点印迹法分析R-环

摘要

本方案详细描述了一种简单的方法，用于定量R-loop（R环），即一种由RNA-DNA杂合链和一条被置换的DNA链组成的三链核酸结构。

摘要

三链核酸结构R-loop在基因调控中的作用正日益受到关注。最初，R-loop被认为只是转录过程的副产物；但近期研究发现，在病变细胞中R-loop数量减少，这表明R-loop在多种人类细胞中具有重要的功能作用。接下来，明确R-loop的功能以及细胞如何调控其丰度变得尤为关键。目前该领域面临的一个挑战是R-loop的定量检测，因为大量研究依赖于S9.6单克隆抗体，而该抗体对RNA-DNA杂合体的特异性曾受到质疑。本文中，我们采用S9.6抗体进行点印迹（dot-blot）实验以定量R-loop，并利用可分别切割RNA-DNA杂合体、单链RNA和双链RNA的RNase H、RNase T1和RNase III来验证该检测方法的灵敏度和特异性。该方法具有高度可重复性，仅需常规实验室设备和试剂，可在两天内获得结果。该检测方法可用于科研和临床研究中定量R-loop，并评估如senataxin等基因突变对R-loop丰度的影响。

引言

本方案提供了一种点印迹（dot-blot）检测的逐步操作指南，可用于快速比较评估R-loop（三链核酸结构）的丰度。R-loop的形成是当RNA侵入双链DNA，生成RNA-DNA杂合体，并置换出另一条DNA链所致。R-loop存在于RNA生命周期的不同阶段。在转录复合物中，新生RNA以模板DNA为模板互补合成，而非模板链则被置换出来。短暂的RNA-DNA杂合体（<10 bp）随后被解离，以释放新生RNA，使其可通过出口通道离开RNA聚合酶复合物^1,2。在转录复合物之外，新生RNA仍靠近其DNA模板，而该模板DNA因刚完成复制仍处于轻微解旋状态，因此RNA可与模板DNA重新杂交，形成R-loop³。此外，当复制复合物与转录复合物发生碰撞时⁴，或在反义转录过程中⁵，也可形成R-loop。由于形成机会众多，R-loop并不罕见，在人类基因组中约占3-5%⁶，具体比例取决于细胞的转录状态。R-loop存在于mRNA的基因启动子区⁷和终止区⁵，也分布于核糖体RNA⁸和转运RNA⁹序列中。此外，R-loop也存在于染色体的端粒区域。

R环具有调控作用。它们通过影响启动子处的转录^10,11、介导类别转换重组¹²以及促进基于CRISPR的基因组编辑^13,14,15来调控基因表达。与许多细胞事件类似，R环的数量受到严格调控；R环过多或过少都会影响细胞的正常功能^16,17。R环受到多种蛋白质的调控，包括RNase H、senataxin以及其他能够解旋RNA-DNA杂交链的解旋酶^{18,19,20,21,22}。

为了监测R-loop的丰度，全基因组方法首先使用S9.6抗体^8,23,24或其他核酸酶²⁵（包括RNase H^10,26,27）对R-loop进行富集，然后通过测序评估富集到的R-loop数量。早期基于测序的方法未能达到足够的序列覆盖度以实现精确定量，但随着测序技术的快速发展，目前已有能力实现位点特异性的R-loop分析。免疫荧光技术也被用于R-loop的定量与定位^10,17。这些方法具有较高的全面性，但由于需要昂贵的设备和专业的分析流程，在许多临床环境中并不实用，也不适合作为初步评估手段。

在临床环境中，需要一种能够在不同实验室中统一执行的操作流程。点印迹（dot-blots）提供了这样一种选择，因为其无需任何特定设备或计算分析即可完成。作为初步步骤或在临床环境中用于评估突变对R环影响时，这些点印迹必须提供灵敏且特异的结果。本文中，我们描述了一种可特异性识别R环的检测方法；该方法排除了来自双链（ds）DNA、双链RNA以及单链RNA的信号干扰。本实验方案使用S9.6抗体²⁷来识别R环中的RNA-DNA杂交链，并引入RNase H——一种可切割RNA-DNA杂交链中RNA链的内切核糖核酸酶，从而导致其降解^20,28，以确保所检测到的信号确实来源于杂交结构。此外，我们还引入了RNase T1（可在鸟嘌呤位点切割单链RNA）^29,30和RNase III（可切割包括茎环结构在内的双链RNA）^31,32，以检测是否存在非特异性信号。S9.6抗体能够识别不同长度的RNA-DNA杂交链，甚至可识别短至8个核苷酸的杂交序列³³。

本文介绍了一种从核酸分离开始，继而进行点杂交制备，并利用 S9.6 抗体检测 R 环的实验方案。本方案包含确保样品上样量相等以及信号特异性的步骤，并提供了作为阳性和阴性对照的寡核苷酸。该方法快速、简便且易于操作，可用于评估 R 环的丰度。

方案

1. 细胞裂解以进行核组分分离

1. 用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。使用胰蛋白酶等标准细胞解离技术从组织培养皿中分离细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
   注意：以下步骤用于分析原代人皮肤成纤维细胞，但也可适用于多种其他细胞类型。成纤维细胞在含 10% 胎牛血清的基础培养基中培养。或者，可在洗涤后直接向细胞培养物中加入细胞裂解缓冲液（表 1）。
2. 将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中，离心收集细胞沉淀。
3. 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。
4. 使用步骤 1.3 的离心条件，用预冷的 1× PBS 洗涤两次。
5. 向细胞沉淀中加入冷的细胞裂解缓冲液（表 1）（每 2 × 10⁶ 个细胞加入 300 µL），反复吹打以重悬沉淀。
6. 冰上孵育 10 分钟。
7. 以 500 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞核。
8. 弃去上清液，将细胞核沉淀重悬于 400 µL 冷的核裂解缓冲液（表 1）中。
9. 冰上孵育 10 分钟。
   注意：细胞核与细胞质组分的分离可确保信号特异性。在继续实验前可评估核与胞质分离的质量（表 2）。
10. 加入 3 µL 浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K，于 55 °C 孵育 3–5 小时。
    注意：所列体积适用于 2 × 10⁶ 个细胞，可根据需要按比例调整。

2. 基因组DNA（包含RNA-DNA杂交体）的纯化

1. 若DNA黏稠，需进行超声处理以降低黏度（例如，高功率超声，开启30秒/关闭30秒，4 °C水浴中处理2分钟）。
2. 加入400 µL洗脱缓冲液（表1）和400 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH 8.0）。
3. 涡旋振荡10秒。
4. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心5分钟。
5. 将水相（约350 µL）转移至新离心管中。
6. 用1体积氯仿萃取一次，涡旋振荡10秒，然后在4 °C条件下以12,000 × g离心5分钟。将水相转移至新离心管中（约300 µL）。
7. 加入35 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）、1 µL糖原和700 µL预冷的100%乙醇。
8. 涡旋振荡10秒，并在4 °C条件下以12,000 × g离心30分钟。
9. 用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀。
10. 涡旋振荡10秒，并在4 °C条件下以12,000 × g离心15分钟。
11. 弃去上清液，让沉淀在空气中自然干燥。
12. 加入12 µL洗脱缓冲液，涡旋振荡10秒以重悬沉淀。将样品在37 °C振荡条件下孵育30分钟，或在4 °C过夜，以充分重悬沉淀。
13. 使用标准分光光度法测定DNA浓度。
    注意：上述体积适用于2 × 10⁶个细胞，可根据需要按比例调整。如有需要，DNA（含RNA-DNA杂交体）可在-20 °C保存。

3. 将DNA样本（包含RNA-DNA杂交体）转印至尼龙膜上

1. 用洗脱缓冲液将核酸稀释至所需浓度（例如 50 ng/µL、25 ng/µL 或 12.5 ng/µL）。这些不同浓度的样品（200、100、50、25、12.5 ng）可确保信号落在线性范围内。
   注意：请确保制备足够的样品量，以用于技术重复和生物学重复，以及各种RNase处理，参见步骤5。
2. 准备一张带正电荷的尼龙膜，确保每个2 µL样品可点样于0.5 cm²的区域。
3. 将每种样品各2 µL分别点样到两张膜上：一张用于S9.6抗体检测，另一张用于dsDNA抗体检测。或者，也可使用点印迹（dot-blot）或槽印迹（slot-blot）装置，以便加载更大体积的样品。
4. 让样品充分渗入膜中。在用紫外光交联前，至少等待2分钟。
5. 将膜置于紫外设备中央，使用"自动交联"设置（1,200 µJ x 100）进行紫外交联。

4. 使用 S9.6 抗体检测 RNA-DNA 杂交体

1. 将膜置于封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液，即含0.05% Tween-20的Tris缓冲盐溶液）中，在室温下摇床上孵育1小时。
   注意：封闭液体积应足以覆盖膜。
2. 将膜在含一抗的封闭液（5%脱脂奶粉TBST溶液）中于4 °C摇床上过夜孵育。向一张膜中加入抗dsDNA抗体（1:10,000稀释）。向另一张膜中加入1 µg/mL S9.6抗体（1:1,000稀释）。
   注意：S9.6抗体可从商业渠道获得，或联系美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所（NIAID）的S. Leppla博士获取。
3. 移除一抗溶液，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5–10分钟，室温摇床洗涤。
4. 在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（抗小鼠抗体，1:5,000稀释），室温摇床孵育。
   注意：抗dsDNA抗体和抗RNA-DNA杂交体抗体均为小鼠来源抗体。
5. 移除二抗溶液，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5–10分钟，室温摇床洗涤。
6. 使用增强型化学发光（ECL）试剂显影，以获取用于成像的信号。
7. 使用ImageJ等标准图像处理工具对信号强度进行定量分析。
   注意：故障排除详见表2。

5. 核糖核酸酶处理以评估信号特异性

注意：应对核酸样品进行核糖核酸酶（RNase）处理，以证明 S9.6 结合的特异性。使用 RNase H 处理应导致 S9.6 免疫染色信号减弱，而 RNase T1 或 RNase III 处理则不会产生此效果。

1. 将含有RNA-DNA杂交体的样品分别置于四个独立的试管中进行消化处理。对这4个样品分别加入5 U RNase H、1000 U RNase T1、0.5 U RNase III，或设为空白对照（mock）。在20 µL反应体系中，37 °C条件下孵育15分钟。
2. 按照第3节所述方法，将每个样品取2 µL加样至膜上。

6. 准备寡核苷酸对照以评估信号特异性

注意：寡核苷酸对照可用于证明 S9.6 结合的特异性。S9.6 可识别 RNA-DNA 杂交体，但不能识别双链 DNA（dsDNA）或双链 RNA（dsRNA）对照，这一点已有先前报道³⁴。

1. 将寡核苷酸（表 3）溶解于退火缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0；50 mM NaCl，1 mM EDTA）中，终浓度为 100 µM。
2. 准备 4 个反应管，分别用于：
   1. RNA-DNA 杂交体 #1：将 10 µL 单链 RNA 上游链与 10 µL 单链 DNA 下游链及 80 µL 退火缓冲液混合。
   2. RNA-DNA 杂交体 #2：将 10 µL 单链 DNA 上游链与 10 µL 单链 RNA 下游链及 80 µL 退火缓冲液混合。
   3. 双链 RNA（dsRNA）：将 10 µL 单链 RNA 上游链与 10 µL 单链 RNA 下游链及 80 µL 退火缓冲液混合。
   4. 双链 DNA（dsDNA）：将 10 µL 单链 DNA 上游链与 10 µL 单链 DNA 下游链及 80 µL 退火缓冲液混合。
3. 将步骤 6.2 中的 4 种混合物在 95 °C 加热 10 分钟。
4. 让反应管缓慢冷却至室温，以使链重新退火。退火完成的标准品可于 -20 °C 保存以供后续使用。
   注：应通过非变性凝胶电泳检测退火效率。双链结构的迁移速度比未退火的寡核苷酸更慢（表 2）。
5. 按照第 3 节所述方法，将每种样品各取 2 µL 分别点样于两张膜上，一张用于 S9.6 抗体检测，另一张用于 dsDNA 抗体检测。
6. 执行第 4 节中描述的步骤。

7. 使用 ImageJ 对 S9.6 R-loop 信号强度进行定量和标准化。

1. 以 TIFF 格式保存 S9.6 和双链 DNA 染色图像，并使用 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）进行分析。
2. 选择图像反相选项（编辑 | 反相）。反相后，每个点将在深色背景上以白色显示。
3. 使用椭圆图像选择工具，选择一个足够大的椭圆区域，以包围图像中最大的点。
4. 使用 ROI 管理器将选定区域添加用于定量分析。确保选中"显示全部"和"标签"选项，以便可视化感兴趣区域。
5. 使用步骤 7.3 中相同的椭圆选择区域，在每个待定量的点周围添加额外的感兴趣区域。使用 Command + Shift + E 快捷键将步骤 7.3 中选定的区域复制到后续各个点上。
6. 测量每个感兴趣区域的积分密度。
7. 将每个样本的 S9.6 信号强度除以双链 DNA 的测量值，得到 S9.6/dsDNA 信号比值。通过重复实验（S9.6 和双链 DNA 信号获取均至少三次重复）验证结果。标准误差可由 S9.6/dsDNA 信号比值计算得出。

结果

酶处理以评估 S9.6（RNA-DNA）抗体的特异性。
培养原代人皮肤成纤维细胞¹⁷。分离并定量含有 RNA-DNA 杂交体的 DNA。取 2 µg 样品，分别用 RNase T1、RNase H 或 RNase III 在 37 °C 下消化 15 分钟。同时分析一个未处理对照样品，用于与 RNase 处理样品进行比较。将样品（200、100、50、25、12.5 或 6.25 ng）按第 3 节所述方法点样至两种不同的膜上。将膜进行交联和封闭处理，其中一张膜用 S9.6 抗体进行杂交检测（图 1A）。

结果表明，S9.6 信号与上样样本的丰度相关。经 RNase H 处理后，S9.6 染色信号减弱，而 RNase T1 或 RNase III 处理则无此效应。

第二张膜使用dsDNA抗体进行杂交（图1B），用于归一化。采用Image J分析信号强度。选择50 ng的样品进行定量，因为S9.6和dsDNA抗体的信号强度均处于动态范围内。信号强度以模拟处理样品的信号强度为基准进行归一化。数据如图2所示。

S9.6 抗体点印迹实验使用合成核苷酸对照。
为评估 S9.6 抗体的特异性，我们使用了与双链 RNA（dsRNA）、双链 DNA（dsDNA）以及 RNA-DNA 杂交体相对应的寡核苷酸，具体如第 6 节所述。将 RNA-DNA、dsRNA 和 dsDNA 核苷酸进行系列稀释后，按照第 3 节所述方法点样至尼龙膜上。随后使用 S9.6 抗体对膜进行杂交检测（图 3）。结果显示，S9.6 抗体以剂量依赖的方式特异性结合 RNA-DNA 杂交体，而对 dsRNA 和 dsDNA 的交叉反应性极低。

图1：S9.6特异性通过加载人成纤维细胞核酸的点印迹显示。 来自人成纤维细胞的核酸样本分别进行模拟处理或经RNase T1、RNase H或RNase III处理后，以每2 µL点样量分别为200、100、50、25、12.5和6.25 ng的梯度稀释系列点样于尼龙膜上。随后用S9.6抗体（A）或dsDNA抗体（B）对膜进行杂交检测。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：S9.6 R-loop染色的定量分析。 从图1中选取50 ng样品，使用ImageJ进行定量分析。将S9.6信号除以dsDNA信号强度，然后根据第7节所述步骤，归一化至模拟处理（mock）样品。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：使用寡核苷酸对照的 S9.6 点印迹实验。 S9.6 抗体对合成的双链 RNA（dsRNA）、双链 DNA（dsDNA）或 RNA-DNA 杂交体寡核苷酸系列稀释样本进行点印迹检测。S9.6 以剂量依赖方式特异性结合 RNA-DNA 杂交体。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞裂解缓冲液	配制10mL	配制200mL	终浓度
无核酸酶水	9mL	180mL	-
10% NP-40	0.5mL	10mL	0.5%
2M KCl	0.4mL	8mL	80mM
0.5M PIPES (pH 8.0)	100uL	2mL	5mM
核裂解缓冲液	配制10mL	配制200mL	终浓度
无核酸酶水	8.65mL	173mL	-
10% SDS	1mL	20mL	1%
1M Tris-HCl (pH 8.0)	0.25mL	5mL	25 mM
0.5M EDTA	100uL	2mL	5 mM
洗脱缓冲液	配制10mL	配制200mL	终浓度
1M Tris-Cl, pH 8.5	0.1 mL	2 mL	10 mM
无核酸酶水	9.9 mL	198 mL	-

表1. 缓冲液的配制

步骤	问题	可能原因	解决方案
1.9	N/A	验证细胞分馏效果	可通过在细胞裂解缓冲液和核裂解缓冲液中加入标准蛋白酶抑制剂混合物（表1）来评估核与胞质分离的质量。通过Western blot分析可评估胞质和核组分的纯度，确认胞质标志物（例如GAPDH或HSP90）仅在胞质组分中被标记，而核标志物（例如HDAC1或组蛋白H3）仅在核组分中被标记。核组分中线粒体污染的程度可通过使用线粒体DNA特异性探针进行qPCR分析来评估。
2.1	样品过于黏稠	细胞数量过多。	将DNA量减半后继续进行超声处理步骤2.1
2.12	无可见沉淀	起始材料不足或提取过程中样本丢失。	重新开始实验，并使用更多细胞。
2.13	DNA浓度偏低
3.1	稀释用DNA量不足
3.4	样品无法充分浸润膜		将膜浸泡于1×TBST中，待多余缓冲液干燥后，从步骤3.4重新开始
4.6	检测到斑驳或点状图案		在样品中加入0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），然后从步骤3.1继续操作
4.6	斑点呈现“咖啡环”状外观		在样品中加入0.01% Sarkosyl，然后从步骤3.1继续操作
5.2	RNaseH对照未显示信号下降	核糖核酸酶消化不完全。	延长孵育时间或提高酶浓度。
6.5	寡核苷酸对照无信号	双链未形成。寡核苷酸未正确退火。	验证寡核苷酸比例及退火缓冲液的组成。
6.5	S9.6信号并非特异性结合于杂交链	S9.6抗体批次存在非特异性结合	使用RNase酶处理或合成寡核苷酸分析，验证新批次S9.6抗体的灵敏度和特异性。

表2：故障排除

单链RNA，正链	5’-UGGGGGCUCGUCCGGGAUAUGGGAACCACUGAUCCC-3’
单链DNA，正链	5’-TGGGGGCTCGTCCGGGATATGGGAACCACTGATCCC-3’
单链RNA，负链	5’-GGGAUCAGUGGUUCCCAUAUCCCGGACGAGCCCCCA-3’
单链DNA，负链	5’-GGGATCAGTGGTTCCCATATCCCGGACGAGCCCCCA-3’

表3. 对照寡核苷酸序列

讨论

三链核酸结构R-loop在RNA生命周期的不同阶段形成，并被发现越来越多地参与调控细胞过程。为了全面理解R-loop，需要可靠的R-loop检测技术。本文介绍了一种利用S9.6抗体^8,23,24检测R-loop丰度的方法。该方法可快速评估来自细胞和组织培养样品中的R-loop丰度，无需特殊设备或大量起始材料。通过结合RNase处理，该方法可确保结果的特异性和可重复性。

一些研究者对 S9.6 抗体的特异性提出了担忧。与任何试剂一样，S9.6 抗体可能存在批次间的差异。我们的实验方案中包含 RNase H、RNase T1 和 RNase III，以验证信号的特异性。此外，我们使用合成寡核苷酸来确保每一批 S9.6 抗体的特异性。

R-loop 生物学是一个不断发展的领域；可靠检测与定量方法的开发（例如本文所介绍的方法）将有助于开展机制研究，以阐明 R-loop 的形成时机、调控方式及其调控对象。在适当对照条件下，该点印迹检测法是一种在临床和科研环境中快速筛选 R-loop 含量的简便方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗dsDNA抗体	Abcam	ab27156
抗RNA-DNA杂交体抗体（S9.6）	Kerafast	ENH001
Biorupter超声破碎仪	Diagenode	UCD-200
EB缓冲液	Qiagen	19086
EDTA（0.5 M）	Invitrogen	AM9261
Hybond N+ 尼龙膜	GE healthcare Life Sciences	RPN203B
KCl（2 M）	Invitrogen	AM9640G
NP-40（Igepal CA-630）	Sigma	I8896
PBS	Invitrogen	10010-023
苯酚:氯仿:异戊醇	Invitrogen	15593031
PIPES（0.5 M，pH 8.0）	VWR	AAJ61406-AE
蛋白酶K	Qiagen	19131
核糖核酸酶III	Invitrogen	AM2290
核糖核酸酶H	New England Biolabs	M0297
核糖核酸酶T1	ThermoFisher Sci.	EN0541
SDS（10%）	Invitrogen	15553027
乙酸钠（3 M，pH 5.2）	Invitrogen	AM9740
Tris缓冲盐水（10X）	Corning	46-012-CM
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）	KD Medical	RGF-3360
TrypLE	Invitrogen	12605010
Tween-20	Sigma	P9416
UV Stratalinker 2400	Stratagene	Stratalinker 2400
Whatman标记笔	Sigma	WHA10499001