天然膜中蛋白质的高分辨率固态核磁共振研究

摘要

本工作详细介绍了制备同位素标记的膜蛋白样品的可靠基本流程，以及如何利用现代固态核磁共振波谱技术对其进行高分辨率分析。

摘要

膜蛋白对细胞功能至关重要，因此是重要的药物靶点。固态核磁共振（ssNMR）光谱技术为研究日益复杂的生物膜中此类蛋白的结构与动力学提供了独特途径。本文介绍现代固态核磁共振光谱技术作为一种在原子尺度上研究天然脂质膜中蛋白质结构与动力学的工具。这类光谱研究得益于高灵敏度ssNMR方法的应用，即质子（¹H）检测ssNMR和动态核极化（DNP）增强的ssNMR。以细菌外膜β-桶状蛋白BamA和离子通道KcsA为例，我们展示了制备同位素标记膜蛋白的方法，并通过ssNMR获取其结构与运动信息的技术流程。

引言

在生理相关环境中研究膜蛋白的结构与运动，对传统结构生物学技术提出了挑战¹。现代固体核磁共振波谱技术（ssNMR）为膜蛋白的表征提供了一种独特的方法^2,3,4,5,6,7，长期以来已被用于研究多种膜蛋白，包括嵌入膜内的蛋白质泵⁸、通道^9,10,11以及受体^12,13,14,15。技术进步，如超高磁场>1,000 MHz、快速魔角旋转频率>100 kHz以及超极化技术¹⁶，已使ssNMR成为研究从脂质体、细胞膜乃至完整细胞等日益复杂环境中膜蛋白的有力手段。例如，动态核极化（DNP）已成为此类实验中的强大工具（参见文献^{17,18,19,20,21,22,23,24,25}）。近年来，¹H检测的ssNMR进一步提高了对膜蛋白研究的谱分辨率和灵敏度^{25,26,27,28,29}。本工作重点介绍两种参与关键生物学功能的细菌膜蛋白，即蛋白质插入和离子转运。相应的蛋白质BamA^{25,30,31,32,33}和KcsA^{23,27,28,34,35,36,37,38,39}（或其嵌合变体^10,40）已被ssNMR方法研究超过十年。

本文介绍了一种具有代表性的细菌来源膜蛋白制备及其固态核磁共振（ssNMR）表征的实验方案。该方案的各个步骤如图1所示。首先，阐述了BamA蛋白的表达、同位素标记、纯化及膜重组过程；随后，介绍了利用快速魔角旋转下的¹H检测固态核磁共振技术对膜蛋白进行表征的一般工作流程，特别是膜蛋白主链的化学位移指认；最后，详细说明了动态核极化（DNP）增强实验的基本设置与数据采集方法，该技术可显著提高固态核磁共振信号的灵敏度。

方案

1. 均一标记的²H、¹³C、¹⁵N标记的BamA-P4P5的制备

注意：尽管本方案涉及非致病性革兰氏阴性细菌的操作，但仍必须遵守基本的生物安全规程，包括佩戴护目镜、实验服、手套，并遵循机构规定的微生物操作标准流程。

1. 使用单个菌落 E. coli BL 21 Star (DE3) 菌株含有 pET11a 质粒ΔssYaeT 质粒编码 E. coli BamA-P4P5 用于接种 50 mL 含 50 的胰蛋白胨肉汤 µg/L 氨苄青霉素
2. 在37℃下培养培养物 °C，200 rpm 振荡培养至 OD₆₀₀ 达到0.6时，以2,000转/分钟离心 x g 10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL M9 中（参见 表 1) 至最大 OD₆₀₀ 0.1 的
   注意：除非另有说明，所有后续培养步骤均在上述条件下进行。
3. 培养至 OD₆₀₀ 0.5。在2,000转下离心 x g 室温下孵育10分钟。将沉淀重悬于50 mL含90% D的M9培养基中₂O（参见 表 1 最大OD值的配方）₆₀₀ 0.1。在30℃下过夜培养。 °200 rpm 条件下，C
4. 以 2,000 x g 离心培养物 g 室温下孵育10分钟。将沉淀重悬于预热的50 mL 90% D₂O M9 至最大 OD₆₀₀ 0.1。培养至OD₆₀₀ 达到1.0。
5. 以 2,000 x g 离心培养物 g 室温下孵育10分钟。准备100 mL的100% D₂O M9 培养基含有同位素富集的非富集葡萄糖和氯化铵。用 100% D 重悬₂O M9 培养基至最大 OD₆₀₀ 0.1。培养至OD₆₀₀ 达到0.7。
6. 以 2,000 x g 离心培养物 g 室温下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于500 mL的100% D₂O中。₂含同位素的M9培养基（参见 表 1) 至最大 OD₆₀₀ 0.1 的
7. 让培养物生长至 OD₆₀₀ 达到0.6–0.9时，加入1 mM异丙基-β-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-thiogalactoside, IPTG）诱导表达 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）。表达4小时后，在4,000 x g 室温下持续15分钟。

2. 纯化、复性及BamA-P4P5蛋白脂质体的形成

注意：本节所有步骤均应在通风橱中进行。离心后打开离心管时需格外小心，以避免有害气溶胶的产生。

1. 将沉淀置于冰上解冻。用20 mL预冷的缓冲液1重悬沉淀。参见 表 2 用于缓冲液。
2. 以 4,000 x g 4℃下持续20分钟 °C. 将沉淀重悬于 20 mL 冷蒸馏 H₂O. 将悬浮液置于冰上孵育10 min。
3. 以 4,000 x g 4℃下持续20分钟 °C. 用10 mL冰冷的缓冲液2重悬，并在冰上孵育30分钟。
4. 向混合物中再加入10 mL冷缓冲液2，冰上继续孵育30分钟。加入0.5%正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM），轻轻涡旋混匀。
5. 将样品置于冰上，以13 kHz超声处理，采用10秒开/10秒关的脉冲模式，直至充分破碎。随后在25,000 x g 4℃下持续20分钟 °C. 用 20 mL 缓冲液 3 洗涤三次。在 25,000 x g 4℃下持续20分钟 ˚C.
6. 将沉淀重悬于20 mL缓冲液4中。37℃孵育 °在冰上以13 kHz超声处理样品，直至澄清，采用10秒开/10秒关的脉冲模式，持续30分钟。
7. 以 25,000 x g 4℃下持续20分钟 °C. 重复步骤 2.4 至 2.6，省略蛋白酶抑制剂的添加及在 37 °C 的孵育 °C.
8. 用20 mL水洗涤沉淀，并用Buffer 3洗涤两次。在25,000 x g 4℃下持续20分钟 °C. 将悬浮液分装至1 mL微量离心管中，在台式离心机上以最大转速离心20 min。通过10% SDS-PAGE凝胶检测包涵体纯度，参见 图 2A. 纯化后的三重（BamA-P4P5）预期产量²H¹³C,¹⁵N）标记的浓度为 30 mg/L。
9. 将包涵体溶于200 µL 缓冲液 5 和 300 µL of H₂O. 加入6 M 盐酸胍（GdnCl）。用H₂O. 涡旋混合物，并在室温下孵育4小时。每隔30分钟涡旋微离心管一次。
10. 以 100,000 × g 离心 g 4℃下孵育1小时 °C. 使用 Beer-Lambert 定律通过 280 nm 测定蛋白浓度。摩尔消光系数为 117,120 M⁻¹cm⁻¹。^-1厘米^-1。如果浓度是 >100 µ用含6 M GdnCl的1×缓冲液5稀释至M浓度。将蛋白质在缓冲液6中迅速稀释10倍。室温孵育过夜。
    ​注意：超速离心时，请使用超速离心级的1.5 mL离心管。
11. 使用半天然SDS-Page凝胶测定复性效率。取两份10 µ来自步骤 2.10 的 L 等分试样，并加入 10 µL 的 Lameili 缓冲液（缓冲液 8）至每份等分试样中。将一份样品在 95 °C 下煮沸 10 分钟 °C；将另一份样品置于冰上。随后，在10% SDS-Page凝胶上以14 mA的电流运行两个样品。凝胶的浓缩胶和分离胶部分均不含还原剂和SDS。使用考马斯亮蓝染料进行蛋白质染色。预期结果如图所示 图2B.
12. 以 4,000 x g 离心样品 g 4℃下持续20分钟 °C. 使用 30 kDa 离心滤膜将样品浓缩至 8 mL 的工作体积。在 4,000 x g 4℃下持续20分钟 °C. 在 280 nm 处测定蛋白质吸光度。与步骤 2.10 相同，测定蛋白质浓度。
13. 计算脂质与蛋白质摩尔比为10:1（LPR-mol/mol）所需的脂质量。根据步骤2.12的计算结果，从氯仿储备液中取相应量的脂质加入100 mL圆底烧瓶（RBF）中。在温和的氮气流下除去RBF中的氯仿。将RBF置于高真空条件下3小时。用1 mL缓冲液7水合脂质膜。将RBF在37 ℃孵育10分钟 °C.
14. 将蛋白质混合物（来自步骤 2.12）加入圆底烧瓶（RBF）中。
15. 将步骤2.14中所得的蛋白/脂质混合物用RBF稀释至终体积50 mL，缓冲液使用含1×蛋白酶抑制剂（溶于DMSO）的Buffer 7，并在37℃孵育30 min °C.
16. 用100倍体积的缓冲液7进行透析，持续2周（使用12–14 kDa截留分子量的透析袋）。前24小时内，于室温下进行透析，每8小时更换一次新鲜缓冲液7。此后每日更换一次缓冲液，并在4 °C下继续透析 °C.

3. 填充固态核磁共振转子

1. 步骤 2.16 之后，在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 30–60 分钟，使沉淀形成。用移液器移除上清液。
   注意：以下讨论的技术已针对 3.2 mm 转子优化，但几乎适用于任何直径的转子。
2. 将样品移入转子中，并使用台式离心机轻轻离心使样品沉降。
   注意：根据样品的性状，可使用致密化工具压紧样品，或使用刮勺代替移液器将样品装入转子。
3. 重复此过程 2–3 次，直至转子填充至适当高度，并检查盖子上方是否留有足够空间，可参考致密化工具上的标记线。在平整表面上使用转子盖定位工具封闭转子。在转子底边的一半位置做标记。
   注意：新型固态核磁共振转子在底边带有持久的激光标记，用于光学检测转子旋转频率。若无激光标记，建议使用记号笔标记；因为魔角旋转（MAS）检测器已针对记号笔墨水进行了专门优化。
4. 使用放大镜检查盖子是否安装到位。

4. 通过二维¹³C-¹³C 固态核磁共振波谱对样品进行表征

1. 使用 MAS 装置的自动旋转程序，将转子插入磁体中，并将样品旋转至 10 至 20 kHz 之间的目标魔角旋转（MAS）频率，同时将样品冷却至设定温度 270 K。调节并匹配 ¹H 和 ¹³C 通道。
   注意：在选择 MAS 频率时，应避免谱图中 Cα 区域与羰基碳区域之间的化学位移差恰好等于旋转频率，即应避免满足一级旋转共振条件⁴¹。
2. 通过在 25–80 kHz 范围内调整质子通道的射频功率，优化 ¹H-¹³C 交叉极化⁴²（CP）实验。典型参数包括：¹³C 通道射频功率为 45 kHz，采集期间采用 80–100 kHz 异核 ¹H 去耦⁴³，循环延迟为 1.8–2.0 s，扫描次数为 64 次。
   1. 优化脂肪族碳信号灵敏度最大时的 CP 接触时间。
   2. 通过将初始脉冲长度乘以四（即优化一个 360° 脉冲），并调整其长度直至信号消失，从而确定 ¹³C-CP 实验中的 ¹H 90° 脉冲长度。在 CP 转移后立即施加一个矩形脉冲，并以类似方式优化 ¹³C 90° 脉冲长度。
3. 运行一个二维 ¹³C-¹³C 质子驱动自旋扩散（PDSD）类型的实验（例如 PARIS），磁化转移时间为 30 ms，用于检测残基内相关性并评估样品质量。从先前优化的 ¹³C-CP 实验中调用功率水平、接触时间和 90° 脉冲长度。间接维的采集时间设为 4–6 ms。使用平方正弦钟函数（QSIN）处理谱图；对于灵敏度较低的样品，可在两个维度上采用指数线宽展宽处理。
4. 提取孤立交叉峰的切片，并测定半高处的线宽。¹³C ppm 范围约为 0.3–1.0 的线宽表明样品有序性良好，适合进行固态核磁共振（ssNMR）表征；而线宽超过 1.0 ¹³C ppm 则提示存在构象异质性，可能影响 ssNMR 表征效果。图 3A 所示的 BamA 的二维 CC PARIS 谱即为一个有序性良好的蛋白质示例，可获得高质量谱图。

5. 通过¹H检测的3D ssNMR波谱法进行骨架归属

1. 获取二维 NH 谱图指纹
   1. 如上所述，将样品装入 1.3 mm 转子中。将转子插入磁体，以 10–20 kHz 的魔角旋转（MAS）速率旋转样品，并将样品冷却至 240–250 K 的设定温度或更低，具体温度取决于固态核磁共振（ssNMR）探头的规格。通过 MAS 单元界面，以每步 5 kHz 的增量，逐步将 MAS 频率提高至 60 kHz。
   2. 优化 ¹³C 和 ¹⁵N 交叉极化（CP）实验中的 CP 幅度、接触时间和 90° 脉冲长度。在异核通道上使用约 30–50 或 70–100 kHz 的幅度，并在 ¹H 通道上将幅度从 80–180 kHz 范围内进行调节。使用 0.7–1.2 s 的循环延迟，并结合 15 kHz 的低功率异核质子去耦⁴⁴。有关设置 CP ssNMR 实验的更多实际细节，请参见参考文献⁴⁵。
   3. 采集二维 NH 实验以评估 ¹H 分辨率。转移已优化的 ¹⁵N-CP 参数，在直接维和间接维中分别使用约 15 ms 和 25 ms 的采集时间。对于第一次 ¹H 到 ¹⁵N 的 CP 转移，使用先前优化的接触时间；对于 ¹⁵N 到 ¹H 的反向转移，使用 0.7–1.0 ms 的接触时间，以最小化残基间磁化转移。
   4. 根据样品含水量，使用 50–250 ms 的水信号抑制技术（MISSISSIPPI）⁴⁶。在两个维度上均使用平方正弦钟函数（QSIN）处理谱图。提取孤立交叉峰的切片，并测定半高宽。高质量二维 NH 谱图的一个示例²⁵如图 3B中嵌入膜的 BamA-P4P5 所示。
2. 主链化学位移归属
   1. 优化一个针对 ¹⁵N 到 ¹³Cα 的特异性 CP 实验⁴⁷。将 ¹³C 载波频率置于约 55 ppm 的 Cα 区域中心。使用 20 kHz 的 ¹³C 射频（rf）幅度，并将 ¹⁵N 幅度从 35 到 45 kHz 范围内调节，以实现向 Cα 信号的最大转移和向羰基信号的最小转移。将接触时间从 3 到 10 ms 以 1 ms 为增量进行优化。
   2. 运行三维 CαNH 实验。将先前优化步骤中确定的所有 CP 幅度、接触时间和脉冲长度转移至本实验。在间接维和直接采集维中分别使用约 10 ms 和 30 ms。在全部三个维度上均使用平方正弦钟函数（QSIN）处理谱图。
   3. 优化一维 Cα 到 CO 的 DREAM 磁化转移实验⁴⁸。首先进行 ¹⁵N 到 ¹³Cα 的特异性 CP 转移，然后在 ¹³C 通道上施加自旋锁定，将磁化从 Cα 转移到 CO。将 rf 幅度从 20 到 35 kHz 范围内调节以实现最佳转移效果，并将转移时间从 4 到 10 ms 进行优化。
   4. 运行三维 Cα(CO)NH 实验。将先前优化步骤中确定的所有射频幅度、接触时间和脉冲长度转移至本实验。在间接维和直接采集维中分别使用约 10 ms 和 30 ms。在全部三个维度上均使用平方正弦钟函数（QSIN）处理谱图。
   5. 对相应的三维 CONH 和 CO(Cα)NH 实验重复并调整步骤 1–4。利用这组四个三维实验进行连续的 Cα 和 CO 步进，完成蛋白质主链的化学位移归属，如图 4²⁸中 KcsA 的示例所示。

6. 基于¹H检测的固态核磁共振波谱法研究蛋白质动力学

1. 进行¹⁵N T₁研究时，使用先前已优化的2D NH实验，在60 kHz MAS条件下进行，并在第一次¹H至¹⁵N交叉极化步骤后加入一段弛豫延迟。采集一系列2D NH实验数据，将延迟时间从0到16 s变化，例如设置为0、2、4、8和16 s。
2. 将分辨良好的信号的归一化强度对延迟时间作图。根据公式y = exp^(-x/T1)（其中y为衰减时间x对应的信号强度），将T₁衰减曲线拟合为单指数函数。
3. 类似地，进行¹⁵N T_1rho研究时，在脉冲序列中于第一次¹H至¹⁵N交叉极化步骤之后，在¹⁵N通道上施加一段自旋锁定脉冲，射频幅度为15–20 kHz^26,49。采集一系列2D NH实验数据，将延迟时间从0变化至150 ms，并将分辨良好的信号的T_1rho衰减曲线拟合为单指数函数。图5展示了膜嵌入型K⁺通道的典型¹⁵N T_1rho数据^27,28。

7. 动态核极化

注意：以下制备步骤涉及使用商用 DNP 装置及 3.2 mm 宝石材质魔角旋转（MAS）转子（图6）²⁰。使用氧化锆转子或其他 DNP 设备可能导致 DNP 信号增强效果降低。

1. 将膜蛋白沉淀（来自步骤 3.1）重悬于 50 µL 氘代 DNP 缓冲液中（含 60% (v/v) 氘代 d8-甘油和 15 mM AMUPol⁵⁰。在 800 MHz 实验中，建议使用 10 mM NATriPOL-3⁵¹。有关 DNP ssNMR 实验的更多实际细节，请参见参考文献⁵²。
2. 在 4 °C 条件下，以 100,000 x g 离心 10–20 分钟，使沉淀形成。用移液器移除上清液。
3. 将离心转子适配器和 3.2 mm 宝石 MAS 转子组件预冷至 <4 °C。以下步骤（7.4–7.7）需尽快完成，以防止 DNP 试剂被还原。
4. 将 3.2 mm 宝石转子放入离心转子适配器中，并加入步骤 7.2 所得的蛋白脂质体悬浮液。
5. 使用 200 µL 移液枪头，小心地将重悬的膜蛋白样品沿转子内壁加入。让溶液缓慢滑至转子底部，确保不产生气泡。
6. 在 4 °C 条件下，以 4,500 x g 离心 5–10 分钟，使样品沉降至转子底部。小心移除含有过量 DNP 溶液的上清液，避免扰动细胞沉淀。重复步骤 6.4–6.6，直至转子装满。
7. 使用顶部的垫片螺钉，小心地放置聚四氟乙烯（PTFE）垫片。
8. 将转子（帽端朝下）放入转子冲压器⁵³中，并迅速浸入液氮中。让转子和样品至少冻结 30–60 秒。
9. 启动热交换装置，并将 DNP 探头冷却至约 90 K。
10. 将 MAS 单元设为手动模式，并将变温（VT）设为 135 l/h，轴承和驱动气体流量设为约 6 l/h。
11. 在 MAS 控制台中启动弹出功能。
12. 将步骤 7.8 中冷冻的样品从液氮中转移至样品捕集器，并将其放入探头中（另请参见参考文献⁵³）。
13. 在启动"插入"前，手动将探头轴承压力（Bp）调至约 500 mbar。这有助于转子稳定且安全地旋转。
14. 按照参考文献⁵³中描述的程序，将 MAS 转速提高至所需值。
15. 在进行多维实验（例如本文第 3 节所述的 2D CC 实验）之前，使用标准 1D CP 实验检测有无微波照射时的 DNP 增强效应（另请参见例如参考文献^51,54）（图 7）。

结果

图2展示了包涵体纯度（图A）和包涵体复性（图B3）的代表性凝胶结果。图2证实了¹³C,¹⁵N标记的BamA-P4P5成功纯化。

图3A 显示了一个有序性良好的膜蛋白的典型二维¹³C-¹³C 谱图，图3B 显示了一个全氘代膜蛋白的典型高质量二维¹⁵N¹H 谱图²⁵。请注意，该膜蛋白以包涵体形式表达，因此其跨膜区域也可实现全氘代。对于不以包涵体形式表达的膜蛋白，通常需要使用基于H₂O的培养基进行培养^27,55,

讨论

膜蛋白在原核和真核生物细胞关键生命功能的调控中起着核心作用；因此，从原子分辨率水平理解其作用机制至关重要。现有的结构生物学技术已极大地推动了对膜蛋白的科学认知，但这些技术主要依赖于从无膜的体外 系统中获得的实验数据。本文介绍一种实验方法，通过采用前沿的固态核磁共振技术——快速魔角旋转（fast-MAS）和动态核极化（DNP），可获得嵌入类天然膜环境中的两种细菌膜蛋白在原子水平上的结构与功能信息。该方法可广泛适用于其他细菌膜蛋白的研究。

本方案首先描述了一种高效且高纯度制备三重同位素标记BamA的稳健方法（图2A）——也可采用其他稳定的同位素标记策略。纯化过程利用表面活性剂作用与超声处理的协同效应，从BamA包涵体中去除细胞碎片。随后的复性步骤中形成BamA-LDAO胶束（图2B）。进一步添加脂质并进行透析，有助于去除LDAO及残留的表面活性剂分子，从而促进形成适用于固态核磁共振（NMR）研究的蛋白脂质体。蛋白脂质体的形成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钼酸铵	Merck	277908
氯化铵-15N	Cortecnet	CN80P50
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
苯甲酸酯酶	EMD Millipore Corp	70746-3
硼酸	Merck	B6768
溴酚蓝	Sigma	B0126
二氯化钙	Merck	499609
氯化胆碱	Sigma	C-1879
氯化钴	Merck	449776
硫酸铜	Merck	C1297
D-生物素	Merck	8512090025
氧化氘	Cortecnet	CD5251P1000
二甲基亚砜	Merck	D9170
乙二胺四乙酸	Sigma Aldrich	L6876
叶酸	Sigma	F-7876
葡萄糖 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
甘油	Honeywell	G7757
甘油 (12C3, 99.95% D8, 98%)	Eurisotope	CDLM-8660-PK
甘油（非富集）	Honeywell	G7757-1L
甘氨酸	Sigma Aldrich	50046
盐酸胍	Roth Carl	NR.0037.1
硫酸亚铁	Merck	307718
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷	Thermofisher	R0392
LB培养基	Merck	L3022
溶菌酶	Sigma Aldrich	L6876
氯化镁-六水合物	Fluka	63064
硫酸镁	Merck	M5921
磷酸二氢钾	Merck	1051080050
肌醇	Sigma	I-5125
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Acros Organics	3293702509
N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物	Merck	40236
烟酰胺	Sigma	N-3376
泛酸	Sigma	21210-25G-F
蛋白酶抑制剂	Sigma	P8849
盐酸吡哆醛	Sigma Aldrich	P9130
核黄素	Aldrich	R170-6
氯化钠	Merck	K51107104914
磷酸二氢钠-一水合物	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
十二烷基硫酸钠	Thermo-scientific	28365
氢氧化钠	Merck	1,06,49,81,000
蔗糖	Sigma Life Science	S9378
盐酸硫胺素	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
氯化锌	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1.5 mL 超速离心管	Beckman Coulter	357448
30 kDa 离心过滤器	Amicon	UFC903024
3.2 mm 宝石DNP转子及端盖	Cortecnet	H13861
3.2 mm 聚四氟乙烯插件	Cortecnet	B6628
3.2 mm 样品装填/卸载工具	Cortecnet	B6988
3.2 mm 普通壁MAS转子	Cortecnet	HZ16913
3.2 mm 普通壁MAS转子	Cortecnet	HZ09244
3.2 mm 薄壁转子工具包	Cortecnet	B136904
1.3 mm MAS转子 + 端盖	Cortecnet	HZ14752
1.3 mm 填充工具	Cortecnet	HZ14714
1.3 mm 样品装填器	Cortecnet	HZ14716
1.3 mm 端盖移除器	Cortecnet	HZ14706
1.3 mm 端盖安装工具	Cortecnet	HZ14744
透析袋 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - 黑色	Merck	HS15094