利用过滤和超速离心法分离与表征人脂肪细胞来源的细胞外囊泡

摘要

我们描述了通过过滤和超速离心法从臀部和腹部脂肪组织中分离人脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的方法。通过纳米颗粒跟踪分析测定其大小和浓度，并通过蛋白质印迹法检测EV标志蛋白肿瘤易感基因101（TSG101）的存在，对分离得到的脂肪细胞来源EV进行表征。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类由脂质包被的囊状结构，可携带具有生物活性的物质，如蛋白质、RNA、代谢物和脂质。EVs 可在组织微环境中局部调节其他细胞的细胞状态，也可通过释放到外周血中发挥远端作用。在代谢紊乱（包括肥胖和糖尿病）过程中，脂肪细胞来源的 EVs 在外周血中的水平升高，并且其携带的 cargo（RNA 和蛋白质）发生改变。脂肪细胞来源的 EVs 可调节邻近血管细胞（如内皮细胞和脂肪组织驻留型巨噬细胞）的细胞状态，从而促进脂肪组织炎症的发生。体内研究脂肪细胞来源 EVs 的变化较为复杂，因为来源于外周血的 EVs 高度异质，其中混杂了来自血小板、内皮细胞、红细胞和肌肉等其他来源的 EVs。因此，培养人脂肪细胞为研究脂肪细胞来源 EVs 提供了一个有效的模型系统。本文提供了一种详细的实验方案，通过过滤和超速离心法从小规模培养的人体臀部和腹部脂肪细胞的细胞培养上清中提取全部小型 EVs。我们进一步展示了纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）在 EVs 粒径和浓度定量中的应用，并证实了肿瘤易感基因 101（TSG101）蛋白存在于臀部和腹部脂肪细胞来源的 EVs 中。本方案所分离的 EVs 可用于后续分析，包括透射电子显微镜观察、蛋白质组学、代谢组学、小 RNA 测序、 微阵列分析，也可 用于体外或体内功能研究。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由脂质包被的结构，可携带具有生物活性的物质，如蛋白质、微小RNA（microRNAs）、代谢物和脂质。EVs这一术语涵盖多种亚群，包括外泌体（exosomes）、微囊泡（微颗粒/ectosomes）以及凋亡小体¹。由于EVs参与病理信号传导，并可释放至血液、尿液等生物流体中，因此可能作为生物标志物。EVs可在组织微环境中局部调节其他细胞的细胞状态，也可通过进入外周血实现远端调控²。EVs具有其来源细胞的特征，但不同亚群的区分主要依据EV的大小及其蛋白组成，例如EV标志物，包括四跨膜蛋白家族成员（CD9、CD63和CD81）、肿瘤易感基因101（TSG101）以及ALG-2相互作用蛋白X（ALIX）。这些蛋白标志物反映了EV的来源：CD9、CD63和CD81是源于内体系统的标志物，代表由多泡体生成的外泌体；而微囊泡则通常携带与质膜出芽或出泡过程相关的蛋白。然而，这些亚群之间存在显著重叠，在血浆、血清或尿液等复杂的生物流体中，难以明确区分各个EV亚群。

代谢紊乱，包括肥胖、胰岛素抵抗以及细胞外葡萄糖、氧气和炎症状态的改变，均可影响细胞外囊泡（EVs）的大小、浓度及其所携带的分子成分。脂肪细胞来源的EVs携带Perilipin A和脂联素，并在肥胖和糖尿病状态下表现出其蛋白质和RNA成分的改变^3,4,5,6。脂肪细胞来源的EVs可调节邻近血管内皮细胞⁷以及脂肪组织驻留巨噬细胞的细胞状态，从而促进脂肪组织炎症和胰岛素抵抗^8,9,10,11。在体内研究脂肪细胞来源EVs的改变具有复杂性，因为来自血浆、血清或尿液等复杂生物液体的EV群体包含多种来源的EVs，例如血小板、内皮细胞、红细胞和肌肉细胞，这些细胞均参与代谢功能障碍及相关疾病的发病机制。

因此，人前脂肪细胞的培养及其体外分化为人脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）研究提供了一个模型系统。本文提供了一种详细的实验方案，通过注射器过滤和超速离心法从小规模人脂肪细胞培养上清中提取总的小细胞外囊泡（small EVs）。超速离心法目前仍是一种常用的EV分离方法，因其设备易得且无需过多的专业背景知识。然而，其他方法如沉淀法、尺寸排阻色谱法以及利用四跨膜蛋白（tetraspanins）进行免疫亲和捕获等，也可用于从多种生物液体中分离EVs，包括血浆、血清、尿液以及条件培养基。每种方法（包括本文所述的超速离心法）所获得的EV制备物纯度各不相同，因为这些方法可能共分离出可溶性蛋白和脂蛋白，后者可能被误认为是EVs。将本超速离心方案与其他方法（如密度梯度离心、尺寸排阻色谱法和免疫亲和捕获）结合使用，可显著提高所分离EVs的纯度。但与超速离心类似，这些其他方法也无法从血液、血浆和尿液等复杂样本中特异性地捕获独立的EV亚群。因此，特定细胞群体的体外培养仍是获得高产量、细胞特异性EVs的最可靠方法之一。每种EV分离方法均存在若干局限性，方法的选择可能影响所分离EVs的类型及其浓度，进而对后续的细胞与组织信号传导机制研究以及诊断性研究中EV携带物的鉴定产生偏倚；这些关于EV分离的方法学问题在其他文献及下文的局限性部分已有讨论^4,12。本文中，我们描述了利用过滤和超速离心法分离人脂肪细胞来源EVs的流程。我们进一步展示了纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）在EV粒径和浓度定量中的应用，并证实了人脂肪细胞来源EVs中存在EV标志蛋白——肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）。本方案所分离的EVs可用于后续多种分析，包括透射电子显微镜观察、蛋白质组学、代谢组学、小RNA测序、微阵列分析，并可用于功能性的体外/体内研究。

方案

所有方法均经牛津大学机构伦理审查委员会批准。通过局部麻醉下的针吸活检从健康志愿者获取脂肪组织。

1. 细胞培养基和缓冲液的制备

1. 通过将胶原酶 H（1 mg/mL）溶解于不含氯化钙和氯化镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，并使用 0.2 µm 孔径的注射器滤器进行无菌过滤，制备胶原酶消化缓冲液。
   1. 胶原酶消化缓冲液应在使用前不超过 10 分钟内配制。
2. 按如下方法制备生长培养基（GM）：杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F12 营养混合物（DMEM/F12），添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 0.5 ng/mL 成纤维细胞生长因子（FGF）。
3. 按如下方法制备基础分化培养基（基础 DM）：DMEM/F12 添加 100 单位/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、17 µM 泛酸盐、100 nM 人胰岛素、10 nM 三碘-L-甲状腺原氨酸、33 µM 生物素、10 µg/mL 转铁蛋白和 1 µM 地塞米松。
4. 通过在步骤 1.3 的基础 DM 中添加 0.25 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和 4 µM 曲格列酮，制备完全分化培养基（完全 DM）。
5. 按如下方法制备与 10% 基本无脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）结合的 10 mM 脂肪酸储备液。
   1. 将 16 g BSA 溶解于 160 mL DMEM/F12 培养基中，并加热至 37 °C。在三个独立的 50 mL 圆锥管中，分别称取 150 mg 油酸钠、139 mg 棕榈酸钠和 151 mg 亚油酸钠。向每根管中加入 50 mL 预热的 BSA 溶液，并通过反复涡旋充分混匀。
   2. 将油酸钠和亚油酸钠管放回 37 °C 水浴中 15 分钟，期间通过涡旋混合直至完全溶解。
   3. 对于棕榈酸钠溶液，将管置于 65 °C 水浴中 2–3 分钟，并剧烈涡旋混匀。
   4. 重复步骤 1.5.3，直至完全溶解，约需 30 分钟。
      ​注意：可能仍有少量微小颗粒可见。
   5. 使用 0.2 µm 孔径的注射器滤器对脂肪酸溶液进行无菌过滤。
   6. 使用适当的检测方法确认每种储备液中非酯化脂肪酸的浓度。
      ​注意：脂肪酸储备液浓度应为 10 mM（±10%），以获得脂肪酸与 BSA 之间 6:1 的摩尔比。若浓度超出此范围，应重新配制储备液。储备液可分装后于 -30 °C 保存。

2. 人脂肪组织活检样本的消化

1. 将活检注射器中的内容物缓慢通过一个连接在50 mL锥形管上的200 µm无菌细胞滤筛，使脂肪组织保留在滤筛中。
2. 将滤筛转移至一个新的50 mL锥形管中，并用10 mL HBSS洗涤脂肪组织三次。
   注意：可能需要使用手术剪去除血块和纤维组织，或重复HBSS洗涤以去除多余的红细胞。
3. 称量洗涤后的组织。
   注意：我们通常通过针吸活检获得400–800 mg组织。
4. 将胶原酶消化缓冲液加入无菌的50 mL锥形管中，然后加入洗涤后的组织。此步骤可使用手术剪将组织剪切成大小均匀的碎片。
   注意：每0.5 g组织使用5 mL缓冲液。对于较大的组织样本，可在培养皿中进行剪碎。
5. 将锥形管置于37 °C振荡水浴中，孵育35–40分钟。
   ​注意：消化成功后，溶液应呈现乳白色。若仍可见小块组织，可手动振摇10–20秒。

3. 前脂肪细胞的分离

1. 将前脂肪细胞组分在 1,000 × g 离心 5 分钟以形成沉淀。
2. 吸除并弃去漂浮的脂肪细胞层及上清液，保留约 1 mL 覆盖在细胞沉淀上的 HBSS。
3. 将沉淀重悬于 5 mL HBSS 中，将细胞悬液依次通过孔径为 250 µm 和 100 µm 的滤网，以去除未消化的组织碎片。将细胞悬液收集至 15 mL 圆底离心管中。
4. 在 1,000 × g 离心 5 分钟。
   注意：此步骤后，若存在红细胞污染问题，可使用红细胞裂解液处理前脂肪细胞组分。
5. 吸除并弃去上清液。
6. 将细胞沉淀重悬于 5 mL 增殖培养基（GM，见步骤 1.2）中，接种至 25 cm² 的贴壁组织培养瓶中。将培养瓶置于细胞培养箱（5% CO₂，37 °C）中培养。

4. 前脂肪细胞培养物的维持

1. 细胞增殖期间每2天更换一次生长培养基（GM）
   注意：不同供体来源的细胞增殖速率可能存在差异。
   1. 当细胞融合度达到约80%时，将其转移至75 cm²的贴壁培养瓶中。移除生长培养基（GM），并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
   2. 弃去PBS，加入0.5 mL高纯度的细胞解离酶以解离贴壁细胞。在37 °C下孵育5分钟。
   3. 轻敲培养瓶使细胞脱落，加入5 mL生长培养基（GM）。将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。
2. 在1,000 × g 条件下离心5分钟。
3. 吸除并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5 mL生长培养基（GM）中，转移至一个75 cm²培养瓶，补加生长培养基至终体积12 mL，并将培养瓶放回细胞培养箱（5% CO₂，37 °C）。
   注意：为维持细胞生长，需继续每2–3天更换一次生长培养基（GM）。当细胞融合度达到80%时，重复步骤4.2–4.3，按1:3比例将细胞传代至新的75 cm²培养瓶中。可进行多次传代，直至获得足够数量的细胞用于实验。不建议传代超过10代，因为前脂肪细胞的增殖能力和分化能力会随传代次数增加而下降。

5. 脂肪前体细胞接种以进行成脂分化

1. 使用血细胞计数板计数细胞，并将200,000个细胞接种至6孔板的多个孔中，每孔加入2 mL生长培养基（GM）。或者，将350万个细胞接种至175 cm²培养瓶中，加入22 mL GM培养基。
2. 继续培养细胞2–4天，使其增殖至完全融合状态，并在培养的第二天更换GM培养基。
3. 开始脂肪向诱导分化时，吸除GM培养基，更换为完全分化培养基（DM），每孔6孔板加入2 mL完全DM，或每175 cm²培养瓶加入22 mL完全DM，培养4天。
   注意：第2天更换新鲜的完全DM培养基。
4. 第4天，吸除完全DM培养基，更换为2 mL基础DM培养基，并补充22.5 µM油酸、15 µM棕榈酸和12.5 µM亚油酸，使6孔板每孔总脂肪酸浓度达到50 µM，或在175 cm²培养瓶中加入22 mL上述培养基。此后每2天更换一次培养基，持续培养10天。
   注意：从第7天开始，可在分化中的前脂肪细胞中观察到脂滴。
5. 培养第14天，收集细胞培养上清液，用于分离脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）。

6. 细胞培养上清液的制备，用于细胞外囊泡的分离或储存及未来的细胞外囊泡分离

1. 从每个6孔板中移除细胞培养上清液并合并，加入15 mL离心管中；或从175 cm²培养瓶中移除全部细胞培养上清液² 烧瓶并转移至50 mL离心管中。
2. 以 1000 x g 离心 g 4 °C 下 10 分钟.
3. 将上清液分别倒入新的洁净15 mL或50 mL离心管中。
4. 移除10 mL注射器的筒体，并连接一个0.45 µm注射器滤器。
5. 将上清液倒入注射器储液腔中，用拇指或手掌轻轻按压注射器筒开口处，直至细胞培养上清液顺利通过滤膜。
   注意：此过滤步骤的速度可能因注射器滤器的类型而异。
6. 将滤液收集到一个洁净的50 mL离心管中。
   注意：如有需要，此时可将过滤后的条件培养基在 -80 °C 保存数周。使用时，在 4 °C 解冻细胞培养上清液，并以 1000 x g 4 °C 下 10 分钟. 将上清液倾入干净的离心管中，然后继续进行EV分离。

7. 细胞外囊泡的分离

1. 用记号笔在13 mL超速离心管底部画一个圆圈，用于标记预期的细胞外囊泡（EV）沉淀形成位置，并在管颈处画一条线，以便在超速离心转子中定位方向。用样本编号标记该离心管。
2. 将离心管放入管架中。
3. 将16 G针头连接至10 mL注射器上，并取下注射器筒。
4. 取下针头保护帽，将针头插入超速离心管的管颈中。
5. 直接将细胞培养上清液倒入注射器筒中，以填充超速离心管。
6. 根据需要加入PBS补满至管口。
   注意：如有必要，允许离心管轻微溢出，确保超速离心管内无气隙且无气泡。
7. 使用电烙铁密封超速离心管，轻轻挤压管体以确保密封性良好，无漏气。
8. 将超速离心管放入超速离心转子中；确保管顶标记的线条和管底画出的圆圈朝向外侧，即EV沉淀将形成的位置。
9. 在4 °C条件下，以120,000 × g 离心2小时。
10. 小心地将转子从超速离心机中取出。
11. 从转子中取出超速离心管，并放入管架中。
12. 将16 G针头连接至10 mL注射器上。
13. 用针头刺穿超速离心管顶部，将针头插入管顶约2 cm深处，吸取上清液至注射器中。
14. 将去除了EV的上清液倾入1.5 mL离心管中，并于-80 °C冷冻保存。
15. 重新将针头插入管中，小心吸取残留的上清液并弃去。
16. 用剪刀剪去离心管顶部。
17. 迅速一次性倒出剩余的上清液。
18. 将离心管倒置悬挂1分钟。
19. 用纸巾轻轻吸干管壁上形成的液滴。
20. 将离心管翻转正放，并放入管架中。
21. 向管中加入100 µL PBS。
22. 使用移液器枪头，在步骤7.1中标记区域以环形动作轻轻搅动，使管底的EV沉淀松动。
23. 短暂涡旋振荡（1–2秒），重复两次。
24. 用记号笔在新的13 mL超速离心管底部画一个圆圈，用于标记预期的EV沉淀形成位置，并在管颈处画一条线，以便在超速离心转子中定位方向。用样本编号标记该离心管。
25. 将离心管放入管架中。
26. 使用洁净的注射器和针头，向新的超速离心管中加入12 mL PBS。
27. 使用注射器和针头吸取100 µL EV样品，并加入上述离心管中。轻轻抽吸混合EV与PBS，并通过反复吸取少量PBS的方式清洗注射器和针头，将清洗液排入管中。
    注意：避免产生气泡。
28. 使用电烙铁密封超速离心管，轻轻挤压管体以确保密封性良好，无漏气。
29. 将超速离心管放入超速离心转子中；确保管顶标记的线条和管底画出的圆圈朝向外侧。
30. 在4 °C条件下，以120,000 × g 离心1小时。
31. 小心地将转子从超速离心机中取出。
32. 将16 G针头连接至12 mL注射器上。
33. 用针头刺穿超速离心管顶部，将针头插入管顶至多2 cm深处，吸取上清液至注射器中并弃去。
34. 用剪刀剪去离心管顶部。
35. 迅速一次性倒出剩余的上清液。
36. 将离心管倒置悬挂1分钟。
37. 用纸巾轻轻吸干管口边缘形成的液滴。
38. 将离心管放入管架中。
39. 向管中加入100 µL PBS。
40. 使用移液器枪头，在步骤7.24中标记区域以环形动作轻轻搅动，使管底的EV沉淀松动。
41. 短暂涡旋振荡（1–2秒），重复两次。
42. 用移液器将100 µL PBS/EV溶液转移至洁净的1.5 mL离心管中，并置于湿冰上保存。
    ​注意：EV已可用于后续实验操作，亦可冷冻保存于-80 °C。

8. 使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定细胞外囊泡的大小和浓度

1. 准备系统
   ​注意：Mehdiani 等人已报道了一种使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定细胞外囊泡（EV）大小和浓度的详细方法¹³。
   1. 将样品解冻并保持在 4 °C。
   2. 通过点击软件图标启动 NTA 软件。
   3. 软件将以"细胞检查"模式启动，并提示用去离子水填充流动池。用去离子水填充一支 10 mL 注射器，并将其推入仪器中，确保无气泡进入加样室。
   4. 按照屏幕上的说明完成系统的质量检查（QC）准备。软件将执行细胞检查并给出细胞质量的评估结果，该结果应为“很好”至“极好”。
   5. 准备质量控制样品，使用 100 纳米的聚苯乙烯微球。将 1 µL 标准品加入 999 µL 去离子水中（稀释储备液），随后取 10 µL 稀释储备液加入 2.5 mL 去离子水中（QC 样品）。通过轻轻涡旋 2–3 秒并用移液器吹打混合溶液。
      ​注意：质量控制样品应每天新鲜配制，但初始稀释的储备液在 4 °C 下可稳定保存 1 周。
   6. 用 1 mL 的 QC 样品填充一支 1 mL 注射器，并彻底排除注射器中的所有气泡。
   7. 将注射器针头轻轻倾斜插入 NTA 样品加样室，在缓慢推动活塞的同时注入样品，避免引入气泡。向加样室中注入最多 950 µL 的 QC 样品。
      ​注意：切勿将气泡引入样品加样室。
   8. 等待软件自动完成对焦（相机对准）并检查 Zeta 电位读数所需的电压——电压图应呈现平滑的 U 形曲线。
      ​注意：如果出现“电压过低错误”的提示信息"，可能是由于清洗后细胞残留水分、连接不牢固或存在气泡所致"。
   9. 自动对焦/电压检查完成后，使用相机位置下拉菜单检查所有位置（0.1–0.9）是否存在异常标记——若存在此类标记，表明细胞可能需要冲洗和/或清洁。完成 QC 后，系统将显示"准备就绪，可进行测量"。
   10. 用 PBS 对流动池进行预处理。打开“泵/温度”选项卡，在“泵”部分点击泵 2（PBS 储液器）的“运行”按钮。这将使 PBS 流经细胞 1 分钟，然后自动停止。
       ​注意：加样室中可能存在颗粒，但可通过从加样口推入 10 mL PBS 清除。
   11. 用 PBS 填充一支 10 mL 注射器，并在无气泡的情况下将其加载至加样室。
   12. 创建一个设备运行方案，用于测量激光的多个位置并对每帧的颗粒数进行平均。
   13. 在继续操作前，检查颗粒计数应低于 5（尽可能接近 0）——如有必要，可用更多 PBS 冲洗。
   14. 稀释前，通过移液操作混匀 EV 样品。
   15. 将样品用 PBS 稀释 1:1,000，并通过移液操作混匀。用该样品填充一支 1 mL 注射器，并在无气泡的情况下加载至加样室。
   16. 检查颗粒计数是否处于可接受范围内（计数值上方的条形图应位于绿色区域或接近该区域）。如不符合要求，请相应调整样品稀释度。在不同样品或不同稀释度之间，先向仪器前端加载 10 mL PBS 以清洗加样室，然后加载 1 mL 稀释后的样品。
       ​注意：每个样品的稀释度应根据其浓度独立确定。为获得准确测量结果，设备每帧的颗粒计数应在 50–200 个之间。
   17. 进入软件中的测量选项卡。
   18. 点击运行视频采集按钮。
   19. 输入样品名称并选择保存测量结果的目标文件夹。
2. 创建 EV 标准操作程序（SOP）。
   1. 创建 > 保存 > 加载一个 EV SOP，设置快门速度为 100，相机灵敏度为 80，采集 11 个相机位置，共 2 个循环。
      注意：除非样品有特殊要求，否则无需更改这些设置。
   2. 输入样品的稀释倍数，并添加任何其他需要备注的信息。
   3. 点击确定，软件将自动开始记录。完成后，软件将自动弹出一个表格，显示每个相机位置的平均颗粒计数和尺寸。
      ​注意：在此期间请勿触碰仪器或附近台面，以免振动影响最终读数。
   4. 具有统计学异常读数的相机位置将被自动排除——如需手动排除某些相机位置（或因任何原因重新包含已被排除的位置），请点击样品详细信息左侧的复选框。
   5. 点击继续，软件将生成并打开包含尺寸和浓度结果的样品 PDF 报告。
3. 统计分析
   1. 采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）结合事后 Tukey 校正法分析 NTA 数据。数据以组均值 ± 标准差形式绘图。P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

我们根据所述方案确定了从人臀部脂肪细胞中分离出的细胞外囊泡（EVs）的数量。采用纳米颗粒追踪分析（NTA）方法计算了脂肪细胞来源的EVs的大小和浓度。图1A，B）。我们使用了假处理培养基对照，即与细胞未接触过但经过相同培养和上述分离程序的等体积培养基。我们在初次分离后以及用PBS洗涤分离的脂肪细胞来源EV后，分别测定了其浓度（图1A，B并绘制了各组均值 ± 标准差（SD），采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析，并进行事后Tukey校正。

通过NTA测定的脂肪细胞来源EVs的浓度^st 分离范围为 6.10 x 10⁶ 至 2.70 × 10⁷ 中位数为 2.60 x 10⁷ EVs/mL（图1 A，B）。经 PBS 洗涤后，每个样本中脂肪细胞来源的 EVs 数量显著减少（图1A，B) (P < 0.001），范围从 5.00 × 10⁵ 至 4.30 × 10⁶ 中位数为 2.70 x 10⁶ EVs/mL。通过NTA测定，假手术培养基对照组不含EVs（图1A，B）。第一次分离得到的EVs的众数大小为125 nm，经PBS洗涤后为105 nm（图1A，B）。所述方案进一步应用于来自较大T175 cm培养瓶的腹部和臀部来源的脂肪细胞² 烧瓶。这些来自T175 cm²培养瓶的臀部EV样本² 浓度范围从 3.60 x 10 的培养瓶⁷ 至 7.50 × 10⁷/mL，中位数为 5.40 x 10⁷ EVs/mL。来自T175 cm²培养瓶的腹部脂肪细胞来源EVs² 培养瓶的浓度范围为 6.30 x 10⁷ 至 8.60 × 10⁷/mL，中位数为 7.60 x 10⁷ EVs/mL（图1C，D）。T175 cm² 培养瓶来源的EVs的众数粒径² 烧瓶中的囊泡大小分别为：臀部来源的细胞外囊泡（EVs）为115 nm，腹部来源的EVs为125 nm。我们通过免疫印迹检测肿瘤易感基因101（TSG101）来确认臀部和腹部来源EVs中EV蛋白的存在。结果显示，腹部和臀部脂肪细胞沉淀以及由其衍生的EVs均呈TSG101阳性，而未与细胞接触的假手术对照培养基则呈TSG101阴性。图1E).

图1细胞培养基中脂肪细胞来源的细胞外囊泡的大小与分布特征分析及EV蛋白TSG101的检测 通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定的总EV浓度及其粒径与浓度分布谱图^st 分离后（N = 5）及经PBS洗涤后（N = 6）。（C）总浓度及（D）通过NTA测定的腹部和臀部来源EVs的粒径与浓度分布曲线，来自T175cm²培养瓶² 培养瓶（每组 N = 4）。(E) 臀部和腹部来源的细胞外囊泡（EVs）中 TSG101 的 Western 印迹检测。细胞沉淀物和模拟培养基分别作为阳性对照和阴性对照。数据以组均值 ± 标准差（SD）表示。采用单因素或双因素方差分析，事后采用 Tukey 校正。*** P < 0.001 < 0.001. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

我们展示了一种从细胞培养上清液中分离臀部和腹部脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的方案，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）^7,14,15测定其大小和浓度。结果表明，培养的人类脂肪细胞能够产生并释放EVs至细胞培养基中，随后可通过过滤和超速离心法进行分离。我们测定了分离所得脂肪细胞来源EVs的粒径分布和浓度，并发现超速离心过程可能共同沉淀了培养基中的污染物；而用PBS洗涤分离得到的EV沉淀物后，在第二次NTA检测中其浓度显著降低。我们进一步通过TSG101（一种EV标志蛋白）的Western blotting分析评估了臀部和腹部来源EVs的纯度。来自臀部和腹部脂肪细胞的EV制备物均呈TSG101阳性，但重要的是，在未与细胞共培养的对照培养基中未检测到TSG101。本研究所采用的实验使用人类脂肪细胞作为EVs的来源细胞，但所述方法同样适用于其他细胞类型，包括内皮细胞、血管平滑肌细胞、骨骼肌细胞、免疫细胞，以及用于从患者血小板贫乏血浆或血清中分离EVs。

在代谢性疾病中，脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EV）水平升高。然而，确定体内脂肪细胞EV在大小和数量上的变化十分复杂，因为血液等生物体液中含有多种细胞来源的EV，这些细胞也参与了代谢性疾病的发病过程，包括内皮细胞、骨骼肌细胞、红细胞以及免疫细胞释放的EV。本文所述方法可特异性检测人脂肪细胞来源的EV，这可能为研究脂肪细胞中EV生成机制提供一个有用的模型，而目前该机制尚不清楚。尤为重要的是，明确脂肪细胞EV的生成过程以及特定RNA、蛋白质和代谢物如何被选择性装载至脂肪细胞EV中，可能揭示出干扰代谢功能障碍中致病性脂肪细胞EV信号传导的新型治疗策略。深入的研究将有助于更好地理解EV的大小、数量、生成途径及其携带物（RNA、蛋白质和代谢物）在疾病状态或外界刺激（如氧、葡萄糖、脂质和胰岛素水平的改变）下的变化规律。了解环境因素对代谢性疾病中脂肪细胞EV信号传导的影响，以及脂肪细胞来源的EV在脂肪组织炎症中的作用，可能发现代谢性疾病的新型治疗靶点。

局限性
脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EV）的体外生成
在体外使用人前脂肪细胞为研究脂肪细胞分化后脂肪细胞来源EV的释放和生成提供了一个模型系统，但仍存在若干局限性。特别是，体外生成的脂肪细胞来源EV在大小、浓度、EV蛋白、RNA、代谢物及功能方面，可能与从生物体液（如血浆）中提取的脂肪组织来源EV存在差异¹⁴。这些EV的差异可能受到体内脂肪组织中其他非脂肪细胞的影响，例如脂肪组织来源的干细胞、内皮细胞和巨噬细胞。这些细胞与脂肪组织的生理功能密切相关，并已被证实参与脂肪组织的病理过程，包括脂肪组织炎症。

需要注意的是，此处描述的为期2周的体外分化方案可能不足以生成与体内细胞完全成熟的脂肪细胞相当的细胞；以二维（2D）形式培养的体外分化脂肪细胞在形态上与体内细胞不同，且不会形成单房性脂滴。此外，本方案中所述的前脂肪细胞来源于脂肪组织的基质血管组分，我们尚未评估在细胞分离过程中未被完全清除的其他细胞类型对细胞外囊泡（EV）群体的贡献。

脂肪细胞与脂肪组织中其他非脂肪细胞之间重要细胞间相互作用的丧失，可能影响脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EV）的生成与释放、EV蛋白和EV RNA，以及脂肪组织来源干细胞的功能¹⁶。然而，目前尚未全面评估体外培养获得的脂肪细胞EV与体内产生的EV之间存在的差异。

原代组织活检样本含有血液，因此无论本方案中强调的多次洗涤和换液步骤如何，所获得的细胞培养物中仍可能含有红细胞及红细胞来源的细胞外囊泡（EVs）。在分离出基质-血管组分后，可能需要额外进行红细胞裂解步骤，以消除红细胞对脂肪细胞的影响。这一点非常重要，因为红细胞来源的EVs可影响其他细胞的细胞功能¹⁷，且在氧化应激条件下¹⁸以及代谢综合征患者中^19,20，红细胞来源的EVs水平升高。因此，来自代谢性疾病患者的脂肪组织可能含有较高水平的红细胞来源EVs，这可能会影响脂肪细胞的体外表型。

去除胎牛血清（FBS）
本方案在脂肪向分化期间的生长培养基中使用了胎牛血清（FBS），但在最终收集培养基以分离脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EV）之前，脂肪细胞经历了多次换液。因此，我们推测EV制备物中被FBS来源EV污染的总体风险较低，并通过TSG101的蛋白质印迹法进一步证实细胞培养基中不存在残留EV。对于需要使用FBS的细胞来源，其细胞培养EV的分离必须采用去EV的FBS，或通过超速离心去除牛源EV，以避免牛源EV干扰脂肪细胞EV的浓度测定及其内容物分析。已知从脂肪细胞培养体系中完全去除血清会影响其细胞反应²¹，因此相关研究必须确保血清去除或血清中EV的去除不会导致脂肪细胞培养体系偏离真实的脂肪细胞生物学特性。

使用过滤和超速离心法分离细胞外囊泡的技术局限性
我们描述了一种使用一次性塑料管进行超速离心分离细胞外囊泡的方法，这些塑料管在超速离心前需要密封。我们承认，这些一次性密封管对许多人而言可能并非经济的选择，因此建议探索无需密封且可重复使用的类似离心管。然而，研究人员必须确保可重复使用离心管的清洗充分，避免蛋白质、脂质和RNA污染物随时间推移逐渐累积，从而影响后续对细胞外囊泡相关载物的分析，或干扰细胞功能研究。

此处所述的过滤和超速离心方案已使用多年，多项研究已指出该方法的不足之处，包括非特异性地分离出污染性细胞组分（如细胞线粒体）、存在细胞核碎片以及细胞膜组分。此外，本方法将共同分离出存在于无细胞外囊泡（EV）胎牛血清（FBS）中的脂蛋白 。可通过采用密度梯度超速离心和尺寸排阻色谱法（SEC）进一步优化本方法，以去除污染的可溶性蛋白和部分脂蛋白。结合磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤分离的EV以及SEC，可限制但无法完全消除共分离的污染物。因此，使用者应设置适当的对照，包括未与细胞接触的假处理培养基对照，以排除培养基中可溶性蛋白和脂蛋白的影响，以及无EV的上清液对照，以证明从仍含有可溶性蛋白和脂蛋白的条件培养基中成功分离出EV。

使用过滤和超速离心法分离细胞外囊泡（EVs）时，操作者必须确保在细胞培养上清液通过滤膜孔径或针头/注射器孔道时不会施加过大的压力。在本方案所述步骤中若施加过大的外力，可能导致EVs破裂，影响最终EVs的浓度，并释放原本包裹在EVs内的游离RNA、蛋白质和代谢物。本文所描述的方法无需使用注射器筒体，因此在条件培养基中的EVs通过滤膜或针头进入收集容器和超速离心管的过程中，无需对其施加机械力。尽管如此，在用PBS重悬EVs沉淀时仍需格外小心。只能短暂使用涡旋振荡，剧烈涡旋可能破坏EVs的膜结构。

超速离心后，操作人员必须小心处理超速离心管，以免扰动细胞外囊泡（EV）沉淀。可通过轻柔操作，缓慢地将离心管在超速离心转子与试管架之间移动来实现。当在超速离心管顶部穿刺以吸取去除了EV的上清液时，需格外小心。若将针头插入管顶并快速吸取上清液，会在注射器筒内产生真空，可能导致上清液猛烈回流至超速离心管中，从而破坏EV沉淀。在切割超速离心管以倾倒剩余上清液时，也需谨慎操作，因为EV沉淀可能变得松动，倾倒过程会导致EV沉淀丢失。 alternatively，可使用注射器和针头缓慢吸除剩余上清液，避免倾倒或翻转离心管。

通过过滤和超速离心法对上清液进行处理以分离细胞外囊泡（EVs），是一种有用且高效的方法。但该方法容易共分离出脂蛋白和可溶性蛋白质。可通过使用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤EVs（如所述）来减轻此类污染，但此步骤无法完全去除所有污染物。利用尺寸排阻色谱法（SEC）可将可溶性蛋白质从EV组分中洗脱出来，然而该方法无法区分脂蛋白与EVs。含有EVs的SEC洗脱组分可与超速离心法联合使用，以沉淀获得EVs。相较于使用聚乙二醇的沉淀法，过滤结合差速超速离心法是更优选的EVs分离方法，因为此类沉淀法在细胞培养上清液及其他生物液体中会大量共分离可溶性蛋白质和脂蛋白。由于大多数实验室均配备有超速离心机，因此超速离心法可能在很长一段时间内仍是许多研究者最容易获得的EVs分离手段，从而避免了高昂的初始设备投入成本。然而，对许多研究者而言，EVs的超速离心分离受限于超速离心管的容量以及起始样品的体积。可能需要数百毫升的培养上清液才能获得足够量的EVs，用于后续的蛋白质组学或RNA测序分析。然而，EVs的超速离心分离技术很可能会与其他技术联合应用，例如尺寸排阻色谱法（SEC）以及利用四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81进行的免疫亲和捕获，以提高所分离EVs的纯度。其他技术，如 commercially available 沉淀溶液和流式细胞术，可能在特定研究中具有一定应用价值。

EV 制剂的纯度
我们通过 TSG101 的蛋白质印迹法证实了脂肪细胞来源 EV 的分离，但仅凭这一项蛋白质印迹结果尚不足以满足国际细胞外囊泡学会（ISEV）发布的指南要求。理想情况下，应对这些脂肪细胞来源的 EV 进一步表征，例如使用四跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 来鉴定外泌体，并检测组蛋白 H3、白蛋白和载脂蛋白 A1 等细胞污染标志物。

本文所述方案可用于从多种细胞来源（包括脂肪细胞）的细胞培养上清液中分离细胞外囊泡（EVs），并可用于测定EV的大小、浓度、通过蛋白质印迹法检测EV标志物，以及在基于组学的技术（如蛋白质组学和RNA测序）中的应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 µm 网格滤膜	Sefar	03-250/50
15 mL 圆锥形离心管	Sarstedt	62.554.002
250 µm 网格滤膜	Sefar	03-100/44
50 mL 圆锥形离心管	Sarstedt	62.547.004
Beckman Coulter Optima MAX-XP 超速离心机	Beckman Coulter	393315
双辛可宁酸蛋白定量分析（BCA）	Thermo Scientific	23225
生物素	Sigma	B4639
牛血清白蛋白（基本无脂肪酸）	Sigma	A7030
胶原酶 H	Sigma	11074032001
地塞米松	Sigma	D2915
杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F12 营养混合物	Sigma	D6421
胎牛血清	Labtech	FCS-SA
成纤维细胞生长因子	Bio-Techne	233-FB-025
谷氨酰胺	ThermoFisher	25030024
汉克斯平衡盐溶液	Sigma	H9394
人胰岛素	ThermoFisher	12585-014
皮下注射针头，Microlance 16G	VWR	613-3897
IBMX	Sigma	I7018
纳米颗粒追踪分析仪 Zetaview	Particle Metrix	BASIC PMX-120
游离脂肪酸检测试剂盒（NEFA）	Randox	FA115
泛酸盐	Sigma	P5710
青霉素和链霉素	ThermoFisher	15140122
磷酸盐缓冲液	ThermoFisher Scientific	10010056
PluriStrainer 200 µm 细胞筛	Cambridge Bioscience	43-50200-03
一次性聚烯烃快速密封超透明离心管，16 mm × 76 mm	Beckman Coulter	342413
一次性注射器，两件式，Injekt Solo	VWR	20-2520
亚油酸钠	Sigma	L8134
油酸钠	Sigma	O7501
棕榈酸钠	Sigma	P9767
电烙铁	Zacro	7.14954E+11
注射器滤器，0.2 µm	Sarstedt	83.1826.001
注射器滤器，0.45 µm	ThermoFisher	195-2545
T175 cm² 组织培养瓶	Sarstedt	83.3912.002
T25 cm² 组织培养瓶	Sarstedt	83.3910.002
T75 cm² 组织培养瓶	Sarstedt	83.3911.002
转铁蛋白	Sigma	T8158
三碘甲腺原氨酸（L-型）	Sigma	T5516
曲格列酮	Sigma	T2573
TrypLE Express 酶解液	Fisher Scientific	12604021