从出生后小鼠大脑中分离原代小胶质细胞

摘要

原代细胞培养是体外研究小胶质细胞生物学的主要方法之一。本文中，我们建立了一种从小鼠出生后第1天（P1）至第4天（P4）快速、简便分离小胶质细胞的方法。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的单核吞噬细胞，在维持中枢神经系统稳态和调控炎症过程中发挥关键作用。为了在体外研究小胶质细胞生物学特性，相较于永生化的小胶质细胞系，原代小胶质细胞具有显著优势。然而，从小鼠出生后脑组织中分离小胶质细胞的效率相对较低且耗时较长。在本实验方案中，我们提供了一种快速且易于操作的方法，用于从新生小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞。该方案的整体步骤包括脑组织解剖、原代脑细胞培养以及小胶质细胞分离。采用此方法，研究人员可获得高纯度的原代小胶质细胞。此外，所获取的原代小胶质细胞能够对脂多糖刺激产生反应，表明其保留了免疫功能。综上所述，我们建立了一种简化的高效方法，可用于分离高纯度的原代小胶质细胞，从而促进多种小胶质细胞生物学研究 在体外的开展。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在维持内环境稳态中发挥关键作用，并对神经病理学刺激作出应答¹。近年来，研究人员已开展大量工作以阐明小胶质细胞的生理功能，例如在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）中的作用²。目前，通过单细胞分辨率获得的在CNS发育、衰老和疾病过程中小胶质细胞的转录谱，使我们能够更深入地理解小胶质细胞在健康和病变脑组织中的功能³。先前的研究已在阿尔茨海默病（AD）及其他神经退行性疾病中鉴定出一种与疾病相关的小胶质细胞亚型^4,5,6。该亚群通常位于淀粉样β蛋白（Aβ）沉积区域附近。在这些细胞群体中，与吞噬作用和脂质代谢相关的基因（如 Apoe、Tyrobp）被发现呈上调表达^6,7。然而，调控小胶质细胞动态分子谱变化的亚细胞过程以及细胞外和细胞内信号通路尚未完全阐明。特别是，在神经退行性疾病中导致小胶质细胞慢性活化的机制仍不清楚。因此，深入理解与小胶质细胞相关的细胞机制至关重要，因为小胶质细胞的反应明确参与了大脑发育及神经退行性病变的进展过程。

尽管已有若干体内和体外工具可用于研究小胶质细胞，但仍存在一些局限性。要常规开展如蛋白质印迹等实验以阐明细胞内信号通路，需要获得足够数量且高纯度的小胶质细胞，而技术上实现这一目标较为困难。原代小胶质细胞培养为研究小胶质细胞生物学提供了替代手段。通过基因操作后，可利用培养的原代小胶质细胞分析其吞噬能力，并评估其在炎症刺激下促炎性和抗炎性细胞因子的产生情况，以及其他生物学特性，从而深入理解其在脑内的功能⁸。本文介绍一种新方案，并逐步详细描述从新生小鼠脑组织中分离和培养原代小胶质细胞的操作流程，重点强调获得健康且高纯度原代小胶质细胞的关键步骤。

方案

所有动物实验程序均经上海交通大学动物研究委员会和实验动物护理机构管理委员会批准。已尽一切努力最大限度减少动物痛苦。

1. 培养缓冲液、培养瓶和盖玻片的准备

1. 培养基与小胶质细胞培养基：在DMEM中添加10%胎牛血清（FBS），配制普通培养基。小胶质细胞培养基则在DMEM中加入10% FBS和20% LADMAC条件培养基制成。两种培养基均需添加1%青霉素/链霉素。
   1. 制备20% LADMAC条件培养基时，收集LADMAC细胞的培养上清液，以200 × g 离心10分钟，使用0.22 µm细胞滤器过滤，分装后于-80 °C保存。
2. 消化缓冲液：将8 U/mL木瓜蛋白酶和125 U/mL DNase加入DMEM中，配制消化缓冲液。
   注意：为获得最佳效果，消化缓冲液应现配现用。根据仔鼠数量计算所需体积（每2只仔鼠使用1 mL溶液）。
3. 包被培养瓶：使用T25或T75培养瓶用于预接种分离的脑细胞。在脑组织解剖前，用2 mL（T75培养瓶使用4 mL）0.1 mg/mL多聚-L-赖氨酸（PDL）溶液包被T25培养瓶，37 °C孵育至少1小时。吸除PDL溶液，用1×PBS洗涤两次，然后在细胞培养超净台中自然晾干。
   注意：实验中使用的培养瓶规格和数量取决于新生仔鼠的数量。为尽快形成融合的星形胶质细胞层，建议每3–5个脑组织使用一个T25培养瓶，或每5个脑组织使用一个T75培养瓶。未使用的包被培养瓶可在4 °C保存一个月。为节省时间，可预先配制10×（1 mg/mL）PDL储备液，分装后于-20 °C保存，使用前用无菌1×PBS稀释。
4. 准备盖玻片：将商用玻璃盖玻片用0.1 M HCl浸泡1小时，用高压灭菌水冲洗两次，然后置于100%乙醇中保存。使用前，用镊子夹住盖玻片在火焰灯上灼烧，以去除残留乙醇。8 mm玻璃盖玻片可置于48孔板中，12 mm玻璃盖玻片可置于24孔板中。
5. 准备解剖工具：将精细剪刀、镊子和不锈钢微型小勺浸泡于75%乙醇中至少20分钟，随后置于组织培养超净台内紫外线下照射30分钟。

2. 小鼠脑组织解剖

注意：为了评估该方案的有效性，本实验使用 CX3CR1^GFP 基因敲入小鼠来示踪小胶质细胞⁹。将 CX3CR1^GFP/GFP 小鼠与 2 至 8 月龄的野生型 C57BL/6J 雌鼠交配，以获得 CX3CR1^+/GFP 小鼠，所有小鼠最初均购自商业来源。小鼠饲养于上海交通大学的特定病原体阴性（SPF）环境中，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。出生后第 1 天至第 4 天的幼鼠可用于本方案。

1. 使用手术剪将所有幼鼠断头。为尽量减少污染，用75%乙醇冲洗所有头部，并迅速放入冰上预冷的1×PBS中。同时，将消化缓冲液和共培养基置于37 °C水浴中预热。
   注意：为保持组织结构完整性，应逐只断头并分离脑组织。为防止污染，每次断头之间应将所有手术器械浸泡于75%乙醇中。
2. 使用精细解剖剪沿延髓部位剪开颅骨。将不锈钢微型勺置于脑组织切口下方，轻压以将脑组织从颅腔中挤出。将其转移至新的预冷6孔板中，每孔加入2 mL预冷的1×PBS。
3. 切除小脑和嗅球并弃去。将剩余脑组织轻柔转移至另一预冷的6孔板中，每孔含2 mL预冷的1×PBS。
   注意：每孔可放置4–5个脑组织样本。
4. 对剩余头部重复相同操作，直至收集全部组织。

3. 接种混合的原代细胞

1. 在6孔板中加入1.5 mL 1× PBS，使用弹簧剪将脑组织彻底剪碎成小块（约1 mm²）。
   注意：为减少细小碎片的产生，请勿过度剪碎组织。
2. 向每孔中加入适量消化缓冲液（每只脑组织加入0.5 mL消化缓冲液），然后将培养板置于含5% CO₂、37 °C的湿化培养箱中孵育20分钟，每10分钟轻轻摇晃一次培养板。
   注意：在孵育期间，用培养基（含10% FBS的DMEM）润湿一个70 µm细胞筛网，并将其放置于一个新的50 mL收集管上。
3. 从培养箱中取出培养板，通过向每孔加入3 mL培养基终止木瓜蛋白酶消化反应。使用1 mL移液器轻柔地吹打细胞10次。将混合液转移至15 mL离心管中，静置1分钟，可见底部形成浑浊的细胞沉淀。为去除大块团聚物和细胞碎片，小心地将细胞悬液通过70 µm细胞筛网过滤，收集滤过液至50 mL收集管中。
4. 向15 mL离心管中未完全解离的细胞沉淀中加入3 mL预热的培养基（含10% FBS的DMEM），参照步骤3.3的方法吹打10次以继续解离。静置1分钟后，将细胞悬液再次通过筛网滤入50 mL收集管中。重复此步骤一次，弃去残留的细胞碎片。
5. 将50 mL收集管中的细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以200 ×g离心10分钟。
6. 吸除上清液，将细胞重悬于5 mL培养基中。以约5 × 10⁶的细胞密度将原代细胞接种至T25或T75培养瓶中，并在湿化培养箱（5% CO₂，37 °C）中培养。此为本培养方案的第0天。
   ​注意：若使用T25培养瓶，每瓶加入5 mL培养基即可；若使用T75培养瓶，则每瓶需额外添加5 mL培养基。

4. 原代小胶质细胞的收集

1. 第二天（第1天）评估混合细胞的融合度。由于混合细胞接种密度较高，星形胶质细胞通常需要3-4天达到完全融合，之后1-2天即可收集小胶质细胞。
   注意：若次日细胞未贴附于培养瓶底部，需谨慎处理；这可能是由于细胞污染，或因消化过度或操作剧烈导致的细胞死亡所致。
2. 第2天，用3 mL预热的1×PBS洗涤培养瓶两次，然后向每个T25培养瓶中加入3-5 mL新鲜培养基（T75培养瓶加入7-10 mL）以更换培养液。弃去的培养基中含有细胞碎片及多种细胞类型，包括神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞。
3. 第4天，确认贴壁于培养瓶底部的星形胶质细胞已达到100%融合。与此同时，部分小胶质细胞松散地附着在混合细胞表面层，可通过轻轻振荡培养瓶使其从表面脱落并悬浮于培养基中。将培养基转移至新的6孔板中，此过程中即可收集富含原代小胶质细胞的悬浮细胞。随后，向原始6孔板中的细胞补充新鲜培养基，以便后续继续收集细胞。
   注意：在更换培养基前，轻敲培养瓶或在实验室摇床上以180 rpm振荡30分钟，有助于获得更多悬浮细胞。
4. 小心将6孔板放入培养箱中，使细胞贴壁。约2小时后，所有细胞将完成贴附。待细胞贴壁后，用预热的1×PBS轻轻洗涤两次，以去除细胞团块和碎片；然后每孔加入3 mL新鲜的小胶质细胞培养基。通过每2天更换一次培养基，分离得到的小胶质细胞可在体外维持超过一个月。
   注意：集落刺激因子1（CSF1）是支持小胶质细胞体外存活的重要生长因子。既往研究表明，CSF1可由LADMAC细胞系分泌，该细胞系源自小鼠骨髓细胞的转化细胞系。LADMAC条件培养基的制备方法为：将LADMAC细胞培养物在200 × g 下离心10分钟，随后将上清液经0.22 µm细胞滤器过滤。小胶质细胞培养基的配制方式为：将20%的LADMAC条件培养基加入基础培养基（含10% FBS的DMEM）中。
5. 每2-3天重复步骤4.4，持续从小胶质细胞与星形胶质细胞的混合培养基中收集小胶质细胞。继续在培养瓶中培养剩余的混合细胞，可用于每2-3天重复收获小胶质细胞，持续长达1个月。
   注意：通过收集混合培养细胞的培养基，可成功收获小胶质细胞长达50天。每次每T75培养瓶可获得约~1-3 × 10⁵个小胶质细胞。如有需要，可合并多次收集的小胶质细胞。
6. 将原代小胶质细胞用于所需的各项功能检测。

结果

在细胞接种后第7天和第35天，从CX3CR1^+/GFP小鼠中分离得到的原代小胶质细胞如图1所示。免疫荧光染色结果显示，所有IBA1阳性细胞均表达GFP信号，且不表达S100β（星形胶质细胞标志物）和CC1（少突胶质细胞标志物），表明所纯化的GFP阳性细胞确为小胶质细胞。此外，分离获得的细胞中超过95%为GFP阳性细胞，说明所分离的小胶质细胞纯度很高¹⁰。另外，为了进一步表征原代小胶质细胞在体外的功能特性，将分离的小胶质细胞分别用10 ng/mL和100 ng/mL的LPS处理24小时（如图2所示）。与对照组相比，LPS刺激诱导了小胶质细胞的活化表型，表现为CD68表达上调，并转变为具有长而分支突起的阿米巴样形态。上述结果表明，本方案所分离的原代小胶质细胞可用于至少有效的炎症相关研究。

讨论

本方案基于先前描述的方法并进行了一些修改¹¹。以下列出了提高分离小胶质细胞活力和纯度的建议。首先，在配制用于组织分离和细胞培养的缓冲液时，应注意避免污染。确保手术器械、容器和塑料耗材均为无菌状态。通常，我们在独立的组织培养超净台中进行脑组织解剖，与常规细胞培养所用的超净台分开，以避免交叉污染。其次，对于10–12只仔鼠，组织解剖和接种步骤通常需要经验丰富的研究人员耗时约1.5–2小时。虽然可以进行大规模制备，但操作时间必然延长，尤其是组织解剖所需时间。然而，为减少细胞暴露于损伤信号的时间，应尽快完成细胞分离，以最大限度地降低缺氧和缺血诱导的细胞活化。第三，在处理混合细胞培养物时应轻柔操作，避免破坏星形胶质细胞单层。此外，在分离过程中切勿剧烈摇晃培养瓶，以尽量减少小胶质细胞的过度活化。

在后续的收集步骤中，以往的方案强调机械解离可提高小胶质细胞的得率。例如，Tamashiro et al. 建议以100 rpm的转速振荡培养瓶1小时，以促进小胶质细胞从星形胶质细胞层上脱离¹²。L...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞筛，40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco by Life Technologies	14190-144
胎牛血清（FBS）	Gibco by Life Technologies	10099141
木瓜蛋白酶悬浮液	Sangon Biotech	Papain, Suspension
青霉素-链霉素 100X 溶液	Hyclone	SV30010
多聚-D-赖氨酸	ThermoFisher Scientific	A3890401