方法文章

高效且可扩展的人诱导性多能干细胞来源的人腹侧中脑星形胶质细胞的生成

DOI：

10.3791/62095

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2021年10月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种从人诱导多能干细胞（hiPSCs）可重复地生成腹侧中脑模式化星形胶质细胞的方法，并提供了用于表征其表型与功能的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在帕金森病中，中脑腹侧多巴胺能神经元的进行性功能障碍与退化导致严重影响生活质量的症状。帕金森病中的神经元退化具有多种病因，其中包括由星形胶质细胞介导的非细胞自主机制。在整个中枢神经系统中，星形胶质细胞对神经元的存活与功能至关重要，因其维持着神经微环境中的代谢稳态。星形胶质细胞与中枢神经系统的免疫细胞——小胶质细胞相互作用，调控神经炎症；这种神经炎症在帕金森病的最早期阶段即可观察到，并直接影响其病理进展。在包括帕金森病在内的具有慢性神经炎症特征的疾病中，星形胶质细胞会获得一种神经毒性表型，从而加剧神经退行性变。因此，星形胶质细胞成为潜在的治疗靶点，有望延缓或阻止疾病进展；但这需要对其在帕金森病中的特性与作用有更深入的理解。因此，迫切需要建立准确的人源中脑腹侧星形胶质细胞体外研究模型。

我们已开发出一种从人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成高纯度、特定腹侧中脑星形胶质细胞（vmAstros）的实验方案，可用于帕金森病研究。该方案可常规地从多种hiPSC细胞系中产生vmAstros，并表达特异性的星形胶质细胞及腹侧中脑标志物。此方案具有可扩展性，适用于高通量应用，包括药物筛选。关键的是，由hiPSC衍生的vmAstros表现出与其体内对应细胞典型的免疫调节特性，从而能够对帕金森病中的神经炎症信号通路进行机制性研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

帕金森病影响约65岁以上人群的2%至3%，是发病率最高的神经退行性运动障碍疾病1。该病由中脑腹侧黑质区多巴胺能神经元退化所致，导致严重的运动功能障碍，并常伴有认知和精神方面的问题2。帕金森病的病理特征是蛋白质α-突触核蛋白（α-synuclein）形成聚集体，这些聚集体对神经元具有毒性，可导致神经元功能障碍和死亡1,2,3。由于多巴胺能神经元是帕金森病中发生退变的主要细胞群体，长期以来一直是研究的重点。然而，研究表明大脑中的另一类细胞——星形胶质细胞——在帕金森病中也表现出异常，并被认为在帕金森病模型中参与了神经退行性变过程4,5,6,7。

星形胶质细胞是一类异质性的细胞群体，可根据需要发生物理和功能上的转变。它们通过多种机制支持神经元的功能与健康，包括调节神经元信号传导、塑造突触结构，以及通过分泌特定因子为神经元群体提供营养支持6,8,9,10。然而，星形胶质细胞还具有重要的免疫调节作用，参与神经炎症的发生与发展10,11。在帕金森病患者的大脑中可观察到神经炎症，且近期研究明确表明，神经炎症甚至早于帕金森病症状的出现12,13,14,15，因而成为当前帕金森病研究的核心焦点。

在细胞层面，星形胶质细胞被认为会在损伤、感染或疾病发生时转变为反应性状态，以试图促进神经保护9,6,10,16。反应性是指星形胶质细胞表型发生转变，其特征表现为基因表达、分泌组、形态学以及清除细胞碎片和有毒副产物机制的改变9,10,11,17。这种反应性转变是由小胶质细胞释放的诱导信号所触发的，小胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，也是损伤和疾病发生时的第一响应者9。星形胶质细胞和小胶质细胞均可响应炎症信号，调节自身功能，并转导炎症信号，从而直接影响神经炎症过程9,10。然而，帕金森病的慢性特性导致反应性星形胶质细胞逐渐对神经元产生毒性，并进一步促进神经退行性变和疾病病理进展6,9,10,18,19。值得注意的是，最近研究已证实，在动物模型中阻断星形胶质细胞向反应性神经毒性表型的转化，可防止帕金森病的进展11。因此，在神经炎症的研究范式中，星形胶质细胞的反应性已成为帕金森病研究的主要焦点，同时也与多种中枢神经系统疾病密切相关。这些发现共同揭示了星形胶质细胞在帕金森病发病机制中的重要作用，凸显了建立能够准确模拟参与帕金森病的人类星形胶质细胞表型的研究模型的必要性。

在胚胎大脑中，神经元首先出现，而星形胶质细胞系（即星形胶质细胞和少突胶质细胞）则在发育后期才出现6。体内和体外研究表明，多种信号通路似乎调控着神经前体细胞从神经元向星形胶质细胞衍生物的分化潜能。特别是JAK/STAT、EGF和BMP信号通路在星形胶质细胞的增殖、分化和成熟过程中发挥重要作用20,21。这些通路已成为体外从多能干细胞（包括hiPSC）诱导生成星形胶质细胞方案的研究重点6,22,23。已有许多成功从hiPSC诱导生成星形胶质细胞的实例6,24,25。然而，显然中枢神经系统（CNS）内的体内星形胶质细胞具有特定的区域特性，这些特性与其功能直接相关，并符合其与特化邻近神经元之间相互作用的特定需求17,24,25,26。例如，针对腹侧中脑区域的研究表明，该区域的星形胶质细胞表达特定的蛋白组合，包括多巴胺受体，从而能够与局部的中脑多巴胺神经元进行通信26。此外，腹侧中脑星形胶质细胞表现出独特的信号特性26。因此，为了研究腹侧中脑星形胶质细胞在帕金森病中的作用，我们需要建立一种能够反映其独特特性的体外模型。

为解决这一问题，我们开发了一种从人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成腹侧中脑星形胶质细胞（vmAstros）的实验方案。所获得的vmAstros表现出与其体内腹侧中脑对应细胞相似的特征，例如表达特定蛋白以及具备免疫调节功能。本研究结果基于NAS2和AST23两种hiPSC细胞系的分化实验，这两种细胞系由Tilo Kunath博士团队建立并赠予我们27。NAS2来源于一名健康对照个体，而AST23则来源于一名携带α-突触核蛋白（SNCA）编码位点三倍重复的帕金森病患者。这些hiPSC细胞系此前已被表征，并应用于多项已发表的研究论文中，包括用于生成多种神经细胞类型27,28,29,30,31。

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方案

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1. 人源 hiPSC 细胞系的复苏、维持与冻存

  1. 进行hiPSC培养板包被时，将玻连蛋白用PBS稀释至5 µg/mL（1:100），每10 cm2细胞 培养板表面积加入1 mL，室温孵育1小时。
  2. 去除玻连蛋白后，立即向培养板中加入hiPSCs/培养基。
    注意：去除玻连蛋白时，必须确保培养表面不干燥。
  3. 解冻hiPSCs时，从液氮中取出含有hiPSCs的冻存管，放入37 °C水浴中，直至内容物完全解冻。
  4. 准备9 mL预热的细胞培养基（例如E8或E8 Flex），其中含1x细胞添加剂（例如Revitacell）。将1 mL逐滴加入冻存管内容物中。将剩余的8 mL培养基放入15 mL离心管中，再将冻存管中稀释后的细胞悬液加入其中。
    ​注意：切勿吹打混匀内容物。
  5. 以150 x g离心3分钟。吸除上清液时避免扰动细胞沉淀，然后用适量含1x细胞添加剂（例如Revitacell）的细胞培养基（例如E8或E8 Flex）重悬细胞。例如，每6孔板每孔使用2 mL。
  6. 将重悬的hiPSCs加入玻连蛋白包被的培养皿中，置于37 °C/5% CO2培养箱中。
    注意：hiPSCs应在解冻后30分钟至2小时内开始附着于玻连蛋白包被的器皿表面。
  7. 在细胞培养基（例如E8或E8 Flex）中维持hiPSCs培养。每日通过更换培养基进行换液。每次换液前务必预热培养基30分钟。
    注意：若使用E8 Flex，hiPSCs无需每24小时更换培养基，可根据需要将换液间隔延长至48小时。E8 Flex与E8培养基均可获得同等高质量的hiPSC培养效果。hiPSCs在解冻后应至少培养14天，方可开始分化步骤。解冻后培养时间少于14天可能对hiPSCs在初始分化阶段的存活产生不利影响。当hiPSCs融合度达到约80%时进行传代（图1A：传代间隔为3-4天）。
  8. 开始操作前1小时，向hiPSCs培养物中加入1x细胞添加剂（例如Revitacell）。
  9. 用不含钙和镁的PBS洗涤hiPSCs一次，然后加入0.5 mM EDTA（用不含钙和镁的PBS从原液稀释）。
  10. 室温孵育5分钟，或直至hiPSCs开始彼此分离，形态趋于圆形，在明场显微镜下可见每个iPSC边界更明亮。
  11. 用移液器将200 µL EDTA加至hiPSCs的局部区域。若细胞迅速脱落，在细胞层中形成清晰空隙，则表明已可收获。若细胞未迅速脱落，继续留在EDTA中，1分钟后重复检查。
  12. 准备继续操作时，轻柔去除EDTA，并用移液器以细胞培养基（例如E8或E8 Flex）轻柔洗涤hiPSCs两次。
    注意：为避免hiPSCs脱落，可倾斜培养板，并沿培养板侧壁逐滴加入培养基。
  13. 收获hiPSCs时，使用含1x细胞添加剂（例如Revitacell）的1 mL细胞培养基（例如E8或E8 Flex）。将培养基直接加至hiPSCs层上，细胞应自行脱落。如有需要，可再用1 mL培养基重复一次。
  14. 在显微镜下观察hiPSCs。理想状态下，hiPSCs应呈现相对均一的细胞团簇，如图1B所示。若hiPSCs团簇过大或大小差异显著，可用移液器将较大的团簇打散（图1B）。
    注意：切勿过度吹打hiPSCs。尽管添加剂可提高整体细胞存活率，但过度吹打会对hiPSCs培养的存活率产生负面影响。建议吹打1-4次。
  15. 使用血清移液管，将hiPSC悬液转移至按步骤1.1准备的玻连蛋白包被的培养板中。将hiPSCs培养物放回37 °C/5% CO2培养箱。
    注意：在融合度约80%时进行hiPSCs的冷冻保存。
  16. 开始操作前1小时，向hiPSCs培养物中加入1x细胞添加剂（例如Revitacell）。
  17. 使用0.5 mM EDTA按照步骤1.4所述方法从培养板上解离hiPSCs，并用含1x细胞添加剂（例如Revitacell）的细胞培养基（例如E8或E8 Flex）收集细胞。以150 x g离心3分钟。
  18. 用细胞冻存液重悬沉淀的hiPSCs（见材料表）。每10 cm2培养面积使用700 µL，相当于每6孔板每孔对应1支冻存管。
  19. 将冻存管转移至合适的细胞冻存容器中（详情见材料表）。
  20. 将冻存容器转移至-80 °C冰箱中冷冻24小时。24小时后，可将冻存管转移至液氮（-196 °C）中进行长期保存。

2. vmAstro 分化方案

注：vmAstros 分化方案的示意图总结见图1A。本方案所需试剂及其制备方法的详细列表见表1。

  1. vmNPCs的诱导
    注意：本方案已优化为至少从 6 孔板（10 cm）的 1 个孔开始进行2) 70%-80% 汇合度的 hiPSCs，约为 4-5 x 104 细胞/厘米²2 (图1B)30起始细胞数量和密度必须针对每种hiPSC细胞系进行优化，因其对细胞存活率和分化效率具有显著影响。
    1. 从hiPSCs中移除细胞培养基，用DMEM/F12 + glutamax洗涤3次。将培养基替换为2 mL vmNPC诱导培养基（N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189。参见 表1 有关培养基和试剂制备的详细信息）。
    2. 每隔一天换液，24小时后进行半量换液，48小时后进行全量换液。
      ​注意：培养 3-4 天后，vmNPC 细胞需要传代。建议采用 1:3 或 1:4 的标准传代比例——此比例需根据所使用的每种 hiPSC 细胞系进行优化。
    3. 传代前1 h，向vmNPCs中加入1×细胞添加剂（例如Revitacell），并准备经1×基底膜基质（例如Geltrex）包被的组织培养级塑料培养器皿第2.2节 准备基底膜基质并包被组织培养塑料器皿).
    4. 从vmNPCs中移除培养基，用D-PBS洗涤2次。每10 cm²加入1 mL预热的细胞解离溶液（例如Accutase）。2 培养面积（每孔1 mL，6孔板）。
    5. 37 °C 下放置 1 分钟，然后使用相差显微镜观察 vmNPCs。
      ​注意：vmNPCs 细胞将开始变圆，突起回缩，细胞层中会出现间隙。这一过程根据细胞密度不同，可能需要 1–3 分钟。
    6. 当vmNPCs呈现此形态时，向vmNPCs层中加入100 µL细胞解离溶液（例如Accutase）。
      ​注意：如果腹侧中脑神经前体细胞（vmNPCs）已准备脱落，细胞层上会出现一个孔洞。如果未出现此现象，则vmNPCs需要继续与细胞解离液共同孵育。
    7. 如果vmNPCs容易脱落，则轻轻移除细胞解离溶液，并用N2B27培养基将vmNPCs洗涤2次。沿培养孔或培养容器壁轻轻加入N2B27培养基，并轻轻摇晃以洗涤，确保vmNPCs不发生脱落。
      ​注意：此步骤必须快速完成，以确保vmNPCs不会重新附着到细胞表面。如果在洗涤步骤中vmNPCs开始脱落，需在150 x g条件下通过离心收集 g 3 分钟。传代时，vmNPCs 不进行常规离心，因为离心可能降低其存活率。
    8. 最后，使用移液器将含有1倍细胞添加剂（如Revitacell）的vmNPC诱导培养基猛烈吹打至细胞层表面，以去除vmNPC。所得vmNPC可直接转移至新的基质包被培养容器中。
      注意：不要重复使用已含有重悬vmNPCs的培养基来进一步去除细胞，否则会导致过度吹打，降低细胞存活率。
    9. 更换至 37 °C/5% CO₂ 培养箱中2 培养箱。vmNPCs 应在 20–30 分钟后开始贴附于基质包被的表面。24 小时后，更换一半培养基为新鲜的 vmNPC 诱导培养基（不含细胞添加剂），并继续按照之前的喂养方案进行。
    10. 继续培养和传代培养10天。
  2. 制备基底膜基质并包被组织培养塑料器皿
    注意：维持vmNPCs时，使用1x基底膜基质（例如Geltrex）包被器皿；维持vmAPCs或vmAstros时，可使用0.25x基底膜基质。
    1. 从-80 °C冰箱中取出基底膜基质原液，置于4 °C冰箱中过夜解冻。
    2. 用预冷的 DMEM/F12 + glutamax 将溶液按 1:10 稀释，分装后于 -80 °C 保存，作为 10x 储存液。
    3. 包被塑料器皿时，将该10倍浓缩液用预冷的DMEM/F12 + glutamax稀释至1倍（用于vmNPCs）或0.25倍（用于vmAPCs或vmAstros）。
    4. 立即加入组织培养塑料器皿中，每10 cm²加入1 mL2例如，6 孔板每孔 1 mL。
    5. 37 °C孵育1小时。在准备加入培养基/细胞之前，不应将基底膜基质溶液从塑料器皿上移除，以确保包被的塑料器皿不会干燥。接种细胞前，无需洗涤基质包被的培养板。
  3. vmNPCs的扩增
    1. 在方案的第10天，将诱导培养基更换为vmNPC扩增培养基（N2B27 + GDNF + BDNF + 抗坏血酸。参见 表1 有关培养基和试剂制备的详细信息）。
      注意：vmNPCs 不需要添加有丝分裂原即可诱导增殖。BDNF、GDNF 和抗坏血酸有助于 vmNPCs 的存活与维持。30.
    2. 每隔一天换液，24小时后进行半量换液，48小时后进行全量换液。
      注意：培养 3-4 天后，vmNPC 培养物需要传代。传代时建议采用 1:3 或 1:4 的标准传代比例（该比例需根据所使用的每种 hiPSC 系进行优化。应确定能够获得最佳存活率、增殖能力及 vmNPC 生成效果的传代比例）。
    3. 传代前1 h，向vmNPCs中加入1×细胞添加剂（例如Revitacell），并提前准备好1×基质包被的培养板/培养瓶（第2.2节 制备基底膜基质并包被组织培养塑料器皿将细胞解离溶液（例如 Accutase）预热至 37 °C。将含有 1x 细胞添加剂（例如 Revitacell）的新鲜 vmNPC 扩增培养基预热。
    4. 从vmNPCs中移除培养基，用D-PBS洗涤2次。每10 cm²培养面积加入1 mL细胞解离液（例如Accutase）。2 培养面积（每孔1 mL，6孔板）。置于37 °C环境1分钟，随后使用相差显微镜观察vmNPCs。
      注意：vmNPCs 细胞将开始变圆，细胞突起会回缩，细胞层中会出现间隙。这一过程所需时间取决于细胞密度，通常为 1–3 分钟。
    5. 当腹侧中脑神经前体细胞（vmNPCs）呈现圆形时，向vmNPCs细胞层加入100 µL细胞解离溶液（例如Accutase）。
      注意：如果腹侧中脑神经前体细胞（vmNPCs）已准备脱落，细胞层中会出现一个孔洞。如果未出现此现象，则需要使用细胞解离溶液进一步孵育 vmNPCs。
    6. 如果 vmNPCs 容易脱落，则轻轻移除细胞解离溶液并洗涤 用 N2B27 培养基洗涤 vmNPCs 两次。沿培养孔或培养容器壁轻轻加入 N2B27 培养基，并轻轻摇晃以完成洗涤，确保 vmNPCs 不发生脱落。
      注意：如果在洗涤步骤中 vmNPCs 开始大量脱落，需在 150 x g 条件下通过离心收集 g 3分钟。传代时通常不对vmNPCs进行离心，因为离心可能降低其存活率。此步骤必须迅速完成，以确保vmNPCs不会重新附着到细胞表面。
    7. 用移液器吸取vmNPCs，并用力将含有1倍细胞添加剂（例如Revitacell）的vmNPC扩增培养基直接吹打至细胞层上。此操作可使vmNPC脱落，随后可直接转移至预先制备的基底膜基质包被的培养板或培养瓶中（参见第2.2节“基底膜基质的制备及组织培养塑料表面的包被”）。
      注意： 不要重复使用已含有重悬vmNPCs的培养基来进一步去除细胞，否则会导致过度吹打，从而降低细胞存活率。
    8. 在 37 °C/5% CO₂ 条件下替换2 培养箱。vmNPCs 应在 20–30 分钟后开始贴附于基质包被的表面。24 小时后，更换一半培养基为新鲜的 vmNPC 扩增培养基（不含细胞添加剂），并继续按照之前的换液计划进行培养。
    9. 继续此喂养和传代方案共10天。vmNPCs可扩增至第50天。
  4. vmAPCs 的分化与扩增
    注意：vmNPCs 可在初始 hiPSC 阶段后的第 30 至 50 天之间成功用于生成 vmAPCs/vmAstros (图1A).
    1. 取融合的vmNPC培养物，用Advanced DMEM/F12洗涤vmNPC 3次，以去除vmNPC扩增培养基成分的残留。将培养基替换为vmAPC扩增培养基（ASTRO培养基 + EGF + LIF。参见 表1 有关培养基和试剂制备的详细信息）。
    2. 72小时传代后，vmNPC培养物的传代比例较高（1:7.5）。例如，假设vmNPCs原先维持在6孔板的一个孔中，则现在应将其传代至1个经基质包被的75 cm²培养瓶中。2 培养瓶（按前述方法包被） 第2.2节制备基底膜基质并包被组织培养塑料器皿）。使用细胞解离溶液传代，方法如前所述用于vmNPCs 第2.3节 ‘vmNPCs的扩增。
    3. 将vmNPCs重悬于适量的vmAPC扩增培养基中（每75 cm²培养瓶使用7.5–15 mL培养基）2 培养瓶。每3天或根据细胞需求完全更换培养基。
      注意：从此时起，vmNPCs 被称为 vmAPCs，应以单细胞形式传代，而非细胞簇。vmAPCs 应每 3–7 天或在细胞长满时进行传代，以避免过度汇合。此后，应使用浓度降低的 0.25x 基质包被塑料器皿（如文中所述） 第2.2节 制备基底膜基质并包被组织培养塑料器皿).
    4. 将vmAPCs扩增至第90天（从hiPSC阶段起算），并在扩增过程中的不同时间点对vmAPCs进行冻存。
  5. 由vmAPCs生成成熟的vmAstros
    ​注意：在此阶段，vmAPCs 可在 175 cm² 培养瓶中培养。2 组织培养瓶。此方法可扩展用于生成大量成熟的vmAstros。
    1. 当vmAPCs达到80%融合度时，用ASTRO培养基洗涤3次，并更换为vmAstros成熟培养基（ASTRO培养基 + BMP4 + LIF。参见 表1 有关培养基和试剂制备的详细信息）。
    2. 每3天或根据细胞需求，完全更换培养基，持续10天。
      注意：a) 此时，通过免疫细胞化学分析证实，vmAstros 已成熟，表明其具有成熟特征图 2G - 我）以及基因表达分析（论文正在撰写中）。b）成熟后立即使用的vmAstros应重新接种于新制备的基质包被表面。将vmAPCs或vmAstros在相同培养表面维持超过14天可能导致培养状态次优，细胞开始缩小甚至脱落。c）对于研究神经炎症调控的应用，在进行神经炎症刺激前72小时应去除BMP和LIF，以避免 任何 BMP/LIF信号通路之间的潜在相互作用 并诱导 神经炎症信号传导
    3. vmAstros 现可用于实验检测，例如可重新接种至盖玻片进行免疫细胞化学分析，或冻存以备后续应用（第3、4节).
      注意：在此实验步骤阶段，由于增殖速率应极低，通常无需进行传代。若此阶段细胞铺板过密，会导致增殖水平升高。若出现此情况，应进行传代并分瓶培养，以达到图示所示的细胞密度 图1F.

3. vmNPCs、vmAPCs 和 vmAstros 的冷冻保存

注意：在 vmNPCs/vmAPCs/vmAstros 达到完全汇合时进行冷冻保存。

  1. 开始前1小时，向培养物中加入1×细胞添加剂（例如Revitacell）。将冷冻储存罐（见材料表）在室温下装入异丙醇。
  2. 使用细胞解离溶液按照前述方法将细胞从培养板上解离下来，并收集于含有1×细胞添加剂（例如Revitacell）的适当培养基（N2B27或ASTRO培养基）中。在150 × g 条件下离心3分钟。
  3. 将沉淀的vmNPCs/vmAPCs/vmAstros重悬于细胞冻存培养基中（见材料表），体积如下（步骤3.3.1.–3.3.3.）：
    1. 对于vmNPCs：每10 cm2 培养面积使用700 µL，分装至1个冻存管中。
    2. 对于vmAPCs：每60 cm2 培养面积使用700 µL，分装至1个冻存管中（约相当于一个T175培养瓶的三分之一）。
    3. 对于vmAstros：用2 mL培养基重悬并计数vmAstros数量。再次离心后，根据后续实验需求，将细胞重悬于适当数量的细胞冻存培养基中（见材料表），分装至每个冻存管。考虑到冻融过程约有15%的细胞损失，解冻后接种时应多加15%的细胞数量以补偿细胞死亡。因此，相当于每cm2 接种74,750个vmAstros。解冻后的vmAstros在ASTRO培养基中维持培养72小时后再进行检测。
  4. 将冻存管放入细胞冻存盒中（详见材料表），然后将冻存盒转移至-80 °C冰箱中冷冻24小时。24小时后，可将冻存管转移至液氮（-196 °C）中进行长期保存。

4. vmAstro 表型的表征

  1. 免疫细胞化学
    1. 将100–200个13 mm玻璃盖玻片放置于铺有滤纸的玻璃培养皿中，并在干热灭菌器中灭菌。
    2. 使用无菌镊子将盖玻片转移至4孔或24孔板的孔中。在盖玻片上加入1×基质溶液（如Geltrex），每片滴加50 μL，于37 °C孵育1 h。
    3. 复苏或解冻vmAstros，用ASTRO培养基重悬并进行细胞计数。将vmAstros以每盖玻片25,000至100,000个细胞的密度接种于50 μL液滴中。
    4. 从盖玻片上移除基质，立即在培养基液滴中加入vmAstros。置于37 °C孵育30分钟，随后向孔中补充250 µL ASTRO培养基。
      ​注意：若仅进行免疫细胞化学以检测星形胶质细胞和中脑标志物的表达，可在细胞接种后24小时固定vmAstros。
    5. 通过将36%甲醛溶液按1:9比例稀释于D-PBS中，制备4%甲醛溶液。
    6. 用 D-PBS 将 vmAstros 洗涤 1 次。立即向孔中加入 4% 多聚甲醛，在室温下放置 10 分钟。
    7. 去除甲醛，替换为D-PBS。可于4 °C保存，或直接进行免疫细胞化学操作。
    8. 用 D-PBS 将盖玻片在孔板中洗涤 3 次。在含 10% 正常山羊血清、1% BSA 的 0.1% PBTx（D-PBS + 1:1000 Triton-X）溶液中室温孵育 1 小时，进行通透和封闭处理。
    9. 加入一抗（材料表在含1%山羊血清、0.1% BSA的0.1% PBTx（D-PBS + 1:1000 Triton-X）中，4 °C摇床上孵育过夜。
    10. 次日，移除一抗，用 D-PBS 洗涤盖玻片 3 次。
    11. 加入适当的二抗（材料表在含1%山羊血清、0.1% BSA的0.1% PBTx中封闭，室温避光振荡孵育1–2小时。用D-PBS洗涤盖玻片3次。
    12. 加入 DAPI 溶液（D-PBS 中含 0.1 µg/mL DAPI），室温孵育 10 分钟。用 D-PBS 洗涤盖玻片 3 次。
    13. 为固定盖玻片，取5 μL Mowiol/DABCO封片剂[12% Mowiol (w/v)、12%甘油 (w/v) 溶于0.2 M Tris (pH 8.5)，并加入25 mg/mL 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷 (DABCO)，搅拌过夜]滴加至载玻片上。用镊子小心从孔中取出盖玻片，用纸巾轻蘸盖玻片边缘以去除多余液体，然后将vmAstros面朝下置于Mowiol/DABCO液滴上。
    14. 对每个盖玻片重复上述操作，并在显微镜检查前静置干燥8小时。
  2. 细胞因子处理后vmAstros分泌IL-6的ELISA检测
    注意：在使用 BMP4 和 LIF 培养成熟 10 天后，应将 vmAstros 进行传代、计数，并接种至经 0.25x 基质包被的组织培养塑料器皿上（具体步骤详见 第2.2节 制备基底膜基质并包被组织培养塑料器皿)，密度为每平方厘米65,000个vmAstros2 在ASTRO培养基中。在细胞因子处理前72小时应去除BMP4和LIF，因为这些因子的活性信号可能干扰细胞因子处理的效果。 Alternatively，可将冻存的vmAstros解冻后直接用于实验检测。
    1. 在检测当天，用非氧化还原培养基（DMEM/F-12 + glutamax + N2）轻柔洗涤vmAstros 3次。
    2. 使用未经处理的对照组和细胞因子处理组进行比较。加入经优化浓度的选定细胞因子。数据在 图2J - L 使用3 ng/mL的IL-1α生成9 在非氧化还原介质中，每10 cm提供1 mL2 细胞培养区
    3. 在37 °C、5% CO₂条件下更换vmAstros培养基2 孵育24小时。24小时后，将培养基收集至无菌微量离心管中。
    4. 如果ELISA不能立即进行，需将微量离心管浸入液氮中快速冷冻培养基样品，并于-80 °C保存以备后续分析。
      注意：以下实验方案专为与本文所述的IL-6 ELISA试剂盒配合使用而优化 材料表新ELISA试剂盒中提供的抗体和标准品以冻干粉形式提供，首次使用前需重新溶解，并分装以备后续使用。试剂盒附带的数据表详细说明了重新溶解所需的试剂及体积。捕获抗体必须用不含载体蛋白的PBS溶解。
    5. 以96孔板形式进行ELISA实验，并根据所用孔数计算各试剂的体积。在ELISA实验当天，用PBS将捕获抗体原液稀释1:120，配制工作液。每孔加入50 µL捕获抗体溶液，以封板膜覆盖，室温孵育过夜。
    6. 次日，用含0.05% Tween-20的D-PBS洗板3次，每次每孔100 µL。吸干。
    7. 每孔加入 150 µL D-PBS/1% BSA 封闭。室温孵育至少 1 小时。按前述方法洗涤平板。
    8. 将样品置于冰上解冻（可能需要1-2小时）。按1:5比例稀释样品，加入10 µL样品和40 µL D-PBS/1% BSA。加样前对每个样品进行涡旋振荡。
      注意：进行IL-6 ELISA时必须对样本进行稀释，稀释比例应进行优化。
    9. 用 D-PBS/1% BSA 将储备液按 1:180 稀释，配制最高浓度标准品（1,000 ρg/mL）。将该最高浓度标准品进行连续 7 次梯度稀释，制备 7 个不同浓度的标准品。每次稀释后充分涡旋混匀。
    10. 向各孔中加入50 µL标准品/样品。以D-PBS/1% BSA作为空白对照。在室温下于旋转摇床上孵育2小时，以充分混匀稀释的样品。 按前述方法洗涤平板。
    11. 用 D-PBS/1% BSA 将检测抗体原液按 1:60 稀释，每孔加入 50 µL。盖好板，室温孵育 2 小时。 按所述方法洗涤平板。
    12. 用D-PBS/1% BSA将链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（Strep-HRP）原液按1:40稀释，每孔加入50 µL，室温避光孵育20分钟。 按所述方法洗涤平板。
    13. 每孔加入50 µL TMB底物溶液以启动显色反应。室温避光孵育20分钟（或直至标准品和样品呈现蓝色）。
      注意：TMB 在 4 °C 下保存，但应于室温下使用。
    14. 加入25 µL终止液（1 M H）终止反应2SO4每孔加入并注意颜色由蓝色变为黄色。
    15. 使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度，将波长校正设置为540 nm吸光度以提高检测准确性。根据标准曲线计算各样品中的蛋白浓度。

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结果

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分化方法与进程
本文介绍了用于生成腹侧中脑星形胶质细胞（vmAstros）的方法细节以及后续表型鉴定所采用的方案。vmAstros 的生成方法包含若干明确的分化阶段，这些阶段可通过显微镜观察并根据不同的形态学特征进行监测（图 1A-F）。在无饲养层的 hiPSC 培养体系中（图 1B），通过添加特定因子诱导其向神经谱系分化（LDN193189、SB431542），并进一步导向腹侧中脑命运（CHIR99021、SHH-C24ii），从而获得 vmNPCs。vmNPCs 在形态上明显区别于 hiPSCs：vmNPCs 的形态不如 hiPSCs 圆润，呈拉长的多边形或三角形，这是神经前体细胞的典型特征（图 1B,C）。这种形态学差异从第 7–10 天开始即可明显观察到。在传代 vmNPCs 时，与 hiPSCs 类似，我们倾...

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讨论

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该方法从人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效生成腹侧中脑星形胶质细胞（vmAstros），可获得高纯度的vmAstros培养物，并可重复应用于不同hiPSC细胞系来源的vmAstros生成。本方案基于胚胎发育过程中形成中脑区域并产生星形胶质细胞所需发育事件的重现，包含三个明确阶段：1）神经腹侧中脑诱导以生成vmNPCs，2）vmAPCs的生成与扩增，3）vmAstros的成熟。

在我们先前发表的研究中，我们强调了针对每种用于生成腹侧中脑神经前体细胞（vmNPCs）的 hiPSC 细胞系，优化 CHIR99021 和 SHH(C24ii) 浓度的重要性，以确保腹侧中脑标志物的表达达到最佳状态30,31；200 ng/mL SHH (C24ii) 和 0.8 μM CHIR99021 在多种 hiPSC 细胞系中均能获得稳定且可重复的结果。然而，对于某些特定的 hiPSC 细胞系，300 ng/mL SHH (C24ii) 和 0.6 μM CHIR99021 可能更具...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作由帕金森病英国基金会项目资助（G-1402）及学生奖学金支持。作者衷心感谢沃尔森 生物成像中心在本研究中提供的支持与协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)n/an/a由Tris碱和HCl配制而成
0.5M EDTA, PH 8ThermoFisher 15575-020在D-PBS中按1:1000稀释，终浓度为0.5 mM 
1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷 (DABCO)SigmaD27802- 在Mowiol封片液中配制成25 mg/mL
13 mm 盖玻片VWR631-0149
2-巯基乙醇 (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010含有1x NEAA，但我们添加至终浓度为2x（0.2 mM）
抗坏血酸SigmaA5960200 mM 储存液，按1:1000稀释至终浓度200 µM
B27添加剂ThermoFisher17504-04450x 储存液
BSASigma5470
细胞冻存培养基SigmaC2874Cryostor CS10
细胞冻存盒Nalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860.8 mM 储存液，按1:1000稀释至终浓度0.8 µM
冻存管 SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL，按1:10,000稀释至终浓度100 ng/mL（在PBS中）
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS，不含Mg或Ca）ThermoFisher14190144pH 7.2
E8 Flex培养基试剂盒ThermoFisherA2858501
甲醛（36%溶液）Sigma47608
GeltrexThermoFisherA1413302在冰冻DMEM/F12中按1:100或1:400稀释
GlutamaxThermoFisher350500382 mM 储存液（在N2B27中按1:200稀释，在ASTRO培养基中按1:100稀释至终浓度20 µM） 
甘油SigmaG5516
人BDNF Peprotech450-0220 µg/mL 储存液，按1:1000稀释至终浓度20 ng/mL
人BMP4Peprotech120-0520 µg/mL 储存液，按1:1000稀释至终浓度20 ng/mL
人EGFPeprotechAF-100-1520 µg/mL 储存液，按1:1000稀释至终浓度20 ng/mL
人GDNFPeprotech450-1020 µg/mL 储存液，按1:1000稀释至终浓度20 ng/mL
人胰岛素溶液Sigma I927810 mg/mL 储存液，按1:2000稀释至终浓度5 µg/mL
人LIFPeprotech300-0520 µg/mL 储存液，按1:1000稀释至终浓度20 ng/mL
IL-6 ELISA试剂盒BiotechneDY206
异丙醇Sigma I9516-4L用于填充Mr Frosty冻存容器
LDN193189SigmaSML0559100 µM 储存液，按1:10,000稀释至终浓度10 nM
Mowiol 40-88Sigma324590
N2添加剂ThermoFisher17502048100x 储存液
NEAAThermoFisher1114003510 mM 储存液，按1:100稀释至终浓度0.1 mM 
Neurobasal培养基ThermoFisher21103049
正常山羊血清Vector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x 储存液，按1:100稀释至1x终浓度
SB431542Tocris161410 mM 储存液，按1:1000稀释至终浓度10 µM
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 µg/mL 储存液，按1:1000稀释至终浓度200 ng/mL
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma P7949
纤连蛋白ThermoFisherA14700在D-PBS中按1:50稀释
免疫细胞化学用抗体 公司货号宿主物种
抗S100b抗体SigmaSAB4200671小鼠；1:200
抗FOXA2抗体SCBTNB600501小鼠；1:50
抗LMX1A抗体ProSci7087兔；1:300
抗LMX1A抗体MilliporeAB10533兔；1:2000
抗LMX1B抗体Proteintech18278-1-AP兔；1:300
抗GLAST抗体Proteintech20785-1-AP兔；1:300
抗GFAP抗体DakoZ0334兔；1:400
抗CD49f抗体Proteintech27189-1-AP兔；1:100
抗MSI1抗体Abcamab52865兔；1:400
Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体 ThermoFisherA32731山羊；1:500
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体ThermoFisherA32723山羊；1:500
Alexa Fluor 568 山羊抗兔抗体ThermoFisherA11036山羊；1:500
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠抗体ThermoFisherA11031山羊；1:500

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  2. Lees, A. J., Hardy, J., Revesz, T. Parkingson's disease. Lancet. 373, 2055-2066 (2009).
  3. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
  4. Booth, H. D. E., Hirst, W. D., Wade-Martins, R. The role of astrocyte dysfunction in Parkinson's disease pathogenesis. Trends in Neurosciences. 40, 358-370 (2017).
  5. Lindstrom, V., et al. Extensive uptake of alpha-synuclein oligomers in astrocytes results in sustained intracellular deposits and mitochondrial damage. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 143-156 (2017).
  6. Crompton, L. A., Cordero-Llana, O., Caldwell, M. A. Astrocytes in a dish: Using pluripotent stem cells to model neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. Brain Pathology. 27, 530-544 (2017).
  7. di Domenico, A., et al. Patient-specific iPSC-derived astrocytes contribute to non-cell-autonomous neurodegeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 12, 213-229 (2019).
  8. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Current Opinions in Neurobiology. 20, 588-594 (2010).
  9. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
  10. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic Potential. Immunity. 46, 957-967 (2017).
  11. Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24, 931-938 (2018).
  12. Stokholm, M. G., et al. Assessment of neuroinflammation in patients with idiopathic rapid-eye-movement sleep behaviour disorder: a case-control study. The Lancet Neurology. 16, 789-796 (2017).
  13. Williams-Gray, C. H., et al. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson's disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 31, 995-1003 (2016).
  14. Gelders, G., Baekelandt, V., Vander Perren, A. Linking neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. Journal of Immunology Research. 2018, 4784268(2018).
  15. Hall, S., et al. Cerebrospinal fluid concentrations of inflammatory markers in Parkinson's disease and atypical parkinsonian disorders. Scientific Reports. 8, 13276(2018).
  16. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32, 6391-6410 (2012).
  17. Clarke, B. E., et al. Human stem cell-derived astrocytes exhibit region-specific heterogeneity in their secretory profiles. Brain. 143 (10), 85(2020).
  18. Sevenich, L. Brain-resident microglia and blood-borne macrophages orchestrate central nervous system inflammation in neurodegenerative disorders and brain cancer. Frontiers in Immunology. 9, 697(2018).
  19. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22, 832-847 (2018).
  20. Viti, J., Feathers, A., Phillips, J., Lillien, L. Epidermal growth factor receptors control competence to interpret leukemia inhibitory factor as an astrocyte inducer in developing cortex. Journal of Neuroscience. 23, 3385-3393 (2003).
  21. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H., Taga, T. Astrocyte differentiation mediated by LIF in cooperation with BMP2. FEBS Letters. 457, 43-46 (1999).
  22. Serio, A., et al. Astrocyte pathology and the absence of non-cell autonomy in an induced pluripotent stem cell model of TDP-43 proteinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 4697-4702 (2013).
  23. Gupta, K., et al. Human embryonic stem cell derived astrocytes mediate non-cell-autonomous neuroprotection through endogenous and drug-induced mechanisms. Cell Death and Differentiation. 19, 779-787 (2012).
  24. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 25(2013).
  25. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 528-534 (2011).
  26. Xin, W., et al. Ventral midbrain astrocytes display unique physiological features and sensitivity to dopamine D2 receptor signaling. Neuropsychopharmacology. 44, 344-355 (2019).
  27. Devine, M. J., et al. Parkinson's disease induced pluripotent stem cells with triplication of the alpha-synuclein locus. Nature Communications. 2, 440(2011).
  28. Chen, Y., et al. Engineering synucleinopathy-resistant human dopaminergic neurons by CRISPR-mediated deletion of the SNCA gene. European Journal of Neuroscience. 49, 510-524 (2019).
  29. Crompton, L. A., et al. non-adherent differentiation of human pluripotent stem cells to generate basal forebrain cholinergic neurons via hedgehog signaling. Stem Cell Research. 11, 1206-1221 (2013).
  30. Stathakos, P., et al. A monolayer hiPSC culture system for autophagy/mitophagy studies in human dopaminergic neurons. Autophagy. , 1-17 (2020).
  31. Stathakos, P., et al. Imaging autophagy in hiPSC-derived midbrain dopaminergic neuronal cultures for Parkinson's disease research. Methods in Molecular Biology. 1880, 257-280 (2019).
  32. Bilican, B., et al. Mutant induced pluripotent stem cell lines recapitulate aspects of TDP-43 proteinopathies and reveal cell-specific vulnerability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 5803-5808 (2012).
  33. Cordero-Llana, O., et al. Clusterin secreted by astrocytes enhances neuronal differentiation from human neural precursor cells. Cell Death and Differentiation. 18, 907-913 (2011).
  34. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128, 3585-3594 (2001).
  35. Namihira, M., et al. Committed neuronal precursors confer astrocytic potential on residual neural precursor cells. Developmental Cell. 16, 245-255 (2009).
  36. Ochiai, W., Yanagisawa, M., Takizawa, T., Nakashima, K., Taga, T. Astrocyte differentiation of fetal neuroepithelial cells involving cardiotrophin-1-induced activation of STAT3. Cytokine. 14, 264-271 (2001).
  37. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H. Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science. 284 (5413), 479-482 (1999).
  38. Nakashima, K., et al. Developmental requirement of gp130 signaling in neuronal survival and astrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 19, 5429-5434 (1999).
  39. Barbar, L., et al. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron. 107, 436-453 (2020).
  40. Barbar, L., Rusielewicz, T., Zimmer, M., Kalpana, K., Fossati, V. Isolation of human CD49f(+) astrocytes and in vitro iPSC-based neurotoxicity assays. STAR Protocols. 1, 100-172 (2020).
  41. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and alpha-synuclein dysfunction potentiate each other, driving chronic progression of neurodegeneration in a mouse model of Parkinson's disease. Environmental Health Perspectives. 119, 807-814 (2011).
  42. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha-synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 28, 7687-7698 (2008).
  43. Horvath, I., et al. Co-aggregation of pro-inflammatory S100A9 with alpha-synuclein in Parkinson's disease: ex vivo and in vitro studies. Journal of Neuroinflammation. 15, 172(2018).

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