）。每孔包含 36 个位点。使用分析工具 Pivot Table 汇总 36 个位点的数据（即：细胞总数之和，以及指定细胞百分比在全部 36 个位点中的平均值）（表 3）。

结果

重编程实验后，我们采用上述高内涵成像分析方法对诱导心肌样细胞（iCMs）进行定量。用于高内涵成像分析的36个成像位点的复合图像见图1。在本实验中，iCMs定义为双阳性细胞（α-肌动蛋白⁺Titin-eGFP⁺）。高内涵成像分析显示，在M-G-T-H转导后约26%的细胞表达两种心脏标志物，而空载体转导的对照组细胞中仅约1%出现双阳性细胞。单个iCMs在高内涵成像系统拍摄的10倍镜图像中可见（图2）。

...

讨论

先前的重编程研究通过流式细胞术评估重编程效率，并在两个独立实验中使用免疫细胞化学方法评估iCMs的结构质量。流式细胞术分析需要大量的起始细胞，从而增加了实验规模。相比之下，高内涵成像分析仅需相对少量的细胞，即可通过单次实验同时评估iCM重编程的质量与数量。因此，这一新方法可为未来的重编程研究提供一个高效的新型技术平台。特别是，该新方法将有助于用于筛选新的遗传或药理学因子的重编程实验。在测试大量因子时，分析体系可缩小至384孔板格式。

转导效率与重编程效率直接相关。在之前的研究中，我们已证明，确保所有重编程因子均在成纤维细胞中表达，对于实现高效的重编程至关重要^8,9。由于通过分别转导单个病毒载体时，仅有相对较少数量的成纤维细胞能够表达全部重编程因子，因此使用携带所有重编程因子的单个多顺反子载体有助于提高重编程效率^7,9。此外，为了提高转导效率，我们对P...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A83-01	Tocris	2939
抗鸡 Alexa 488	Thermofisher	A11039
抗 GFP 抗体	Invitrogen	A10262
抗小鼠 Alexa 555	Thermofisher	A21422
抗-α-肌动蛋白抗体	Sigma	A7811
DAPI 溶液	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
胰岛素-转铁蛋白-硒G添加剂	Invitrogen	41400-045
199 培养基	Invitrogen	11150059
MEM 维生素溶液	Invitrogen	11120-052
MetaXpress 软件	Molecular device
Micro XL 全自动细胞成像系统	Molecular device
最低必需氨基酸溶液	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES 滤膜 (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E 细胞	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
通用封闭缓冲液	BiogeneX	HK083-50K