利用经胸多巴酚丁胺应激超声心动图揭示小鼠心脏功能的细微变化

摘要

左心室功能障碍是多种心脏疾病的共同终末通路。本文提供了一种经胸多巴酚丁胺负荷超声心动图技术的详细方案，用于全面评估心脏疾病小鼠模型的左心室功能及心脏表型。

摘要

左心室（LV）功能障碍是多种心脏疾病发展的最终通路。通过在人体中应用无创高频经胸多巴酚丁胺负荷超声心动图，现已能够采用还原论的研究方法揭示心脏功能的细微变化。本文提供了一种在小鼠中应用该技术的实验方案，以促进对生理和病理状态下左心室结构与功能的深入分析，从而观察在非应激心脏中难以发现的心脏疾病模型中的功能改变。该检测可在同一只动物身上重复进行，既可获取基础状态下的数据，也可获得药物诱导应激状态下的测量结果。我们详细阐述了合适的麻醉标准、基于影像的左心室分析方法、对观察者内和观察者间变异性的考量，以及在接近生理条件下经腹腔注射多巴酚丁胺后小鼠体内可实现的正性肌力反应的获取方法。为了在小型动物模型中重现人类生理与疾病的特征，我们强调了评估过程中需注意的关键陷阱，例如小鼠中显著的博维奇效应（Bowditch effect）。为进一步实现转化研究目标，我们比较了人类与小鼠在应激诱导效应上的异同。在开展转化研究时，必须关注小鼠与人类之间的生理差异。由于小鼠模型在空间和时间分辨率方面的限制，实验严谨性要求对患者中常用的某些评估参数在小鼠中使用时必须谨慎对待。

引言

人类许多心脏疾病的特征是左心室（LV）的收缩和/或舒张功能受损。为了检测结构异常、诊断和管理收缩性心力衰竭，以及评估心力衰竭症状患者的舒张功能，超声心动图被用作一种基本的评估手段。

由于症状缺乏特异性，且超过三分之一具有心力衰竭临床综合征的患者实际上可能并未罹患心力衰竭，因此寻找与患者临床表现相对应的客观超声心动图指标至关重要。¹此外，某些在静息或静态状态下隐匿的症状可能在活动或应激条件下出现。在冠状动脉疾病患者中，冠状动脉灌注的轻微改变即可导致节段性室壁运动异常。然而，这些细微变化无法通过常规超声心动图进行评估，因为心脏病变的改变可能在无应激状态下被掩盖。为了更深入地理解心脏的生理病理状态，应激超声心动图可在运动或药物诱导的应激条件下对心肌结构和功能进行动态评估，从而实现症状与心脏发现的对应分析²此外，在小型动物中，该方法是一种非侵入性的可靠方法 体内工具^3,4,5与人类相似，可通过药物在小鼠和大鼠中诱导心肌的应激反应。多巴酚丁胺是一种常用药物，多巴酚丁胺应激超声心动图在人类中被广泛应用。^6,7 但仅偶尔用于小型动物模型以评估心脏应激反应^8,9,10,11多巴酚丁胺是一种合成的儿茶酚胺类药物，主要具有β1受体激动作用，可增强心肌收缩力和心率。为了实现从人类到小鼠的正确转化，必须考虑超声心动图的技术和概念框架，以及与小鼠体型小和心率快等相关的技术限制。在人类多巴酚丁胺负荷超声心动图中，目标心率为[(220－年龄)×0.85]，在健康志愿者中平均可使心率增加约150±10%^12,13对于小鼠，尚缺乏此类公式。在人类中，应激性超声心动图显示射血分数（EF）可增加5-20%。^12,14. 小鼠的射血分数（EF）根据心率不同，报道为58 ± 11%（< 450 次/分钟）和 71 ± 11%（≥ 450 次/分钟），在心率较高时变化近 20%⁴小鼠增加心输出量的主要机制是心率的增加。这一机制部分归因于博迪奇效应（Bowditch效应），即一种频率依赖性的钙介导正性肌力心脏反应，该效应在小鼠中比在人类中更为显著。^15,16此外，（负荷）超声心动图存在观察者间和观察者内变异。因此，高度标准化的操作流程必不可少。^17,18.

本文介绍了多巴酚丁胺负荷超声心动图的详细操作步骤，旨在获取标准化图像，以揭示健康和疾病模型小鼠心脏功能的细微变化。关键步骤包括适当的麻醉、充分的心率监测，以及小鼠应激成像中可能遇到的陷阱。关键参数包括收缩功能和舒张功能的评估，并需考虑左心室射血分数（LVEF）。由于小鼠对后负荷诱导的心功能障碍具有抵抗性¹⁷，该方案也可为瓣膜性心脏病模型的研究提供有价值的信息。

方案

所有方法和操作均按照相关法规（《用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护欧洲公约》（指令2010/63/EU））进行，并符合动物护理的机构指南。人类受试者的数据分析符合所有机构、国家和国际人类福利指南，并已获得当地伦理委员会批准（20-9218-BO）。所有实验均使用12周龄的雄性C57BL/6JRj小鼠进行。

1. 材料与设备的准备

注意：图1 展示了一个小动物超声工作场所的示例。

1. 确保在安静且光线可调暗的受控环境中操作。
2. 预热超声耦合剂，例如使用耦合剂加热器，使其升温至 37 °C。此过程可能需要一定时间。
3. 使用消毒湿巾清洁所有器械，包括平台。
4. 开启平台并预热至 37 °C。
5. 打开超声成像设备，输入动物编号、实验方案编号及其他相关信息。对体重约为 30 g 的小鼠，使用中心发射频率为 30 MHz 的高频超声探头。
6. 务必使用活性气体排出系统进行操作。
   注意：若使用活性炭过滤器吸附呼出气流中的异氟烷，需定期检查滤芯重量，当达到规定的最大增重时应及时更换。
7. 必要时，向蒸发器中加入适量异氟烷。
   警告：避免吸入挥发性麻醉剂。
8. 通过稀释市售注射液或按照生产商说明将多巴酚丁胺盐酸盐粉末溶于 0.9% 生理盐水中，配制浓度为 2.5 µg/µL 的多巴酚丁胺工作液。该溶液在室温下保存至少 24 小时内稳定。

​
图1小型动物心脏超声工作站 人体工学设计对于小动物应激性超声心动图检查至关重要，因为检查时间必须保持较短。工作区域包括一台超声设备、一套配备氧气供应和主动废气排出功能的小动物麻醉系统，以及一个内置心电图监测和可调节移动功能的加热式超声心动图检查平台。 通过 显微操作仪作为集成导轨系统的一部分，以及生理监测装置。用于加热超声耦合剂的凝胶加热器和加热灯是有用的辅助设备。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 小鼠成像前准备及麻醉诱导

1. 将诱导室中充满体积分数为 3%–4% 的异氟烷（使用富氧气体混合物，其中氧气流速为 1 L/min，纯度 100% O₂）。
2. 称量小鼠体重。轻轻抓住小鼠尾巴，将其转移至诱导室中。通过密切观察动物的活动，确保其在数秒内进入镇静状态。
3. 如有必要，将气体流切换至连接麻醉系统的鼻罩（维持 1.0–1.5 体积百分比的异氟烷，氧气流速为 1 L/min，100% O₂，以保持稳定的镇静状态）。将小鼠从诱导室中取出，并小心放置于预热的平台上。确保其四肢置于平台内置的 ECG 传感器上。
4. 为防止巩膜干燥，需在双眼涂抹眼膏。
   注意：压力测量需要一定时间。
5. 在 ECG 传感器上涂抹极少量的导电膏。使用胶带轻轻固定动物四肢。用少量胶带固定动物头部在鼻罩中的位置。ECG 用于在图像采集期间记录心率。调节生理成像系统，以获得稳定且清晰的 ECG 信号。
   注意：导电膏过多可能导致 ECG 信号质量下降。
6. 为防止动物在操作过程中受到应激，通过维持心率在 400–450 次/分钟（bpm）范围内来评估镇静深度是否合适。心率由 ECG 获取，允许在此范围内波动 50 bpm。
   注意：动物的活动可能提示镇静深度不足。麻醉不应导致小鼠出现心功能抑制。可根据上述目标心率范围调整镇静程度。
7. 使用润滑剂后，轻柔插入直肠温度计以持续监测体温。将体温维持在生理范围内（通常根据小鼠品系和实验设置，介于 36.5 °C 至 37.5 °C 之间）。在未进行环境温控的小动物心脏超声实验室中，可考虑使用红外照明。
8. 使用化学脱毛膏去除胸部体毛。用干净的湿纸巾擦拭胸部，确保清除所有残留的脱毛膏成分（图 2A）。
   注意：也可在使用脱毛膏前先用电动剃毛器进行初步处理。此时动物已准备就绪，可进行成像。由于必须尽量缩短成像时间，整个成像前准备过程应控制在 3 分钟以内。

图 2：动物与换能器的放置位置。（A）将小鼠固定在加热平台上，四肢均固定于银质心电图电极上。插入直肠温度计以测量体温。将鼻部轻轻插入麻醉系统的鼻罩中。（B）胸骨旁长轴切面（PSLAX）的探头方向；见步骤 3.2。（C）胸骨旁短轴切面（PSSAX）的探头方向；见步骤 3.3。（D）心尖四腔心切面（4CH）的探头方向；见步骤 3.4。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 基本心血管成像

注意：可使用两种基本的探头位置（胸骨旁和心尖超声窗）（图2）以及至少三种超声模式（B（亮度）模式、M（运动）模式和多普勒模式（彩色多普勒和脉冲波（PW）多普勒））（图3、图4、图5）获取图像。有关成像基础，请参阅先前发表的文章^16,18。获取清晰的图像以与后续获得的负荷图像进行比较至关重要。

1. 将预热的超声耦合剂无气泡地涂抹于胸部。
   注意：使用未加热的超声耦合剂会导致动物体温迅速下降，从而影响心率。
2. 进行胸骨旁长轴（PSLAX）切面检查。
   注意：PSLAX用于观察左心室的长轴切面。通过该切面可获取主动脉根部直径、近端主动脉直径以及左心室长度等参数。
   1. 使动物头部背向操作者，将操作台向左倾斜约10–20°，向前倾斜5–10°，以尽可能使心脏前移。将探头置于胸骨旁，与心脏长轴平行，探头标记（凹槽）朝向动物右肩（图2B）。
   2. 使用微调装置调整至最佳图像视野，并利用图像控制面板优化图像。在心室中段水平至少获取一幅二维B模式图像和一幅M模式图像。
   3. 根据具体研究需求，可额外采集其他图像。至少采集100帧图像，并包含至少3(–6)个完整的心动周期。
3. 进行胸骨旁短轴（PSSAX）切面检查。
   注意：PSSAX用于观察左心室的短轴切面。由此切面可计算左心室收缩末期容积（LVESV）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、每搏输出量（SV）和心输出量（CO）。
   1. 将探头顺时针旋转90°，保持角度不变（此时标记朝向动物左肩）（图2C）。在基底部、心室中段（乳头肌水平）和心尖部水平各至少获取一幅B模式图像。
   2. 为确定最基底和最心尖的切面，沿长轴方向移动至仍能完整观察左心室腔心动周期的最远端点。在心室中段，大致于乳头肌水平的中间位置采集图像。
   3. 在心室中段短轴切面至少获取一幅M模式图像。
      注意：部分超声设备为不同切面提供预设模式；建议在图像采集前确认选择合适的预设模式。
4. 进行心尖四腔（4CH）切面检查。
   注意：4CH切面非常重要，因其主要用于通过脉冲多普勒（PW Doppler）评估二尖瓣功能。
   1. 调整平台，使动物处于改良的头低脚高位（Trendelenburg位）。将探头朝向小鼠头部方向倾斜，探头标记朝向动物左侧（图2D）。
   2. 至少获取一幅B模式图像，以及二尖瓣和三尖瓣的彩色多普勒和脉冲多普勒图像。根据实验需求，可在4CH切面应用组织多普勒成像。
      注意：到达心尖四腔切面最简便的方法是从PSAX切面倾斜操作台并调整探头角度。操作时应避免对胸壁施加过大压力，以免干扰舒张功能等参数的测量。

4. 多巴酚丁胺负荷成像

注意：一旦达到目标心率，只要目标心率保持稳定，就应采集标准化切面图像。此过程通常需要在胸骨旁长轴（PSLAX）与胸骨旁短轴（PSSAX）切面之间进行多次切换。由于PSLAX与PSSAX切面之间的切换仅需90°旋转，因此可轻松完成成像。

1. 在同一动物体内进行多巴酚丁胺应激试验，并保持相同的麻醉状态，以确保结果可比性。确保起始心率稳定在400-450 bpm范围内。记录心电图读数，并将其与所获取的图像一并保存。确保心电图信号清晰；否则，尝试重新粘贴四肢电极，直至显示清晰的心电图信号。
2. 再次获取左心室长轴切面（PSLAX）图像（B模式和M模式图像），并将图像保存为“基线”图像。务必同时保存并记录初始心率。
3. 预先抽取药物，使用27 G针头和1 mL注射器，按5 µg/g体重剂量将多巴酚丁胺经腹腔注射。密切观察心率变化。持续记录超声心动图图像，直至达到目标心率，并利用心率升高情况进行后续分析。通常在注射后约1分钟，心率增加15-30%即可达到稳定且显著的多巴酚丁胺诱导心率上升，具体增幅取决于给药剂量。
   注意：每次实验动物均应使用一次性无菌注射针头，以防止感染。多巴酚丁胺的敏感性及（次）最大负荷可能因小鼠品系不同而异，也可能受实验条件影响，应在预实验中确定。建议根据具体实验设计调整多巴酚丁胺剂量。
   警告：请遵循机构关于锐器及潜在感染性物品使用的安全指南。使用后的针头必须始终丢弃于经批准的医疗废物容器中！
4. 当达到目标心率并保持稳定约30秒后，按照步骤3所述方法获取PSLAX切面的B模式和M模式图像。
5. 随后，顺时针旋转探头以获取左心室短轴切面（PSSAX），操作方法同步骤3所述。在此切面，获取基底部、中段心室（乳头肌水平）和心尖部的B模式图像，以及中段心室（乳头肌水平）的M模式图像。需确认目标心率保持稳定；若心率波动，则切换回PSLAX切面位置并重新开始成像。
   注意：由于停止给药后心率会迅速下降（本文未涉及持续输注多巴酚丁胺的方法）¹²，所有图像应在两分钟内完成采集。PSLAX和PSSAX切面图像对于大多数与应激相关的关键测量指标至关重要（参见“代表性结果”部分）。
6. 现在再次获取心尖四腔切面图像（操作方法见步骤3.4）。使用脉冲波多普勒（PW Doppler）测量感兴趣的血流模式（详见步骤3.4.2）。在非应激状态下，通过PW多普勒可测得两个特征性波形：一个代表心室被动充盈（E（早期）波），另一个代表心房收缩后的主动充盈（A（心房）波）。随着心率升高，这两个波形趋于融合，在多巴酚丁胺诱导的应激状态下可能无法清晰分辨。

5. 最后步骤

1. 大约5分钟后，当心率再次开始下降时，确保已采集所有切面图像。
2. 使用干净的湿纸巾轻轻清除胸部的超声耦合剂。小心移除胶带固定装置。特别注意固定动物头部的胶带，避免牵拉导致胡须脱落。
3. 关闭麻醉装置。如果使用主动式废气排出系统，请确保继续进行废气排出。将动物放置在独立的加热笼内，并在一张纸巾上使其苏醒。密切观察动物状态，在其恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。待动物清醒并完全恢复后，将其转移回饲养笼中。
   ​注意：由于该技术具有非终末性特点，动物可依据所有相关法规继续参与实验。

6. 离线评估

1. 将图像数据转移至工作站上的离线分析软件，以对心脏功能进行详细评估。需特别注意非应激状态与应激状态下心脏功能的差异。心率应始终被记录并呈现。
   注意：由于不同软件的分析方法存在差异，本方案不涵盖具体软件操作。请参考制造商提供的使用说明。

结果

在 PSLAX 切面下获取的生理非应激状态超声心动图图像如图3所示。在舒张期，心室壁表现均匀（图3A），并有一定程度的增厚（图3B、C）。腹腔注射 5 µg/g 体重的多巴酚丁胺可显著提高心率（正性变时作用）¹² 和左心室射血分数（LVEF，正性变力作用）（图3，图6）。正性变力作用在图3D–F中可见，表现为左心室前壁在舒张期（LVAWd）增厚，收缩期（LVAWs）增厚更为明显，以及左心室后壁在舒张期和收缩期（LVPWd；LVPWs）均增厚（图3D

讨论

在临床环境中，通常通过运动试验或药物负荷试验对人类进行应激状态下心脏功能的评估^6,7。由于小鼠在运动后需进行镇静，导致其运动后即刻超声心动图检查受到极大限制，因此多巴酚丁胺诱导的负荷超声心动图可能是评估应激相关心脏生理病理变化最具转化价值的方法。在最终评估中，可通过实时压力-容积分析获得关于心脏功能的可靠信息²³。超声心动图可提供长期观察的重要信息，因而也进一步符合3R原则（替代、减少、优化）的要求。

在患者中，应激超声心动图最常见的用途是检测室壁运动异常和心肌存活性，以及评估心脏瓣膜疾病，其重要性已在近期指南中指出^24,25。然而，这些应用仅是心功能衰竭病理生理学拼图中的一部分。因此，我们认为，在临床前研究中采用药物应激试验将有助于揭示疾病模型和心脏表型分析中心脏功能的潜在且细微的变化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活性炭过滤器	UNO BV	180000140	http://www.unobv.com/Rest%20Gas%20Filters.html
Aquasonic 100 超声传导凝胶	Parker Laboratories	001-02	https://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp
化学脱毛乳液	General Supply	-
棉签	General Supply	-
ddH2O	General Supply	-
多巴酚丁胺	Carinopharm	71685.00.00	https://www.carinopharm.de/stammsortiment/#103
实验动物麻醉用流量计	UNO BV	SF3	http://www.unobv.com/Flowmeters.html
气体排气装置	UNO BV	-	http://www.unobv.com/Gas%20Exhaust%20Unit.html
加热灯	Philips	-
诱导麻醉箱	UNO BV	-	http://www.unobv.com/Induction%20box.html
医用锐器盒	BD	305626	https://legacy.bd.com/europe/safety/de/products/sharps/
MX400 超声换能器（20–46 MHz）	VisualSonics	MX400	https://www.visualsonics.com/product/transducers/mx-series-transducers
Octenisept 消毒剂	Schuelke	173711	https://www.schuelke.com/de-de/produkte/octenisept.php
Omnican F 注射器（带针头，1 mL）	B. Braun	9161502S	https://www.bbraun.de/de/products/b60/omnican-f.html
纸巾	General Supply	-
Signacreme 电极导电膏	Parker Laboratories	017-05	https://www.parkerlabs.com/Signacreme.asp
标准纱布垫	BeeSana Meditrade	4852728	https://www.meditrade.de/de/wundversorgung/verbandstoffe/beesana-mullkompresse/
Thermasonic 凝胶加热器	Parker Laboratories	82-03-20 CE	https://www.parkerlabs.com/thermasonic_apta_sbp.asp
Transpore 胶带	3M	1527NP-0	https://www.3mdeutschland.de/3M/de_DE/unternehmen-de/produkte/~/3M-Transpore-Fixierpflaster/
Vaporizer Sigma Delta 麻醉蒸发器	UNO BV	-	http://www.unobv.com/Vaporizers.html
Vevo 3100 高频临床前超声成像系统	VisualSonics	Vevo3100	https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-3100 * 所需软件包：心血管软件包；B 模式、M 模式、脉冲波多普勒模式
集成导轨系统、加热平台及生理监测单元的 Vevo 成像工作站	VisualSonics	-	https://www.visualsonics.com/product/accessories/imaging-stations
VevoLab 分析软件	VisualSonics	版本 3.2.5	https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab *所需软件包：Vevo Strain、左心室分析