方法文章

利用免疫荧光染色评估和量化结肠黏膜中的微上皮间隙

DOI：

10.3791/62204

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2021年6月11日

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1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍一种新方法，用于可视化显示炎症结肠黏膜中跨细胞和旁细胞通透性增强的具体位置。在本实验中，我们使用一种与可固定赖氨酸葡聚糖偶联的10 kDa荧光染料，以显示结肠黏膜中的高通透性区域（HPR）。

摘要

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排列在肠黏膜上的上皮细胞形成一道物理屏障，将管腔内容物与间质分隔开来。上皮屏障功能受损与多种病理状态的发生有关，例如炎症性肠病（IBD）。在炎症性黏膜中，破坏上皮单层的表浅糜烂或微糜烂区域对应于高通透性位点。多种机制被认为参与了微糜烂的形成，包括细胞脱落和细胞凋亡。这些微糜烂通常表现为在结肠中随机分布的显微镜下上皮间隙。对这些上皮间隙进行可视化和定量分析，已成为研究肠道上皮屏障功能的重要工具。本文介绍一种新方法，用于可视化炎症性结肠黏膜中跨细胞和旁细胞通透性增强的具体位置。在本检测中，我们使用一种与可固定赖氨酸偶联的10 kDa荧光标记葡聚糖染料，以显示结肠黏膜中的高通透性区域（HPR）。结合使用细胞死亡标志物进一步发现，HPR 包含发生上皮细胞挤压/脱落的凋亡灶。本文所述方案提供了一种简单而有效的方法，用于对肠道中的微糜烂进行可视化和定量分析，这对于肠道上皮屏障受损的疾病模型研究具有重要价值。

引言

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胃肠道（GI）黏膜形成一道物理屏障，将细胞外环境与机体内部环境分隔开来，并参与营养物质、水分和电解质的吸收。肠屏障包括由糖蛋白构成的黏液层、单层上皮细胞以及其下方含有免疫细胞和基质细胞的固有层。构成物理屏障的肠上皮细胞通过多种蛋白质复合物相互连接，包括黏附连接（AJ）、紧密连接（TJ）和桥粒（DMs）。上皮屏障功能受损会增加肠道通透性，导致有害物质和病原体从肠腔易位至间质1。目前已有越来越多的疾病被发现与上皮屏障功能障碍相关，例如炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病（CD）、溃疡性结肠炎（UC）和未定型结肠炎（IC）。IBD 的发病率在全球范围内呈上升趋势，在西方国家的患病率已接近 0.5%。尽管 IBD 的病因尚不明确，但肠道壁内异常激活的免疫/炎症反应会阻碍肠上皮稳态的重建，从而直接导致上皮屏障破坏2,3,4。此外，长期患有结肠炎症的患者发生结直肠癌（CRC）的风险较高5。其他与肠上皮屏障破坏相关的病理状态还包括肠易激综合征、肥胖、乳糜泻、非乳糜泻性麸质敏感以及食物过敏6。因此，迫切需要建立实验方法，以在模拟人类疾病发生过程的动物模型中分析肠上皮屏障的完整性。

在此，我们采用一种简单技术评估了结肠上皮在炎症过程中与胃肠被动旁细胞及跨细胞通透性相关的变化。为研究大分子的透壁流动，我们测定了荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran，4 kDa）和罗丹明异硫氰酸酯标记的葡聚糖（RITC-dextran，10 kDa）在结肠囊中的被动扩散情况 离体此外，通过向肠段腔内注射荧光标记的10 kDa赖氨酸可固定葡聚糖，我们特异性地鉴定了炎症黏膜中通透性较高的区域。利用凋亡标志物及针对紧密连接蛋白的抗体，我们证实了炎症黏膜中高通透性区域与上皮细胞发生凋亡及细胞间连接结构破坏的特定区域相对应。该新技术可用于评估任何肠道上皮屏障受损模型中的上皮完整性。

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方案

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所有实验程序均经CINVESTAV实验动物护理与使用机构委员会（CICUAL）审查并批准。

1. 材料与试剂的准备

  1. 将哈特曼溶液（130 mM NaCl、28 mM 乳酸盐、4 mM KCl、1.5 mM CaCl2）预热至 37 °C，同时用 95% O2/5% CO2 混合气体持续通气。保持溶液的生理 pH 值（7.4）。
  2. 为分析被动旁细胞通透性，将 1 mg/mL 的 FITC-葡聚糖（4 kDa）和 1 mg/mL 的 RITC-葡聚糖（10 kDa）溶解于预热的哈特曼溶液中，配制工作液。
  3. 将 Alexa Fluor647 可固定葡聚糖（10 kDa）以 4 µg/mL 的浓度溶于哈特曼溶液中。将工作液储存于 15 mL 圆锥形离心管中，避光保存直至使用。
    注意：每段结肠需要 300 µL 工作液。
  4. 准备手术缝线，为每段大肠剪取两段 5 cm 长的缝线。将缝线打成未闭合的环形结。

2. 消化道的解剖与制备

  1. 在处死小鼠前 6 小时停止提供固体食物，但可自由饮水。
    注：如果可能，将小鼠置于营养凝胶补充剂中（纯化水、糖蜜、南瓜、玉米糖浆、葵花籽、小麦蛋白、植物油、食品酸、亲水胶体、电解质、玉米纤维、NIH-31M 矿物质混合物、NIH-31M 维生素混合物）。
  2. 按照机构伦理规程，将小鼠置于 CO2 室中处死，随后进行颈椎脱位。
  3. 用 70% 乙醇对腹部和胸部进行消毒。
  4. 使用剪刀在腹部中央做一切口，暴露腹膜腔。
  5. 为便于定位，通过在小肠末端（回肠末端）靠近盲肠处以及肛缘处进行剪切，分离并解剖大肠。使用手术镊子轻轻去除肠系膜，并将结肠置于 Hartmann 溶液中。
  6. 重要的是，为保持动物间的一致性，应识别相似的肠段用于评估通透性。强烈推荐使用靠近盲肠的区域。
  7. 使用带有钝头塑料套管的胰岛素注射器，轻轻冲洗结肠腔内的内容物。若粪便较硬，可借助钝头镊子小心推挤。清除粪便后，用 400 µL Hartmann 溶液清洗 3 次。
  8. 结扎近端区域（靠近盲肠的一端），并在结肠远端放置预打结的缝合环。借助带有钝头塑料套管的注射器，将含有目标探针的溶液注入肠段内。小心移除塑料套管，然后结扎远端的缝合环。
  9. 将肠段放入含 6 mL Hartmann 溶液的 15 mL 锥形管中，孵育 1 小时以评估 FITC/RITC-葡聚糖的被动旁细胞通透性，或孵育 30 分钟以分析 Alexa Fluor Fixable-葡聚糖的通透性。
    1. 将含有肠段的锥形管置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育，并避免光照。
  10. 使用 FITC/RITC-葡聚糖测量被动通透性时，在 0 和 60 分钟时从锥形管中取 100 µL 样品，转移至 96 孔板中。补充 100 µL 新鲜培养基以弥补取样损失的体积。
  11. 使用荧光酶标仪检测 FITC/RITC 样品和标准品（FITC 激发/发射：495 nm/519 nm；RITC 激发/发射：570/595 nm）。
  12. 使用 Alexa Fluor 647 Fixable-葡聚糖测量被动通透性时，取出肠道，在手术结扎线附近剪切，并切开肠段以暴露肠腔，回收含探针的溶液。用冷 Hartmann 溶液清洗肠腔 2 次。
  13. 将组织放入预先填充有最佳切割温度化合物（O.C.T.）的组织模具中。根据待切片的侧面，将组织垂直或水平放置。将样品储存在 -80 °C。

3. 免疫荧光染色

  1. 将20微米厚的冷冻切片在室温下用3.7%多聚甲醛（PFA）固定20分钟，然后用冷磷酸盐缓冲液（PBS；37 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，和1.8 mM KH2PO4）洗涤3次。
    注意：若洗涤力度过强，肠道垂直切片容易脱落。
  2. 在室温下用0.2% TX-100/PBS处理12分钟以进行透化，然后用冷PBS洗涤3次。
  3. 在室温下用0.2% BSA/PBS封闭1小时。
  4. 将一抗用封闭液稀释后，在室温下孵育1小时，然后用冷PBS洗涤3次。
  5. 在封闭液中加入二抗，室温孵育1小时，然后用冷PBS洗涤3次。
  6. 在切片上滴加封片剂，并用盖玻片封片。载玻片可在-20 °C下保存长达3个月。

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结果

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在炎症黏膜中，表浅糜烂或微糜烂会破坏上皮细胞单层的完整性，并形成高通透性区域7,8。为了评估这些情况，我们分析了葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎小鼠模型中炎症结肠黏膜的被动通透性。简言之，C57BL/6J小鼠连续5天饮用含有2.5%（w/v，40–50 kDa）DSS的饮水。该模型的特点是可诱导大肠上皮细胞损伤及上皮屏障功能障碍，从而允许管腔内抗原进入固有层。这一过程会刺激免疫系统，导致促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，进一步加重上皮损伤9。如图1A所示，经DSS处理的小鼠在5天后体重下降约12%。所有DSS处理小鼠均出现粪便隐血和腹泻。此外，结肠炎小鼠的结肠长度显著缩短，差异具有统计学意义（图1B）。因此，涵盖动物体重减轻、粪便性状、腹泻、隐血及肉眼直肠出血的疾病活动指数（DAI）在DSS处理5天后升高（图1C

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讨论

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通过平衡细胞增殖与上皮细胞凋亡所维持的上皮稳态，对于形成正常且功能完整的肠道屏障至关重要。许多临床疾病，如炎症性肠病（IBD），常伴随或表现为肠道通透性改变、黏膜炎症以及上皮稳态的破坏1。这些过程之间的相互作用目前仍存在很大争议。因此，开发新的研究方法以准确探究这些过程，是该领域的重要课题。目前已发表多种用于间接研究炎症期间肠道通透性的实验方案，例如通过上皮单层细胞测量跨上皮电阻，或在肠道类器官、小鼠肠道及肠囊中定量疏水性荧光标记探针的摄取量10,11,12,13。尽管这些方法能够表明某种物质在肠道黏膜中的吸收增加或减少，但在分析其他直接影响通透性变化的重要事件方面仍存在不足。例如，由于无法识别上皮完整性受损的具体区域，这些研究限制了对物质转运机制或影响肠道通透性的生物学功能的理解。此外，鉴于肠道通透性在不同区域可能存在显著差异，此类研...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究部分得到了 SEP-Conacyt 拨款（编号 179，授予 NV/PND）以及 Conacyt 基础科学拨款（编号 A1-S-20887，授予 PND）提供的部门研究与教育专项资金支持。我们谨向 Norma Trejo、M.V.Z. Raúl Castro Luna、M.C. Leonel Martínez、Felipe Cruz Martínez、Victor Manuel García Gómez 以及 M.V.Z. Ricardo Gaxiola Centeno 致以诚挚感谢，感谢他们提供的帮助与技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
活性 Caspase-3 抗体（1:1000）Cell signaling9664Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  抗兔抗体（1:1000）InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 抗大鼠抗体（1:1000）InvitrogenA21209
共聚焦显微镜（Leica TCS SP8x）LeicaHyD 检测器  和白光激光器
E-钙黏蛋白抗体（1:750）SigmaMABT26大鼠单克隆 Delma-1 抗体
70% 乙醇通用
可固定葡聚糖InvitrogenD22914葡聚糖，Alexa Fluor 标记，分子量 10,000，阴离子型，可固定
FITC 葡聚糖Sigma46944异硫氰酸荧光素–葡聚糖，分子量 4 kDa
哈特曼溶液PiSAHT PiSA
培养箱（AutoFlow NU-8500）Nuaire
酶标仪（Tecan Infinite 200 PRO）Tecan
Nunc F96 微孔板，黑色与白色聚苯乙烯板ThermoFisher Scientific
多聚甲醛SigmaP6148
鬼笔环肽（1:1000）InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 标记鬼笔环肽
RITC 葡聚糖SigmaR8881-100MG罗丹明 B 异硫氰酸酯-葡聚糖，分子量 10 kDa
二抗（1:10000）Jackson ImmunoResearch LaboratoriesHRP 标记二抗
缝合线通用推荐使用编织丝线和编织聚酯外科缝合线。
ZO-1 抗体（1:1000）Invitrogen40-2200兔抗 ZO-1 抗体

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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