一种高效、全面的小鼠骨髓来源巨噬细胞分离、培养、极化及糖酵解特性表征实验方案

摘要

本方案提供了从骨髓中分离、培养、极化以及测定活骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）糖酵解代谢状态的详细且全面的方法。本文通过逐步操作说明并结合真实直观的图示，展示了BMDMs工作流程及实时糖酵解评估的具体实施过程。

摘要

巨噬细胞是最重要的一类抗原呈递细胞。目前已鉴定出多种具有独特代谢特征的巨噬细胞亚群。巨噬细胞通常被分为M1样（促炎性）和M2样（抗炎性）两种亚型。M1样巨噬细胞为促炎性巨噬细胞，可被LPS和/或促炎性细胞因子（如INF-γ、IL-12）激活。 & IL-2。M1样极化巨噬细胞通过介导宿主对多种细菌和病毒的防御反应，参与多种疾病的发生发展。因此，研究脂多糖（LPS）诱导的M1样巨噬细胞及其在炎症性疾病中的代谢状态具有重要意义。M2样巨噬细胞被认为是具有抗炎作用的巨噬细胞，可被抗炎性细胞因子和刺激物激活。在促炎状态下，巨噬细胞的糖酵解功能增强。目前，利用细胞外通量（XF）分析仪，研究人员已积极开展了关于糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备、代偿性糖酵解以及非糖酵解性酸化的功能研究。

本文演示了在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）进行呼吸、消耗和产生能量时，如何通过简单易行的步骤实时评估其糖酵解状态。本方案利用特定的糖酵解抑制剂和激活剂，展示了如何系统、全面地观察细胞内的糖酵解代谢过程，并获得更准确、更接近生理状态的结果。为了能够同时测量多种糖酵解表型，我们提供了一种简便、灵敏的基于DNA的归一化方法，用于评估BMDMs的极化状态。BMDMs的培养、激活/极化以及表型和代谢状态的鉴定，是研究多种不同类型疾病的关键技术。

在本研究中，我们分别使用脂多糖（LPS）和白细胞介素4（IL4）将初始M0型巨噬细胞极化为M1样和M2样巨噬细胞，并利用细胞外通量分析结合糖酵解激活剂与抑制剂，对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的多种糖酵解参数进行了实时、纵向的全面测定。

引言

巨噬细胞是先天免疫系统中最关键的细胞之一，具有M1样表型。它们参与清除感染性疾病、吞噬作用、抗原呈递以及炎症调控²。此外，巨噬细胞通过释放多种细胞因子来调节其他免疫细胞的功能³。巨噬细胞存在广泛的表型谱系⁴。根据所接触的信号不同，巨噬细胞会极化为不同的炎症和代谢状态⁵。在不同疾病中，巨噬细胞表现出不同的代谢改变，具体取决于其所在的组织环境⁶。极化的巨噬细胞能够重编程或切换其糖酵解代谢、脂质代谢、氨基酸代谢以及线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）过程^7,8。经典活化的M1样巨噬细胞和替代性活化的M2样巨噬细胞是目前研究最多的两种巨噬细胞表型³。未活化的静息状态巨噬细胞被称为M0巨噬细胞。通过用细菌脂多糖（LPS）刺激未经处理的骨髓来源巨噬细胞（BMDM），可诱导M0巨噬细胞向M1样表型极化⁹。在存在炎症细胞因子、干扰素-γ（IFN γ）或肿瘤坏死因子（TNF）的情况下，PI3K-AKT-mTOR-HIF1a信号通路可在巨噬细胞中被激活¹⁰。M1样巨噬细胞表现出糖酵解代谢水平升高、氧化磷酸化（OXPHOS）水平降低，并产生参与感染性和炎症性疾病的炎症细胞因子⁸。另一方面，白细胞介素（IL）-4可通过JAK-STAT、PPAR和AMPK通路，或IL-13及TGFβ通路诱导巨噬细胞向M2样表型极化^11,12。

与M1样巨噬细胞相比，M2样巨噬细胞的糖酵解水平降低，而氧化磷酸化（OXPHOS）增强，参与抗寄生虫反应及组织修复过程^8,13。骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）是研究巨噬细胞的常用体系，由骨髓干细胞分化而来。糖酵解和氧化磷酸化是细胞内两种主要的能量生成途径¹⁴。根据其所处的微环境，BMDMs可选择利用其中一种途径，在某些情况下也可在两种途径之间转换，或同时使用两种途径¹⁴。本研究聚焦于活化的促炎性巨噬细胞中的糖酵解代谢。当细胞质中的葡萄糖转化为丙酮酸，进而生成乳酸时，细胞会向培养基中释放质子，导致M1样细胞周围环境的酸化速率升高⁵。我们采用细胞外通量分析仪检测细胞培养基的酸化速率。结果以细胞外酸化速率（ECAR）或质子外排速率表示。

一种优化的、快速简便的方法用于检测极化巨噬细胞中的糖酵解水平，对于确定糖酵解表型、代谢物变化以及抑制剂/激活剂和药物对极化巨噬细胞的影响至关重要。本文所述方法已优化，可提供有关特定糖酵解参数（糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备及非糖酵解性酸化）以及糖酵解代谢重编程的信息。本研究中使用的抑制剂（2DG）特异性靶向糖酵解通路。

该优化方案在已发表方案的基础上，通过组合改进而形成¹⁶，糖酵解实验的细胞外通量分析参考试剂盒生产商的用户指南，以及与生产商的技术交流&D科学家。

方案

小鼠根据实验室动物护理评估与认证协会（AAALAC）和美国实验室动物科学协会（AALAS）的指南实施人道安乐死，并采用经德克萨斯A&M大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）

1. 小鼠骨髓的采集与BMDM的培养

1. 处死小鼠（本方案使用6-10周龄的C57Bl/6小鼠），将其仰卧放置，切开皮肤和腹膜层，轻轻剥离后肢。
   注：采用CO₂气体暴露法对小鼠实施安乐死。
2. 从髋部开始分离两条后肢，注意避免切割到骨骼。
3. 将整条后肢放入一个空的50 mL锥形管中（脚掌朝上，便于后续取出），置于冰上，并继续采集小鼠的另一条后肢。

2. 暴露股骨

注意：以下步骤需在生物安全柜中进行。

1. 用剪刀切断每条腿的胫骨以收获股骨，并尽可能用剪刀和实验用纸去除股骨周围的所有组织。
2. 将已收获并“清理”干净的股骨置于一个含有浸透组织培养基（TC medium）或磷酸盐缓冲液（PBS）的实验用纸的10 cm培养皿中，并放置于冰上。
3. 在进行冲洗步骤之前，继续完成所有股骨的采集及周围组织的清除（图1A）。

3. 骨髓冲洗

1. 为从股骨中冲洗骨髓，使用装有3 mL TC培养基或PBS的23G针头注射器。在暴露骨髓前先将注射器装满液体。
2. 用剪刀剪除股骨两端骨骺的末端，以暴露骨髓。
3. 将针头插入股骨，轻柔地将骨髓冲洗至10 cm培养皿中。
4. 将针头贯穿股骨全长，并持续冲洗直至骨组织呈白色。通常使用2–3 mL培养基即可冲出大部分骨髓。
5. 冲洗所有股骨，并将骨髓汇集于培养皿中。用针头破碎可见的团块，然后将骨髓悬液过滤至50 mL锥形管中（图1A）。

4. 红细胞裂解

1. 以 190 × g 离心 10 分钟，弃上清液。
2. 用移液器将沉淀重悬于 4 mL ACK 裂解缓冲液中，在室温下裂解红细胞 5 分钟。
3. 向骨髓悬液中加入 4 mL 含 10% FCS 的 TC 培养基 RPMI-C 10%（RPMI 1640 -GlutaMAX），并补充 2-巯基乙醇、庆大霉素和链霉素，然后以 1300 × g 离心 10 分钟。
4. 再次过滤以去除红细胞碎片，并用少量 RPMI-C 10% 重悬用于细胞计数。
5. 使用细胞计数仪进行细胞计数（图 1B）。本实验采用 Vi-Cell 计数仪测定悬液中细胞的数量和活力。

5. 铺板与培养

1. 向所需数量的 10 cm 培养皿中各加入 10 mL RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子，单核/巨噬细胞增殖、分化和存活的关键调控因子）。
2. 加入适量已计数的细胞，使每个 10 cm 培养皿含有 1 × 10⁶ 个细胞。将培养皿放入 37 °C 培养箱中（定义为第 0 天）。
3. 第 3 天，向每块培养皿中轻柔加入 5 mL 新鲜的 RPMI-C 10% + 10 ng/mL M-CSF。
   注意：第 7 天时，BMDM 应已准备好用于检测（图 1C）。

6. 从培养板中收获细胞

1. 使用光学显微镜确认大多数细胞已贴壁至培养板。
2. 轻柔吸除培养基，加入 3 mL PBS，轻轻晃动培养板，随后吸除液体以去除未贴壁的细胞。
3. 向培养板中加入 7–10 mL 冷 PBS，使用 P1000 移液器冲洗培养板底部，并将所有残留细胞收集至收集管中。
   注意：将收集管置于冰上，因为巨噬细胞贴附性很强，容易黏附在管内壁。若保持低温，细胞贴附性会降低。
4. 离心、计数并接种细胞用于实验（图 1D）。通过流式细胞术检测，所得细胞中 CD11b 和 F4/80 阳性率应超过 >95%。（巨噬细胞极化状态通过 M1 样标志物 CD38、TNF-a 和 MCP-1，以及 M2 样标志物 CD206 的染色来确定。）
   注意：步骤 6.1–6.3 应在生物安全柜中进行，步骤 6.4 可在台面上操作。整个操作过程中需保持无菌技术。

图1：小鼠骨髓来源巨噬细胞培养的图形化操作流程。（A）下肢取材、股骨暴露与骨髓冲洗；（B）红细胞裂解；（C）铺板与培养；（D）从培养板中收获细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 代谢通量分析实验前一天：糖酵解检测用细胞的铺板与极化

1. 开启仪器，将代谢通量分析仪预热至 37 °C。
2. 向检测盒中加入 200 µL 校准液，以进行水合，并将检测盒置于无 CO₂ 培养箱中过夜孵育（图 2A）。无 CO₂ 培养箱的湿度对检测盒的水合过程无影响。
   1. 实验开始前一小时，将微孔板上下轻轻浸入液体数次，有助于去除气泡。
3. 根据测试说明，在软件中使用默认的“糖酵解应激测试-急性注射”模式设计微孔板布局。
   1. 点击软件图标，然后选择 糖酵解应激-急性注射测试。在分组定义图标中创建组名。
4. 共进行五个测量循环，每个循环持续 18 分钟，并进行四次注射。将 A 孔注射物更改为葡萄糖，B 孔注射物更改为寡霉素，C 孔注射物更改为鱼藤酮和抗霉素 A（Rot/AA），D 孔注射物更改为 2-脱氧葡萄糖（2DG）。
5. 将细胞重悬于含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基（RPMI-C 10%）中，接种至代谢通量分析仪微孔板中，每孔 50,000 个细胞，最终体积为 100 µL，但微孔板四角的孔（A1、A12、H1 和 H12）除外（仅加培养基，不加细胞）。通常，该检测至少需要 40,000 个细胞。
6. 将细胞在室温下静置 45 分钟，以避免边缘效应。边缘效应是指微孔板边缘孔周围的培养基部分蒸发，导致体积和浓度变化，并降低细胞活力。
7. 加入 10 ng/mL 的脂多糖（LPS）以诱导初始巨噬细胞向 M1 样细胞极化，加入 20 ng/mL 的白细胞介素-4（IL-4）以诱导其向 M2 样细胞极化。每种条件至少使用 3 至 6 个孔（图 2B）。
8. 在显微镜下观察细胞，然后将微孔板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 24 小时。

图 2：细胞接种与极化的示意图。（A）细胞外通量分析仪的设置及探针板水合过程；（B）细胞的极化及过夜孵育。请点击此处查看该图的放大版本。

8. 检测当天：XF 培养基与化合物的配制

1. 用 2 mM 谷氨酰胺补足 100 mL XF RPMI（pH 7.4）检测培养基。
2. 使用 0.2 µm 真空过滤系统对培养基进行过滤除菌。
3. 将检测培养基置于 37^°C 水浴中孵育 20 分钟。
4. 从 37 °C、5% CO₂ 培养箱中取出细胞培养板，用检测培养基洗涤细胞两次，并更换为终体积 180 µL 的检测培养基。
5. 使用显微镜检查，确保所有孔中的细胞均已汇合，并标记任何因移液操作造成划痕的孔。若存在划痕，分析前应弃用该孔板。
6. 将含细胞的培养板置于无 CO₂ 的培养箱中孵育 45 分钟（图 3A）。
7. 使用化合物与检测培养基配制葡萄糖（100 mM）、寡霉素（100 µM）、Rot/AA（50 µM）和 2-DG（500 mM）的储备溶液（表 1）。
8. 使用检测培养基配制每种化合物的 10 倍注射混合液（表 2）。

注射用储备液（试剂盒中提供）	加入完全检测培养基（mL）	最终储备液浓度（μM）
葡萄糖	3	100K
寡霉素	0.72	100
2-DG	3	100k

表1. 注射用储备液

微孔板上的端口	储备液	添加储备液体积	添加检测培养基	注射物的终浓度（10倍）	向指定端口添加的体积（μL）	每孔注射后的终浓度
A	葡萄糖（100 mM）	3000 μL + 0 μL		100 mM	20	10 mM
B	寡霉素（100 μM）	300 μL + 2700 μL		10 μM	22	1.0 μM
C	鱼藤酮/抗霉素A（50 μM）	300 μL + 2700 μL		5 μM	25	0.5 μM
D	2-DG（500 mM）	300 μL + 0 μL		500 mM	28	50 mM

表2. 最终注射浓度

9. 检测当天：在极化巨噬细胞上进行急性糖酵解检测

1. 从软件中打开已保存的糖酵解应激检测（急性注射）模板。默认的急性糖酵解应激测试在每次注射前有3分钟的混匀和测量时间。
2. 检查模板和检测细节，准备就绪后，点击“运行”并按照默认检测的说明进行操作。但所有参数均可自定义。
3. 从无CO₂培养箱中取出传感器盒，取下盖子，并将传感器盒插入仪器中，使盒板的A1孔位于仪器插入面板的左上角。通常校准需要20至45分钟。
4. 校准完成后，仪器将弹出含有校准液的板并保留传感器盒。请取出含有校准液的板。
5. 从无CO₂培养箱中取出细胞板，取下板盖，并将其插入仪器中。点击“运行”（图3B）。
6. 当检测完成后，仪器将弹出细胞板和传感器盒。
7. 从板中移除培养基，并在-20 °C下冷冻，用于后续归一化处理。
8. 使用商用细胞增殖检测试剂盒（例如CyQUANT）对细胞进行归一化。
9. 将1 mL化合物B或裂解缓冲液加入19 mL无核酸酶的蒸馏水中。
10. 向上述溶液中加入100 µL化合物A或GR工作液。
11. 确保板中的细胞已解冻，然后向每个孔中加入200 µL上述溶液。
12. 在室温（RT）下孵育5分钟。
13. 使用酶标仪在480 nm激发波长和520 nm发射波长下测量荧光。
14. 在软件的归一化面板中对细胞进行归一化处理。
15. 基于初始巨噬细胞的细胞数对细胞进行归一化（图3C）。将初始巨噬细胞的平均值设为1（将每孔细胞数除以初始巨噬细胞的平均细胞数），并将该归一化因子应用于所有巨噬细胞。

图3：检测当天：培养基与化合物的制备及检测运行。 （A）检测用细胞的准备；（B）化合物的制备、校准及检测运行；（C）标准化与数据分析。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

糖酵解和线粒体氧化磷酸化是细胞中产生ATP的两条主要途径（图4A）。某些细胞能够在上述两种途径之间切换，以满足其能量需求。葡萄糖在细胞质中转化为丙酮酸的过程称为糖酵解。丙酮酸有两种代谢去向：其一转化为乳酸，或进一步通过三羧酸循环（TCA循环）及最终通过电子传递链（ETC）进行代谢，以产生更多ATP。为了最准确地评估细胞的糖酵解参数，我们使用寡霉素（oligomycin）抑制氧化磷酸化（OXPHOS）途径，寡霉素是线粒体ATP合酶的抑制剂。我们还注入鱼藤酮/抗霉素A（Rot/AA），以完全关闭电子传递链，从而评估细胞的最大糖酵解能力以及代偿性糖酵解水平（图4A）。葡萄糖是糖酵解的主要底物。由于XF检测培养基中不含葡萄糖或谷氨酰胺，检测中的前三个测量值可反映非糖酵解性酸化速率（图4B、C），即酸化现象，但与葡萄糖转化为乳酸的过程无关。从A孔注入葡萄糖后，细胞外酸化率...

讨论

如前所述，细胞外通量分析仪可通过测量氧消耗率（OCR，反映线粒体氧化磷酸化活性的指标）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解的指标），实时提供有关细胞两种主要能量生成途径的信息。巨噬细胞可根据其所处的微环境利用这两种途径，并且还能够在不同能量生成途径之间转换^17,18。了解巨噬细胞的能量状态及其对不同药物、细胞因子、抑制剂、激活剂等的反应，有助于更深入地理解这些细胞的代谢状态。由于糖酵解是M1样型巨噬细胞中被激活的最关键通路之一，实时获取与糖酵解相关的信息有助于追踪M1样极化的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）在不同体外条件下的变化情况¹⁹。细胞外通量分析中的ATP实时生成速率检测被广泛认为是评估极化BMDMs中ATP生成能力的有效方法²⁰。本文所提供的实验方案提供了详细的技术要点和操作方法，并辅以工作流程的可视化演示，旨在作为一套全面的实验指南，可根据具体研究需求进行调整和应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
23G 针头	VWR	BD305145
2-巯基乙醇	Life Technologies	21985023
50 ml 圆底离心管	VWR	21008-951
ACK 裂解缓冲液	Thermo Fisher Scientific	A1049201	可自行配制
Agilent Seahorse XF 糖酵解压力检测试剂盒	Agilent Technologies	103020-100
Agilent Seahorse XF 糖酵解压力检测试剂盒用户指南	Agilent Technologies	103020-400
Agilent Seahorse XF 糖酵解速率检测试剂盒	Agilent Technologies	103344-100
Agilent Seahorse XF 糖酵解速率检测试剂盒用户指南	Agilent Technologies	103344-100
Alexa Fluor 488 标记抗小鼠 CD206 (MMR) 抗体	BioLegend	141710
抗小鼠 CD11b eFluor450 100 μg	eBioscience	48-0112-82
BD 3 mL 注射器	VWR	BD309657	其他注射器也可使用
细胞计数仪 - Vi-CELL-XR 完整系统	BECKMAN COULTER Life Sciences	731050	也可手动计数细胞
细胞筛网 - 70µm	VWR	10199-656
CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	C7026
F4/80 单克隆抗体 (BM8) pe-Cyanine7	eBioscience	25-4801-82
胎牛血清	Life Technologies	16000-044
流式细胞仪：BD LSFRFortessa X-20	BD	656385
Kim Wipes 擦拭纸	VWR	82003-822
LPS-SM 超纯 (tlrl-smpls) 5 mg	Invivogen	tlrl-smlps
MCSF	Peprotech	315-02
小鼠 IL-4	Peprotech	214-14
PE 标记大鼠抗小鼠 CD38 抗体	BD Biosciences	553764
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
培养皿 100 mm × 15 mm	Fisher Scientific	F80875712
RPMI 培养基，含 Glutamax 和 HEPES	Invitrogen	72400-120
Seahorse 校准液	Agilent Technologies	103059-000
Seahorse XF 200 mM 谷氨酰胺溶液	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF 糖酵解速率检测试剂盒	Agilent Technologies	103344-100
Seahorse XFe96 FluxPak 微孔板	Agilent Technologies	102416-100
XF 糖酵解压力检测试剂盒	Agilent Technologies	103020-100
XF RPMI 培养基，pH 7.4，不含酚红	Agilent Technologies	103336-100