方法文章

CcCIPK14 基因功能分析揭示高效的根部转基因系统

DOI：

10.3791/62304

⸱

2021年9月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Forestry, Beijing Forestry University, 2Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文以CcCIPK14基因功能分析为例，介绍了一种高效且稳定的转化体系，为非模式植物代谢研究提供了技术基础。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高效且稳定的转化体系是植物基因功能研究和分子育种的基础。本文描述了一种由根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的木豆转化体系。利用携带双元载体的A. rhizogenes感染茎段，接种7天后诱导出愈伤组织，14天后形成不定根。通过形态学分析和GFP报告基因检测，确认获得了转基因毛状根。为进一步验证该体系的应用范围，采用此转化方法将CcCIPK14（钙调磷酸酶B类蛋白互作蛋白激酶）基因导入木豆。随后分别用茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）处理转基因植株，以检测CcCIPK14是否响应这些激素。结果表明：（1）外源激素可显著上调CcCIPK14的表达水平，尤其在CcCIPK14过表达（OE）植株中更为明显；（2）CcCIPK14-OE株系中染料木素含量显著高于对照；（3）两个下游关键黄酮类合成酶基因CcHIDH1和CcHIDH2在CcCIPK14-OE株系中的表达水平均上调；（4）毛状根转基因体系可用于非模式植物代谢功能基因的研究。

引言

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转化是评估外源基因表达的基本工具1,2。资源植物的许多生物学特性与其他植物具有共性，因此某些基因的功能研究可在模式植物（如Arabidopsis）中进行3。然而，植物中许多基因在功能和表达模式上具有独特性，需在其自身或近缘物种中开展研究，特别是对于资源植物而言尤为如此3,4。植物细胞能够感知多种信号，从而在不同环境胁迫条件下表现出特定的基因表达、代谢和生理变化5,6,7。类黄酮在植物响应环境胁迫的信号传导过程中发挥关键作用5,8,9。此外，园艺植物和药用植物中的类黄酮含量也是评价其品质的重要指标10。鉴定参与外界信号调控类黄酮合成的相关基因，对于理解植物类黄酮合成机制至关重要。已有研究表明，外源激素的施用可促进类黄酮的积累6,11。稳定的遗传转化体系及基因功能验证方法，是阐明基因功能和解析植物次生代谢途径所必需的。

农杆菌介导的转化广泛用于DNA插入5,8,9. 根癌农杆菌 可将环状基因导入植物细胞的染色体中，外源植物激素可诱导单个或少数宿主细胞再生植株，从而获得稳定的转化子12,13,14. 根癌农杆菌介导的转化方法更适用于适合的植物物种 体外 操作，而大多数多年生木本植物由于再生困难，限制了该方法的应用4,15. A. rhizogenes 也能够修饰宿主细胞的基因组16在本研究中，我们开发了一种高效且稳定的 A. rhizogenes介导的转化程序 A. rhizogenes 含有一个额外的双元质粒，该质粒携带非天然基因的 T-DNA，除了 Ri 质粒外。通过感染宿主植物，可获得嵌合植株，其野生型地上部分长出转基因毛状根。16,17。该 A. rhizogenes介导的转化系统因其快速、低成本且无需植株再生，适用于木本植物研究。已有超过160种植物成功诱导出毛状根，其中大多数属于 茄科, 菊科, 十字花科, 旋花科, 伞形科, 豆科, 石竹科，以及 蓼科18,19与……相比 A. tumefaciens, A. rhizogenes 在木豆的介导转化中表现出更高的效率17,20.

本研究以木豆为例，介绍了由A. rhizogenes介导的遗传转化过程。从接种到生根，实验共持续5周。我们通过形态学特征和GFP报告基因鉴定了不定根的转化，转化效率高达75%。此外，我们用JA和ABA处理嵌合植株，并通过实时定量PCR和高效液相色谱法（HPLC）检测转录本和次生代谢产物。结果证实，CcCIPK14基因的表达水平不仅响应JA和ABA处理，还影响黄酮类物质的生物合成。该体系适用于研究与次生代谢相关的功能基因，同时也为缺乏稳定遗传转化系统的非模式植物研究提供了新途径17,21,22。

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方案

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注意：木豆是一种二倍体豆科作物，属于Fabaceae科。本实验所用的木豆种子来自中国东北林业大学，编号为87119。本方案的主要步骤如图1A所示。幼苗培养在25 °C、高湿度环境中进行，光照条件为荧光灯下光强50 µmol光子/m-2s-1，光照周期为16小时。根瘤农杆菌（A. rhizogenes）菌株K599（NCPPB2659）由实验室保存，置于含15%甘油的酵母甘露醇培养基（YEP）中，于-80 °C保存。本研究所描述的方案基于Meng等21所报道的方案。

注意：将所有基因改造的细菌和植物放入适当的废弃物容器中。所有危险化学品须在通风橱中使用，并丢弃至危险废物容器中。

1. 鹰嘴豆幼苗的制备

  1. 选择饱满且无损伤的木豆种子（图1A），储存时间应少于1年。
  2. 将种子用蒸馏水浸泡24小时（图1B），然后将吸水膨胀的种子转移至育苗盘中，并置于温室中培养。
  3. 种子在1–2天后开始萌发。当上胚轴长至1.5 cm时，将幼苗移栽至装有土壤与沙子（体积比为3:1）的花盆中，花盆尺寸为10 cm（直径）× 9 cm（高度）。
    注：土壤由营养土、蛭石和珍珠岩按2:1:1的比例混合而成。
  4. 在温室中继续培养幼苗。

2. 根癌农杆菌（A. rhizogenes）的活化

注意：用于根癌农杆菌（A. rhizogenes）转化的菌株为保存于-80 °C的K599。双元载体pROK2（pBIN438；http://www.biovector.net/product/428388.html）含有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，以及卡那霉素抗性基因作为筛选标记，用于转化 A. rhizogenes。

  1. 将 A. rhizogenes 置于冰上解冻。
  2. 将细菌蘸取后均匀划线接种于添加了8 g/L琼脂粉、25 mg/L利福平和25 mg/L卡那霉素的酵母甘露醇培养基（YEP）上（YRK，pH 7.0）。
  3. 在28 °C条件下培养16小时。
  4. 挑选单克隆菌落，接种于含有10 mL YEB培养基的50 mL离心管中，培养基中添加25 mg/L利福平和25 mg/L卡那霉素（YRK，pH 7.0）。将离心管置于旋转半径为10 cm的摇床培养箱中，在28 °C、200 rpm条件下培养16小时。

3. 利用A. rhizogenes进行植物转化

注意：选择健康植株，使用以下注射方法接种发根农杆菌（A. rhizogenes），该方法可获得转化的毛状根。为分析 CcCIPK14 基因的功能，需设置对照。将含有空载体或 CcCIPK14-pROK2 质粒的 A. rhizogenes 溶液注射至幼苗中以诱导毛状根生成。

  1. 接种 A. rhizogenes
    1. 选取生长状态一致的木豆幼苗。
    2. 排出1 mL注射器中的空气，吸取0.3 mL菌液。缓慢推动推杆，使菌液充满注射器针头21。
    3. 先用镊子固定木豆幼苗的茎部，然后将注射器针头刺入茎部1 cm处。
    4. 拔出注射器时，将针尖完全浸入茎内。缓慢推动推杆，将菌液注入穿透伤口。
      ​注意：伤口处残留的菌液液滴有助于提高感染和转化效率。
  2. 幼苗管理
    注意：高温高湿环境可提高 A. rhizogenes 的感染效率。
    1. 将接种 A. rhizogenes 的幼苗放入盛有1 L水的托盘（30 cm × 60 cm × 6 cm）中，并用透明塑料盖（30 cm × 60 cm × 30 cm）覆盖，以维持内部环境的温湿度。
    2. 定期清除叶片尖端及掉落叶片上附着的脱落叶片和絮状菌丝。
    3. 一周后，伤口处开始出现愈伤组织。随后，将塑料盖半打开。
    4. 4–5周后，大部分愈伤组织分化为不定根。此时移除塑料盖。
    5. 每隔3天向托盘中添加1 L水，以保持土壤湿润。
      ​注意：木豆为耐旱植物；水分过多会抑制植株生长。

4. 转化毛状根的鉴定

注意：转化的毛状根可根据形态学和基因水平进行鉴定。本实验方案主要聚焦于报告基因（GFP）鉴定分析。

  1. 采集毛状根的根尖，并标记剩余部分。
  2. 在共聚焦激光扫描显微镜下观察是否存在绿色荧光。
  3. 将具有强荧光信号的0.1 g毛状根在液氮中研磨成细粉。
  4. 根据植物基因组DNA试剂盒生产商的说明书，采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取木豆独立转基因株系的基因组DNA23。
  5. 以500 ng基因组DNA为模板，使用引物进行PCR扩增。引物序列见表1。
  6. 进行如下扩增循环：94 °C预变性5 min，94 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C引物延伸30 s；经过36个循环后，72 °C终延伸10 min，将扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行分析。
  7. 用核酸染料染色凝胶，并在紫外光下观察。

5. 外源激素处理

注意：对阳性复合植株施加外源激素，以研究 CcCIPK14 对代谢的影响。由根癌农杆菌（A. rhizogenes）诱导产生的复合植株分为三组：JA 处理组、ABA 处理组和对照组（图 3A）。

  1. 在施加外源激素处理前3天减少浇水。
  2. 配制浓度均为5 mg/L的JA和ABA溶液。
    注意：JA和ABA粉末需先用乙醇溶解，再用蒸馏水定容至目标体积。
  3. 使用喷雾瓶将JA和ABA溶液均匀喷洒在植株叶片上，对照组喷洒蒸馏水。
    ​注意：每株幼苗平均喷洒10 mL溶液。
  4. 喷洒处理后立即盖上塑料盖，并将植株放回人工气候温室中。

6. 样品采集与保存

注意：外源激素处理 3 小时后，收集不同处理组的植物材料。

  1. 去除黄褐色及受污染的毛状根，挑选呈白色外观的毛状根。收集这些毛状根，并用吸水纸吸干。
  2. 将每株幼苗上收集的毛状根分为两部分。将其中一部分放入编号的试管中，并用标记好的锡箔纸包裹。
  3. 在液氮中冷冻干燥锡箔纸包裹的样品，然后将所有收获的锡箔样品于 -80 °C 保存，以备进一步分析。

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结果

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A. rhizogenes 介导的木豆毛状根转化实验
本研究描述了由A. rhizogenes介导的植物毛状根遗传转化的逐步操作流程，该技术在植物分子研究领域具有重要意义。从感染A. rhizogenes的木豆根部获得毛状根大约需要5周时间。图1A展示了整个转化过程的概览，从注射A. rhizogenes到获得带有毛状根的复合植株。感染后约1周可见增殖组织，约2周后观察到其分化为不定根，35天时产生大量毛状根（图1B）。本实验中使用的GFP标记可通过荧光信号区分转基因毛状根与非转基因毛状根。在图2中，携带GFP-pROK2的转化毛状根在共聚焦显微镜的绿色荧光蛋白通道下清晰可见。使用空载体的A. rhizogenes诱导产生的毛状根未显示绿色荧光（

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讨论

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快速鉴定基因功能是大多数物种研究中的共同目标，对于资源植物的开发尤为重要。 根癌农杆菌（A. rhizogenes）介导的转化技术已广泛应用于毛状根培养。毛状根培养体系（HRC）作为代谢产物生产的重要来源，在代谢工程中发挥着关键作用18,28。该技术的应用目前主要局限于体内（in vivo）基因功能研究21。本文在已有根癌农杆菌介导的转化系统基础上，提供了一种研究基因功能的基本方法。该方法可用于验证多种基因功能，例如对环境胁迫及外源激素的响应。过表达CcCIPK14（CcCIPK14-OE）株系显示，CcCIPK14能够促进黄酮类代谢物的积累，并响应外源激素JA和ABA。CcHIDH1与CcHIDH2是两个关键的黄酮类合成酶基因，在CcCIPK14-OE株系中显著上调。这些结果表明，该方法可作为评估基因功能及次生代谢产物的...

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披露

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作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

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作者感谢国家自然科学基金委员会（31800509，31922058）以及北京林业大学杰出青年人才基金的经费支持" （2019JQ03009）、中央高校基本科研业务费专项资金（2021ZY16）、北京市自然科学基金（6212023）以及国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2018YFD1000602，2019YFD1000605-1）及北京林业分子设计育种高精尖创新中心资助。谨此感谢侯正阳在文章撰写方面的指导，感谢董萌教授在文章构思方面的指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 mL qPCR 8联管（带光学盖）KIRGEN，中国上海KJ2541
ABASolarbio 生命科学，北京，中国A8060
琼脂粉Solarbio生命科学，北京，中国A8190
离心德国哈茨地区奥斯托罗德d37520
CFX Connect TW 光学模块Bio-rad，美国1855200
恒温培养箱上海博迅工业 &中国上海市，安普& 商务有限公司BPX-82
一次性培养皿康宁，美国
干浴器银杏生物科学公司 / Coyote Bioscience，中国H2H3-100C
Eastep 总RNA提取试剂盒50普洛麦格，中国北京LS1030
电子天平中国天津TD50020
滤纸中国杭州沃华滤纸有限公司
FiveEasy Plus梅特勒-托利多，中国上海30254105
花盆 9*9中国
JASolarbio生命科学，北京，中国J8070
KanSolarbio生命科学，北京，中国K8020
MagicSYBR Mixture中国北京，CWBIOCW3008M
迷你微型离心机Scilogex，中国北京S1010E
NaClSolarbio生命科学，北京，中国S8210
NanoPhotometer N50 Touch德国 IMPLen 公司T51082
Purelab untra
利福平Solarbio生命科学，北京，中国R8010
幼苗盒 30*200中国
热的 循环仪 PCR伯乐，美国T100
恒温振荡器北京东联哈瑞仪器制造有限公司，中国DLHE-Q200
Tomy高压灭菌器Tomy，日本SX-500
胰蛋白胨Solarbio生命科学，北京，中国LP0042
UEIris II RT-PCR系统（含dsDNase）用于第一链cDNA合成中国江苏，US Everbright INCR2028
酵母提取物粉末Solarbio生命科学，北京，中国LP0021

参考文献

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