尿液生物标志物研究中的样本采集、处理与储存注意事项

摘要

本方案旨在为尿路感染生物标志物研究中的尿液样本采集、处理和储存提供参考建议。

摘要

有多种尿液蛋白质在作为尿路感染新型标志物方面展现出良好前景。相较于当前的诊断方法，发现一种具有更高预测准确性的新型生物标志物，有望显著提升对尿路感染患者的管理能力。然而，样本的采集、处理和储存均可能影响生物标志物研究的结果。充分理解上述各个环节对生物标志物研究的影响，对于推动该领域未来高质量研究的开展，以及对现有研究进行严谨评估至关重要。本文综述了尿液样本处理各阶段对尿液蛋白质影响的相关文献，并报告了不同条件对尿液蛋白质的影响。本实验方案将重点关注采集技术、储存的时间与温度、处理方法、试剂使用以及长期冷冻对生物标志物稳定性的影响。内容将以蛋白质为主，同时简要讨论生物标志物研究中可能涉及的其他物质。通过上述内容，本方案将为未来的研究人员提供指导，以协助其设计尿液生物标志物相关研究。

引言

尿路感染（UTI）是儿童和成人中最常见的细菌感染之一¹。尽管在某些人群中UTI的诊断较为简单，但在其他人群中可能更为复杂，例如患有神经源性膀胱的患者²。准确诊断UTI的能力将有助于通过减少不必要的抗生素使用来改善抗生素管理，并可能促进UTI的早期诊断，从而降低发病率风险。鉴于UTI的高发性，目前在改善这一常见感染的管理方面存在广泛的关注。

目前文献中出现了越来越多具有诊断尿路感染（UTI）潜力的新生物标志物^3,4,5,6,7。然而，尿液样本处理过程中存在多种可能影响检测结果的因素。这些因素包括样本采集方法、短期和长期储存的温度与时间、处理技术、试剂使用以及冻融循环次数⁸。了解上述各项条件的变化如何影响生物标志物的检测结果，对于批判性地解读现有文献中的研究，以及设计高质量的尿液生物标志物相关研究均至关重要。

本文对文献进行了叙述性综述，阐述了各种因素对可能作为尿液生物标志物的蛋白质的影响，这些因素包括样本采集技术、短期和长期储存的温度与时间、试剂使用情况以及冻融循环的影响，并基于该文献综述提出了最佳处理建议。本实验方案将重点讨论通过蛋白质印迹法（Western blot）或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的蛋白质生物标志物。

方案

本方案遵循机构人类研究伦理委员会的指导原则。在收集和利用生物样本进行研究之前，须获得机构审查委员会（IRB）的批准。

1. 收集

1. 使用无菌样本杯采集尿液样本。根据具体的研究设计，确定尿液样本的类型以及特定的纳入和排除标准。对于尿路感染（UTI）研究，应采用清洁中段尿法或导尿法，以避免会阴部污染。
2. 采集清洁中段尿样本时，指导受试者先用擦拭巾清洁尿道口周围区域，排尿时先排出少量尿液至马桶中，随后将中段尿液排入样本杯。
3. 指导女性受试者在排尿前用手指分开小阴唇，男性受试者（如适用）回缩包皮，以避免样本污染。
4. 记录样本采集时间。
5. 根据各研究设计和研究问题的要求，收集每位受试者的相关临床数据。
6. 若电子健康记录中无法可靠获取相关数据，建议在样本处理和储存前对每份样本进行尿液分析或尿液试纸条检测。

2. 样品处理与保存

1. 立即处理样本。若无法做到，则将样本在 4 °C 下保存不超过 24 小时。
2. 若样本无法在 4 °C 下保存，或需在 4 °C 下保存超过 24 小时，请向样本中添加 0.2 M 硼酸或 10 mM NaN₃。请确认所用试剂与后续计划的实验应用兼容。
3. 记录样本在 4 °C 下存放的持续时间。
4. 在 1000–1500 × g 条件下离心 10–20 分钟。离心过程无需在 4 °C 下进行。
5. 收集上清液，并分装至不同的微量离心管中。
6. 使用多个清晰可辨的标识（如日期和样本编号）标记试管。建议使用专为 -80 °C 生物样本储存设计的计算机生成条形码。若不可行，请确保用于标记样本的笔具有防水性。
7. 对每个冻存盒进行标记，使每个位置具有特定代码。为此，可用不同字母标记每一列，用数字标记每一行。这将有助于创建样本位置图或其他指引工具，便于快速定位样本。
8. 立即在 -80 °C 下冷冻样本，并记录冷冻时间。
9. 在检测当天，将样本置于 37 °C 水浴中解冻，以尽量减少在室温或 4 °C 下不必要的存放。
10. 记录每一份样本分装物经历的额外冻融循环次数及相应时间。

3. 分析

1. 使用商用ELISA试剂盒时，请遵循制造商提供的说明书。
2. 样本应设置复孔进行检测。
3. 明确目标蛋白的预期浓度，以确保样本中蛋白水平处于试剂盒检测范围内。若预期蛋白浓度超过标准品最高浓度，需对样本进行稀释。
4. 从酶标仪（ELISA）或蛋白质印迹实验获得数据后，可手动（不推荐）或使用任意软件计算样本中各生物标志物的浓度。
5. 分析结果。数据分析方法取决于具体的研究设计。
6. 建议根据尿液浓度对生物标志物数值进行校正。
   注：传统上，生物标志物研究者常采用尿肌酐作为归一化方法，特别是在肾功能正常的受试者中，以校正尿液浓度差异。然而，也有研究报道归一化处理对结果并无显著影响⁴。为克服这一问题，部分研究者同时报告归一化和未归一化的结果。
7. 建议在发表的论文中报告样本采集至冷冻保存的时间范围，以及处理前在4 °C条件下保存的持续时间，以便结合样本处理流程对结果进行解读（图1）

4. 不同储存条件对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的影响。

1. 用2 ng/mL的重组NGAL对新鲜尿液进行加标。
2. 将尿液分装，并置于不同的处理和储存条件下。
   1. 在1000–1500 × g 条件下离心10–20分钟。离心过程无需在4 °C下进行。将样品在不同温度（20 °C、4 °C、-20 °C）下分别保存24小时、48小时或72小时。
   2. 将部分样品分装后于-80 °C保存，用于比较。
3. 在按照步骤4.2.1所述条件保存样品后，使用市售的ELISA试剂盒（包含生产商说明书中的对照品）检测各样品中NGAL的水平。

结果

离心对NGAL水平的影响较小。在-80 °C保存的离心样本中，NGAL水平低于未离心样本（2.17 ng/mL ± 0.32 ng/mL，2.77 ng/mL ± 0.21 ng/mL）。冻融循环也对NGAL水平产生影响，尤其在第三次冻融循环后尤为明显。（图2）在所研究的条件（离心、冻融循环和保存温度）中，保存温度对NGAL水平的影响最大。样本采集后立即在-80 °C保存是最佳的样本保存方法。其他各种保存条件下NGAL水平均出现变化，其中在室温（20 °C）保存的样本NGAL水平变化最为显著。（图3）

综上所述，这些结果表明，所测得的蛋白质水平可能因样本处理方法的不同而有所差异，这不仅强调了采用一致且可靠的实验方案以获得可重复结果的重要性，同时也凸显了针对各个生物标志物评估本文所分析参数的必要性。

讨论

获得一致且可重复结果的重要性不仅关系到单个研究的成功，还将有助于在文献中更好地比较研究结果⁹。不同研究在关键操作步骤上的差异可能引入不可逆的偏倚，从而影响生物标志物信号及其解释，这可能是导致多项研究之间结果不一致的原因之一¹⁰。这表明有必要建立更为标准化的尿液样本处理方法，以用于生物标志物研究。

大多数尿液生物标志物研究的研究设计将决定尿液采集的时间和方法。然而，在采用非时间敏感性方法检测生物标志物时，我们建议避免采集首次晨尿样本。尽管首次晨尿因其浓度较高而被认为能提供信息最丰富的尿液谱型，但这类样本并不适合用于尿液生物标志物的测定，因其容易受到细菌和上皮细胞污染。对于女性尿液样本尤其如此：女性初段尿与中段尿的比较显示，两者在蛋白质组成上存在显著差异¹¹。因此，第二次晨尿或随机中段尿更适合用于蛋白质生物标志物的研究¹²。尿液采集方法通常也由研究设计决定。我们推荐使用清洁中段尿（clean ca...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硼酸	Sigma-Aldrich	B6768	适用于无法快速处理并冷冻的样本
冻存盒	Fisher Scientific	03-395-464
微量离心管	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA 试剂盒	R&D Systems	DLCN20	用于生成代表性结果
移液器及吸头	根据移液器规格和液体体积选择
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	适用于无法快速处理并冷冻的样本
尿液收集杯	Thermo Scientific	3122B03ORG	除非其他研究需要，否则无需无菌杯