方法文章

基于微珠运动的三维生物膜材料异质性分析计算框架

DOI：

10.3791/62454

⸱

2021年6月22日

 , 
1Sol Sherry Thrombosis Research Center, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 2Department of Mathematics, Temple University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种用于分析和量化1 µm羧基微珠在异质性细菌生物膜中运动模式的方法。通过比较运动模式，可定量评估生物膜材料性质的差异。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

不同细菌物种的生物膜、同一物种在不同培养条件下形成的生物膜以及经基质修饰分子处理后的生物膜，其材料特性存在差异。为更准确地量化三维生物膜的材料特性，开发并应用了一套实验与计算相结合的工作流程，用于分析这些生物膜之间的差异 粪肠球菌，肠沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌和 大肠杆菌 生物膜以及淀粉样纤维curli在赋予肠杆菌科生物膜刚性结构中的作用。在20 µm厚的三维生物膜中，对1 µm羧化微珠在20分钟内的时空动态进行了追踪。利用ImageJ中的Mosaic插件处理4D图像序列，生成微珠运动的3D轨迹数据。该轨迹数据通过新开发的Bead Evaluator工具箱进行分析，计算并存储了包括轨迹寿命、微珠速度、轨迹沿线的细胞密度以及边界框信息等运动参数，并保存为csv文件。本文介绍了从实验设计、图像采集到微珠轨迹计算与分析的完整工作流程。含有curli的生物膜结构导致微珠相互作用更稳定，微珠运动程度低于curli突变株和肠球菌生物膜。在测量微珠速度及轨迹边界框体积时，微珠运动未表现出对细胞密度的显著依赖性，支持了生物膜的其他材料特性调控微珠动力学的假设。该技术可广泛应用于不同基质组成生物膜之间，以及基质修饰处理前后生物膜差异的定量分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细菌生物膜作为人体微生物群的一部分普遍存在，并持续与各种分子相互作用。这些分子的尺寸范围从1 nm的抗生素和1-3 mm的细菌，到胃肠道中的较大纤维颗粒。单物种或多物种生物膜的组成会影响其材料特性，从而影响颗粒在生物膜中的运动模式1,2,3,4,5。一个例子是细菌淀粉样蛋白，其具有保守的纤维状交叉β折叠结构6。肠杆菌如大肠杆菌（Escherichia coli）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）血清型Typhimurium可表达淀粉样蛋白curlin，且相关基因已在多个其他细菌门中被检测到7。生物膜的多种材料特性受到curlin的影响8,9。curlin可直接与其他基质成分相互作用，例如胞外DNA（eDNA）和纤维素10,11。curlin包裹在细胞周围，影响细胞膜的刚性12以及生物膜整体的黏弹性特性13。curlin通过与纤连蛋白结合，增强拉伸强度，从而提高生物膜对玻璃表面的牢固附着能力14。进入的噬菌体可结合curlin，限制噬菌体对生物膜的侵入15。

使用多测试涂层载玻片分析约 20 µm 厚的样本时 粪肠球菌, E. coli，以及 S. 使用共聚焦显微镜观察鼠伤寒沙门氏菌生物膜，可观察到显著差异 E. coli, S. Typhimurium10,16 和 E. faecalis 生物膜（本研究）可被观察到。尽管 肠杆菌科 物种生物膜具有较高的刚性，细胞密度较低的区域易于成像，可获得清晰的高分辨率图像 E. faecalis 使用线平均和帧平均成像生物膜时，需对载玻片施加压力，以产生足够的表面张力，确保成像过程中细胞的稳定性。诸如 curlin 之类的细菌淀粉样蛋白可形成高度有序的结构，提示其可能具有相对较高的刚性。17这促使我们提出假设：淀粉样curli可能在诱导僵硬性 E. coli 和 S. Typhimurium 生物膜。没有明确证据表明 E. faecalis 在所研究的条件下表达淀粉样蛋白。Esp 蛋白是一种与更具致病性菌株相关的菌毛蛋白基因 E. faecalis最近被发现能够产生淀粉样结构18；然而，通过 blastn 和 blastp 搜索，在该样本中未检测到此基因 E. faecalis 用于本研究的共生型标准菌株 OG1RF。该菌株产生的信息素 cOB1 可形成类淀粉样结构19然而，根据先前用于生物膜生长条件和淀粉样蛋白检测的方法 S. 鼠伤寒沙门氏菌淀粉样蛋白染色10 在 E. faecalis OG1RF 淀粉样蛋白无法被检测到（数据未显示）。开发了一种新的四维（4D）成像技术，用于比较黏性物质之间的整体材料特性 E. faecalis, E. coli 和 S. 鼠伤寒沙门菌以及利用肠杆菌科细菌的淀粉样突变体来确定淀粉样物质对肠杆菌科生物膜形成的贡献 S. 伤寒沙门氏菌和 E. coli.

过去，荧光微珠已成功用于通过微流变学在二维（2D）条件下分析生物膜的材料特性20,21,22,23,24,25。该方法可通过研究生物膜不同深度处的二维光学切片，拓展至三维生物膜的分析26。本技术旨在随时间追踪三维空间中直径为1 µm的微米级微珠，以用于四维（4D）建模。其部分研究动机源于利用4D建模理解质粒在胃肠道微生物群落中迁移行为的总体构想。选用直径为1 µm的荧光带电羧基微珠，因其在尺寸和电荷特性上与选定的质粒迁移与维持研究模式生物——E. faecalis——具有良好的对应性27, 28。为此开发了一种用于量化生物膜物理特性的4D检测方法（图1A）。在所设计的方法中，将微珠加入生物膜，并在10–20分钟内记录其穿过厚度为10–20 µm生物膜的时空轨迹。随后，利用新开发的工具箱，从轨迹长度、微珠速度、轨迹边界盒体积（包含轨迹的最小体积盒）以及边界盒内的细胞密度等方面，对三维微珠轨迹进行量化分析。以下实验方案可用于获取含细菌与微珠的生物膜的4D图像数据，使用ImageJ29及其插件Mosaic对数据进行预处理，并利用微珠评估工具箱（Bead Evaluator toolbox）分析微珠轨迹。

该技术可用于研究材料特性以及在三维空间中追踪颗粒和细菌的运动。例如，该技术的早期版本曾被用于表征靶向卷曲纤维素的单克隆抗体对生物膜结构完整性的影响16。完整版本具备多种工具，可对生物膜的材料特性进行更详细的分析，并持续用于研究单克隆抗体处理对生物膜的影响。通过使用带有不同电荷的颗粒，可检测生物膜的材料电荷特性，以及颗粒在不同基质组成生物膜中的运动情况。该方法可用于对比二维微流变学的结果，揭示在无流动条件下我们所观察到的生物膜中微珠运动背后的材料特性。该技术也可应用于具有不同生物膜组分区域的多物种生物膜。利用微流控装置和流动池，可在流动条件下对活体生物膜进行成像，以比较静态与流动状态下生物膜材料特性的差异，以及流动对颗粒运动的影响。此外，该技术还可应用于荧光标记的细菌，以表征外源性细菌在生物膜群落中的运动行为。通过使用三种荧光颜色，分别标记供体细菌、受体细菌和质粒，可实现对质粒运动、对接及转移过程的追踪。

方案

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1. 生物膜制备

注意：用于分析的生物膜可采用任何能够在光学玻璃表面形成生物膜的方法进行培养。生物膜结构应足以黏附于光学表面，以确保在该实验方案的洗涤和/或封片步骤中结构不被破坏。下文描述了在96孔光学底板和24孔板中12 mm玻璃盖玻片上培养生物膜的技术。其他可选方案包括不同规格的光学底板以及带或不带流动的光学流动小室。

  1. 生物膜构建
    1. 向培养板的孔中加入细菌生长培养基。本研究中，对于粪肠球菌（E. faecalis），在24孔板中加入2 mL Todd-Hewitt（TH）培养基，在光学底96孔板中加入0.4 mL TH培养基。对于鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）、大肠杆菌（E. coli）及其同基因csgAB卷曲菌毛突变株，向各孔中加入0.7 mL无盐Luria肉汤（LB）。若使用光学底培养皿，请继续执行步骤1.2。
    2. 将12 mm #1.5玻璃光学盖玻片放入培养皿中，并用乙醇覆盖。
    3. 使用镊子取出盖玻片，并用火焰点燃残留的乙醇使其燃烧。让乙醇完全烧尽。仅用火焰点燃即可，切勿将盖玻片长时间置于火焰中，以免破裂。盖玻片需冷却10–20秒后再放入孔中，以防因温差导致破裂。
    4. 以一定倾斜角度将盖玻片放入含有培养基的孔中，避免其直接平铺在培养基表面。切勿先将盖玻片放入干燥的孔中再添加培养基，否则会导致盖玻片粘附于孔底。
    5. 使用无菌移液器吸头小心地将盖玻片推至含培养基孔的底部。
      注意：请务必确保光学玻璃盖玻片或光学底板的厚度（#1或#1.5）与共聚焦显微镜光学系统的适配厚度相匹配。
  2. 在适宜条件下孵育生物膜以促进其生长。本研究中，粪肠球菌（E. faecalis）生物膜在37 °C下静置培养，大肠杆菌（E. coli）生物膜在30 °C下有氧培养。
    1. 本研究中，粪肠球菌（E. faecalis）生物膜培养2天，每天早晚更换一次培养基。为避免破坏或移位生物膜，操作时应将培养板轻轻倾斜。将移液器吸头靠近孔底部边缘，缓慢吸出旧培养基。添加第一毫升新鲜培养基时采用相同方式，第二毫升则缓慢加至培养基与孔壁交界面附近。
    2. 本研究中，采用有利于卷曲菌毛表达的培养条件。鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）生物膜在28 °C下倾斜培养6–8天，使生物膜附着于盖玻片约三分之二高度处，并在气液界面处形成浮膜结构。此过程不更换培养基。为防止培养基蒸发，将24孔板置于带有水盘的保湿 chamber 中进行孵育。

2. 4D 成像

  1. 生物膜样品的制备
    1. 将Crimson 1 µm羧基FluoSpheres微球以1:50的比例用PBS稀释（即1 mL PBS中含2 × 107个微球）。若使用光学底板培养皿，向1 mL微球悬液中加入Syto9，按每300 µL微球悬液加入1 µL的比例添加。
    2. （可选）如果培养基具有自发荧光，需洗涤生物膜以去除残留的培养基。在本实验中，用1 mL PBS洗涤两次：将培养板倾斜，将移液枪头靠近孔底部边缘，缓慢吸出培养基；然后将枪头置于孔底边缘附近，缓慢加入PBS填充孔。该操作方法同样适用于光学底板孔以及24孔板中的盖玻片。
    3. 移除培养基或PBS。将步骤2.1.1中配制的稀释Crimson微球加入生物膜中。在本研究中，向盖玻片样品加入1 mL微球悬液（含2×107个微球），向96孔光学底板中加入0.2 mL微球悬液（含4×106个微球）及Syto9。
    4. 室温孵育1分钟，使微球与生物膜结合。
    5. 移除微球悬液，并用PBS轻柔洗涤生物膜一次，以去除未结合的微球。在本研究中，对于盖玻片样品，用1 mL PBS轻柔洗涤，重新加入1 mL PBS填充孔，然后进行步骤2.1.6；对于96孔光学底板，用0.2 mL PBS轻柔洗涤生物膜，并重新加入0.2 mL PBS。此时光学底板样品已准备好成像，可进入步骤2.2。
    6. （若使用盖玻片）取1 µL Syto9（绿色荧光DNA染料；按制造商说明稀释），滴加至经包被处理的10孔多联载玻片某一孔的中央。此类包被盖玻片的孔深度为23–25 µm。
    7. （若使用盖玻片）使用经酒精火焰灭菌的镊子，小心地将盖玻片从原孔中取出，并倒置覆盖在含有Syto9液滴的孔上。将盖玻片保留在1 mL PBS中可更易于取出，并有助于将未结合的微球从生物膜中洗脱。
    8. （若使用盖玻片）用指甲油小心封固盖玻片边缘，避免滑动或按压盖玻片，以免产生表面张力，影响黏稠度较高、刚性较低的生物膜中微球的运动。
    9. （若使用盖玻片）待指甲油完全干燥后，用70%乙醇小心擦拭盖玻片外表面。擦拭时不得对盖玻片施加压力，原因如上所述。
  2. 共聚焦成像
    注意：在本研究中，使用配备TCS共聚焦系统的倒置光谱成像激光扫描共聚焦显微镜，搭配63倍物镜进行成像。该显微镜用于生成4D视频（图1）。三维生物膜图像由穿过厚度为18–20 µm的生物膜、以0.5 µm为步长采集的Z轴切片构成，共生成36–40个Z切片。每个三维生物膜图像采集耗时50–60秒。所有切片构成一帧，可呈现为一个三维生物膜图像。该过程重复20次，以生成总追踪时间为18–20分钟的4D延时视频。
    1. 设置显微镜以采集荧光信号。在本研究中，使用488 nm激光激发Syto9（用于细菌DNA染色），检测发射波长范围为495–540 nm（Leica Sp5为光谱成像显微镜）；使用633 nm激光激发Crimson（红色）微球，检测发射波长范围为650–700 nm。可根据需要调整上述荧光参数以适配其他荧光染料。
    2. 选择xyzt成像模式。
    3. 选择生物膜中密度高低混合的区域进行成像，以捕捉生物膜厚区与薄区之间黏弹性特性的差异。
    4. 设置Z轴扫描范围为18–20 µm。对于盖玻片固定的生物膜，应避免扫描生物膜最顶部和最底部紧贴玻璃的区域，以防止微球被困住而产生伪影（详见讨论部分）。
    5. 调节增益和偏移，使生物膜最亮区域的信号充分利用整个强度动态范围。这有助于最小化来自生物膜下层的信号重叠。
    6. 将切片厚度设为0.5 µm。该设置可在不丢失微球信息的前提下实现快速成像。
    7. 将图像分辨率设为512 × 512（0.48 µm）。该分辨率可在保证成像速度的同时，提供足够的分辨率以清晰观察生物膜结构及微球运动细节。
    8. 尽量缩短单次成像时间。
    9. 设置采集20个Z轴堆栈。
    10. 保存为.lif格式（或类似共聚焦图像格式）。4D视频可在ImageJ中生成。

3. 使用 ImageJ 生成 4D 生物膜视频

  1. 使用以下设置在 ImageJ 中打开 .lif 文件：以“超堆栈”方式查看堆栈，堆栈顺序为 XYCZT，颜色模式为“彩色”，勾选自动缩放，然后点击确定。
  2. 选择 图像 > 颜色 > 拆分通道。
  3. 选择 图像 > 颜色 > 合并通道 > 创建复合图像 > 确定。
  4. 选择 插件 > 3D 查看器 > 取消勾选蓝色通道 > 确定。
  5. 选择 编辑 > 勾选显示内容 > 勾选显示边界框。
  6. 使用鼠标点击并按住以选择图像，持续按住鼠标按钮的同时旋转图像。调整图像角度，使生物膜底部位于下方，并便于观察微珠结构，然后释放鼠标。
  7. 点击窗口底部的红色录制按钮以录制视频。
  8. 以 JPEG 作为压缩格式，将视频保存为 .avi 文件。

4. 生成轨迹数据

  1. 安装开源工具 ImageJ（https://imagej.net/Fiji）和粒子追踪插件 Mosaic（https://imagej.net/MOSAICsuite）。
  2. 导入包含微珠和细菌两个通道的 .lif 文件。将通道拆分并分别保存文件。
  3. 在 ImageJ 中，将图像体素尺寸（x、y 和 z 维度）以及时间步长大小保存至文本文件。
  4. 在 ImageJ 中，进入 Plugins | Mosaic 并启动粒子追踪器 2D/3D。
  5. 输入以下参数：半径：3，截断值：0.003，Per/Abs：0.12，链接范围：2，位移：10.00，动力学模式设为布朗运动。有关本实验中选择布朗运动模式的理由，请参见结果部分。
  6. 生成轨迹，并将轨迹列表导出为 .csv 文件。

5. 分析轨迹

  1. 安装 VRL Studio（https://vrl-studio.mihosoft.eu）
  2. 下载 Biofilm 项目（https://neurobox3d.github.io/Biofilm/）并在 VRL Studio 中启动
  3. 在 ImportData 中加载轨迹文件
  4. 在 ProcessTrajectories 中指定 x、y 和 z 方向的像素尺寸（使用 ImageJ 查找这些数值）
  5. 在 ComputeVelocity 中指定帧时间间隔（使用 ImageJ 查找该数值）
  6. 在 Comdensity 中加载细菌的 tiff 文件（见步骤 3.2）
  7. 在 SaveVelocityDataToFile 中设置速度数据的输出路径，在 SaveTrajectoryDataToFile 中设置轨迹数据的输出路径
  8. 调用 SaveVelocityDataToFile 和 SaveTrajectoryDataToFile
  9. 将数据导入 Excel 进行分析。这些数据包括轨迹长度、轨迹寿命、轨迹边界框的尺寸与体积、微珠平均速度及其方差。分析过程中，利用 Syto9 标记细菌的通道计算局部（在给定轨迹边界框内）细胞密度，并据此计算加权平均速度及方差，以及边界框方差的加权平均值和加权方差。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方法用于验证纤毛样菌毛（curli）可能赋予细菌刚性的假设 E. coli 和 S. 鼠伤寒沙门氏菌生物膜，减少共聚焦显微镜实验中微珠的移动。当前的工具箱已被用于比较不同材料的力学特性 粪肠球菌 共生型标准菌株 OG1RF 至 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门菌， 大肠杆菌， 及其相应等基因的卷曲菌毛突变体（图1B 和 补充视频 1， 补充视频 2, 补充视频 3，补充视频 4，补充视频 5，补充视频 6生物膜的材料特性可能在刚性（例如，与胞外DNA结合的curli）、带负电荷的微珠与生物膜细胞及基质成分之间的静电和疏水相互作用，以及细胞密度等方面存在差异。

可重复性
生物膜工具箱在 VRL-Studio32 环境中使用 Groovy30 和 Java31 编程，支持模块化工作流程设计，并为所有计算组件自动生成用户界面（UI）。这实现了自动化工作流程，避免了在分析结果时因实验人员操作而引入的无意偏差。

利用均方位移（MSD）确认生物膜中微球的运动类型
在使用 Particle Tracker 2D/3D 分析轨迹时，可针对不同类型的微球运动选择相应的动力学参数设置。在本研究中，选择了“布朗运动”设置（即扩散驱动的运动），因为 E. faecalis 是一种非运动性细菌，E. coli 和 Salmonella 在生物膜中不表达鞭毛，且实验在无流动的封闭系统中进行。该设置可通过计算微球的均方位移（MSD）进一步验证。根据公式 用于统计分析和物理方程中的均方位移公式 MSD(m)。，其中 m 表示轨迹段的数量，可计算每个轨迹过程中 MSD 的变化。线性轨迹表明微球呈扩散性运动（图 2A）。通过二次最小二乘法拟合，计算了生物膜中所有微球的平均运动模式，结果显示主要呈线性关系，证实被动扩散是其主要驱动力（图 2A-2F）。

边界框分析。
该工具箱使用 ImageJ Mosaic 和 Particle Tracker 2D/3D 生成轨迹（步骤 4），然后通过自动化的生物膜分析流程，获取有关微珠轨迹的重要数据，可用于比较生物膜的材料特性。边界框体积（单位为 µm3）通过构建包含轨迹的最小立方体并计算其体积而测得（图 3）。

E. faecalis 生物膜的微珠运动更为显著，其边界框数值范围为 1–6000 µm3（图 3B、3C 和 3D）。结果证实，将玻璃盖玻片安装在带有约 25 µm 涂层微孔的载玻片上所观察到的运动（图 3C），与在光学玻璃孔底部直接培养并成像的生物膜（图 3D）相比，两者结果基本一致，差异甚微。唯一区别在于，在安装的盖玻片顶部附近，E. faecalis 生物膜中可检测到寿命超过 10 分钟且边界框较小的稳定轨迹；而在光学底板中，则可检测到少数具有较高移动性的微珠。综合来看，这表明安装玻璃盖玻片可能改变了生物膜顶部与盖玻片接触界面的表面张力，从而最终降低了较不粘稠区域中部分微珠的移动性（图 3B、3C、3D 和 3I）。属于此类别的轨迹仅占极小比例，即使存在少量被滞留的微珠，安装盖玻片上 E. faecalis 的平均均方位移（MSD）仍略高于光学底板生物膜所计算出的 MSD（图 3）。

S. Typhimurium 和 E. coli 的微珠轨迹所对应的边界框体积较小，为 0–10 µm3（图 3A、3B、3E 和 3F），而等基因的卷曲菌毛突变株的边界框体积则更大，E. coli 为 1–6000 µm3，S. Typhimurium 为 1–5000 µm3（图 3A、3B、3F 和 3H），表明微珠的移动性更高。这些结果提示，淀粉样蛋白的存在与生物膜刚性的增加相关，并且与视频中观察到的生物膜无明显运动现象一致。即使在生物膜细胞密度较低的区域，边界框体积也始终较小（0–10 µm3）。该观察结果与先前研究一致，即卷曲菌毛可在生物膜中细胞密度较低的区域存在10。

无法比较肠杆菌科生物膜在光学底板上的行为，因为它们在气液界面处以菌膜形式生长（步骤 1.2.2）。当使用盖玻片时，菌膜附着在气液界面处的盖玻片上，当取出盖玻片时，菌膜随之附着于盖玻片表面，从而形成单一的成像平面。而在倾斜培养的光学底板中，成像时孔内仍含有液体，这意味着菌膜仍漂浮在光学底面之上，导致其超出倒置显微镜（如 Leica Sp5）的工作景深范围。若移除足够多的培养基以使生物膜进入显微镜的工作景深，会在长达 20 分钟的成像过程中导致样本干燥。

总体而言，这些图证实了补充视频中的视觉观察结果，并与观察到的均方位移（MSD）差异一致（图 3I 和 3J）。

轨迹寿命
轨迹寿命定义为微珠被持续记录的连续帧数（图3）。

在更粘稠、类似流体的 E. faecalis 生物膜中，所有微珠的轨迹寿命均短于10分钟，且大多数轨迹持续时间为2-5分钟 E. faecalis 生物膜。然而，通过目视检查可定位那些记录到较短轨迹寿命的珠粒。 E. faecalis 总成像时间窗口内的生物膜补充视频 1 和 2因此，微珠可能沿着已注册的轨迹运动，其间歇性地与生物膜解离并终止轨迹，随后重新与生物膜结合，从而启动新的轨迹。这最终会导致在生物膜中持续存在微珠的情况下，轨迹寿命较短。需要注意的是，使用该技术时，所测得的轨迹寿命（尤其是在黏稠的生物膜中）往往会低估微珠与生物膜实际结合的总时间。

在 S. 鼠伤寒沙门氏菌生物膜中，具有较小边界框体积的样本，其大部分微珠（约80%）的轨迹寿命较长，为16–20帧，对应实时约15–20分钟图3A，3G 和 3H）。与此相反，等基因的卷曲菌毛突变生物膜携带的移动微珠更多，其边界框体积范围为1-6000 µm3 (E. coli）和 1-5000 µm3 (S. 伤寒沙门氏菌）（图3A、3B、3F 和 3H）。与之相反 E. faecalis 具有生物膜的 >70% 的轨迹其边界框体积大于 10 µm3然而， 肠杆菌科 物种生物膜中仅有30%的小珠轨迹的边界框体积超过10 µm3尽管卷曲纤维突变体生物膜中的微珠整体轨迹寿命较短，但某些轨迹仍反映出显著的微珠运动和较长的轨迹寿命（图 3H这一观察结果可能表明，这种变异性可能与生物膜材料特性的差异有关，例如粘弹性，和/或颗粒表面化学性质的变化，例如电荷。

微珠轨迹长度和速度的分析
轨迹长度用于测量微珠移动的距离，单位为 µm。该测量值与微珠移动速度（单位为 µm/s）相对应。与具有较大边界框体积的结果一致，E. faecalis 生物膜中的微珠轨迹长度比含curli的生物膜长10倍，达到5-20 µm，而后者小于<4 µm。与较短的轨迹一致（图4A），E. faecalis 中的微珠速度最高可达15倍以上，大多数微珠的速度范围为0.01–0.15 µm/s，而含curli菌株的微珠速度小于<0.006 µm/s（图4B）。尽管如此，与E. faecalis生物膜相比，curli突变体生物膜整体表现出更低的速度和更短的轨迹；但与含curli的亲本菌株相比，其轨迹更长、速度更高（图4A和4B）。

值得注意的是，curli 的纤维状晶格结构30可能以各向异性的方式影响运动能力，即在 xy 平面内限制运动，而在 z 方向上增强移动性（图 2G）。在含 curli 的生物膜中，约 50 个独特微珠产生的大量轨迹数据（约 800 条）与马赛克粒子追踪技术（Mosaic Particle Tracking）的局限性相符，该技术将这些快速移动的微珠在 x、y 和 z 方向上的每一条轨迹均计为单个微珠。需要进一步的研究和软件开发来验证这一观察结果。

珠运动对细胞密度依赖性的分析
通过使用加权平均速度及其方差，以及边界框体积的平均值/加权平均值和方差，确定了珠运动对细胞密度的依赖性。在计算加权速度时，利用了Syto9标记细菌的第二成像通道，以计算局部细胞密度。细胞密度是通过对每条轨迹边界的边界框内Syto9体素数据进行平均而得到的（图5，右图）。因此，珠的速度可根据边级（局部）细胞密度进行加权。有多种可用于可视化细菌的染色方法，包括针对细胞壁、膜和DNA含量的染色。为确定细胞密度，选择Syto9染色，因为无论观察哪个光学Z层面，其信号均最为一致。而包膜染色（细胞壁和膜）的信号则会随Z层面位置的不同而变化：若Z层面包含细胞的顶部或底部，信号较强；若Z层面穿过细胞中部，仅细胞轮廓被染色，则信号较弱。

对红色通道中的微珠轨迹进行了20帧的追踪，其中单个轨迹的最短持续时间为2帧，最长为20帧，共包含19个连接各帧的轨迹片段（图5）。为了研究细胞密度对微珠运动能力的影响，测定了每个体素的GFP荧光强度（即512×512体素图像中每个单独测量值）。每个微珠轨迹片段周围的细胞密度被计算为该片段边界框内局部平均密度。

对于某些生物膜，可记录到具有统计学意义的密度依赖性（图6），最显著的是用于 E. faecalis 在玻璃盖玻片上培养并倒置到多孔载玻片上的生物膜（图6A。相反， E. faecalis 在96孔板底部生长的生物膜（图6B）未表现出密度依赖性。综上所述，这表明高度流动的 E. faecalis 由于在多孔载玻片上的固定作用，生物膜可能会受到轻微压缩，这与移动速度较快的微珠数量减少以及被困在生物膜顶部靠近玻片处、具有较小边界框体积的微珠数量减少的现象一致。图3C 与 图3D）。两者均 沙门氏菌 和 E. coli 生物膜图6C 和 6D）及其同基因型突变体（图6E 和 6F表现出轻微或无细胞密度依赖性。

3D 生物膜轨迹可视化；生物膜延时显微镜研究的Z切片示意图
图1．成像与分析流程（步骤2-4）（A）按照2.2节所述方法对生物膜进行成像。利用所获得的生物膜图像（见步骤3），根据第4节所述方法生成微珠轨迹。利用分析工具箱对轨迹数据进行相关计算（见步骤5）。（B）生物膜按照步骤1所述方法在盖玻片上培养（E. faecalis，视频1）、S. Typhimurium（视频3）、E. coli（视频5）及其同基因型卷曲菌毛突变株（视频4、视频6），或在光学底96孔板中培养（E. faecalis 底部，视频2）。白色比例尺为20 mm。本图经(31)许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

静态平衡分析；均方位移图；E. faecalis，S. Typhimurium，E. coli；荧光显微镜结果。
图 2。生物膜中微珠的运动被确定为扩散性运动（布朗运动，见步骤 5）（A-F）均方位移（MSD）数据呈现线性行为（红线），以验证布朗运动。生物膜按照步骤 1 培养（G）从 E. coli 的 4D 生物膜检测中选取的一帧图像，显示在 E. coli 和 S. Typhimurium 生物膜中观察到的椭圆形微珠运动示例（H）从 E. faecalis 光学底板孔中选取的第 3 帧与第 4 帧之间微珠模式发生显著变化的示例。注意生物膜本身会产生一定流动（视频 1 和 2），这使得第 3 帧和第 4 帧看起来方向不同。本图经许可转载自（31）。 请点击此处查看此图的放大版本。

细菌菌株轨迹分析；寿命、体积和珠位移比较图表。
图 3。利用边界框和轨迹寿命分析刚度差异。 生物膜按照步骤1所述方法在盖玻片上培养（E. faecalis，视频 1）、S. Typhimurium（视频 3）、E. coli（视频 5）以及同基因型的卷曲菌毛突变体（视频 4、视频 6），或在光学底96孔板中培养（E. faecalis 底部，视频 2）。轨迹寿命以总珠轨迹的百分比表示（A），以及散点图（C–H），并结合边界框体积（在步骤5中计算）（I）。不同生物膜中珠的均方位移（MSD）比较（H）。每种类型生物膜的平均MSD，条形图表示数据的95%置信区间。本图经许可转载自（31）。 请点击此处查看该图的放大版本。

小珠轨迹图；不同细菌菌株的轨迹长度和速度，百分比分布。
图 4．轨迹长度与小珠速度差异的分析。 生物膜按步骤1所述条件培养。轨迹长度以 µm 表示，并以小珠总轨迹的百分比形式呈现（A）。速度以 µm/s 表示，并以小珠总轨迹的百分比形式呈现（B）。本图经许可改编自文献（31）。 请点击此处查看该图的放大版本。

4D 生物膜分析示意图；Z 轴切片、片段运动、轨迹、细胞密度可视化。
图 5．轨迹片段分析示意图。本图经许可改编自文献(31)。请点击此处查看该图的放大版本。

细菌速度与密度关系图；粪肠球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌及突变体比较。
图6．利用生物膜分析流程研究生物膜密度对微珠速度的影响（步骤5）。 结果表明，微珠速度并不完全依赖于细胞密度。生物膜的培养方法如步骤1所述。轨迹分析在单个轨迹片段尺度上进行（图5）。对于每个片段，将微珠速度（单位：µm/s）相对于包围盒内的细胞密度（包围盒内每体素的平均GFP信号）作图。红线表示线性回归结果，绿线表示指数回归轨迹。本图经(31)许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：在 1.5 厚光学玻璃盖玻片上培养 24 小时的 E. faecalis OG1RF 生物膜的 4D 视频。该 4D 延时视频使用显微镜以 512×512 分辨率生成。通过以 0.5 µm 步长对生物膜约 20 µm 厚的区域进行成像，获得包含 40 张图像的 Z 轴序列。每个 Z 轴序列构成一帧，采集耗时 50–60 秒。连续采集 20 帧以生成 4D 视频。视频播放速度约为实际速度的 120 倍。该视频代表至少 6 次独立实验的结果。请点击此处下载该视频。

补充 视频 2. 24小时的4D视频 E. faecalis 在96孔光学底板上培养的OG1RF生物膜。 4D延时视频使用显微镜以512×512分辨率生成。通过以0.5 µm步长对生物膜约20 µm厚的区域进行成像，获得包含40幅图像的Z序列。每个Z序列构成一帧，采集时间为50–60秒。连续采集20帧以生成4D视频。视频播放速度约为实际速度的120倍。该视频代表3次独立实验的结果。 请点击此处下载 视频.

补充的 视频 3. 一个4D视频的 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌生物膜 ATCC 14028 在1.5厚光学玻璃盖玻片上培养6-7天。 4D延时视频使用显微镜以512×512分辨率生成。通过以0.5 µm步长对生物膜约20 µm厚的区域进行成像，获得包含40张图像的Z序列。每个Z序列构成一帧，采集时间为50–60秒。连续采集20帧以生成4D视频。视频播放速度约为实际速度的120倍。该视频代表3次独立实验的结果。 请点击此处下载 视频.

补充的 视频 4. 4D 视频 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门菌生物膜 ATCC 14028 纤维菌毛（curli）csgBA) 突变体在 1.5 厚的光学玻璃盖玻片上培养 6-7 天。 4D延时视频使用显微镜以512×512分辨率生成。通过以0.5 µm步长对生物膜中约20 µm厚的区域进行成像，获得包含40张图像的Z序列。每个Z序列构成一帧，采集时间为50–60秒。连续采集20帧以生成4D视频。视频播放速度约为实际速度的120倍。该视频代表3次独立实验的结果。 请点击此处下载 视频.

补充的 视频 5. 4D 视频 E. coli UTI89 在1.5厚的光学玻璃盖玻片上培养6-7天。 4D延时视频使用显微镜以512×512分辨率生成。通过以0.5 µm步长对生物膜中约20 µm厚的区域进行成像，获得包含40张图像的Z序列。每个Z序列构成一帧，采集时间为50–60秒。连续采集20帧以生成4D视频。视频播放速度约为实际速度的120倍。该视频代表3次独立实验的结果。 请点击此处下载 视频.

补充的 视频 6. 4D 视频 E. coli UTI89 curli（csgBA在1.5倍厚度的光学玻璃盖玻片上培养6-7天的突变体。 4D延时视频使用显微镜以512×512分辨率生成。通过以0.5 µm步长对生物膜约20 µm厚的区域进行成像，获得包含40张图像的Z序列。每个Z序列构成一帧，采集时间为50–60秒。连续采集20帧以生成4D视频。视频播放速度约为实际速度的120倍。该视频代表3次独立实验的结果。 请点击此处下载 视频.

讨论

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关键步骤与故障排除
该技术最大的挑战在于使用载玻片封片法处理像E. faecalis这样黏性很高的生物膜。必须小心且准确地将盖玻片放置在多孔载玻片上，且放置后不得重新调整位置。在封片过程中，需格外注意避免按压盖玻片，或意外地将其推移或滑动于载玻片表面。任何移动或施加的压力都可能产生表面张力，从而阻碍黏稠生物膜的正常流动。如果条件允许，可通过成像对比光学底板孔中的生物膜与盖玻片封片法的生物膜，以评估该技术的操作效果。当操作正确时，E. faecalis的盖玻片封片样本与光学底板培养板中的生物膜形态非常接近。

此外，在使用固定盖玻片时，应避免对生物膜与底部盖玻片或最顶部载玻片之间的界面进行成像。当使用倒置显微镜且盖玻片位于底部时，生物膜基部与盖玻片之间可能存在被困住的微珠。这些微珠穿过生物膜，并在轻柔洗涤后仍被截留在盖玻片表面，其 x、y 和 z 坐标均为 0，边界框坐标也为 0。然而，在某些应用中，例如评估处理后的生物膜完整性时，这些数据点可作为分析工具。微珠穿透较厚生物膜区域到达盖玻片底部的能力可用于评估处理后的生物膜完整性（与 Tükel 实验室合作，相关论文正在撰写中）。在生物膜顶部，对于如 E. faecalis 这类黏稠的生物膜，我们发现盖玻片可能施加了压缩作用。这限制了玻璃载玻片界面处部分微珠的运动，可能在微珠运动分析中引入了一定的密度依赖性。

洗涤步骤对于生物膜是必要的，因为培养基在绿色通道具有强烈的自发荧光。我们选择使用过量的微珠，并通过洗涤去除未结合的微珠，以最大限度地保留结合的微珠，从而对观察区域进行最准确的表征。

为获得理想的数据集，所需微珠数量和洗涤次数需通过实验确定。生物膜中微珠过多会产生过于庞大的数据集，难以分析；而微珠过少则无法充分取样生物膜的不同环境。然而，通过控制加入的微珠数量（1 mL PBS 中加入 2×107 个微珠）并结合洗涤步骤，可使与生物膜结合的微珠数量相对一致，通常在 40 至 140 个之间，具体数量取决于生物膜的结构、空间排列和组成。

在研究具有混合黏性和刚性区域的生物膜时，微珠可能会随时间推移被困在刚性区域中。此时，必须在加入微珠后立即开始成像。使用盖玻片通常难以实现这一点，而需要采用光学底板或流动池，以便在加入微珠及完成洗涤步骤后立即进行成像。

改进与未来应用
微流控装置的使用。在我们的研究中，肠杆菌科生物膜研究的最佳条件需要在气液界面处形成浮膜状生物膜。这限制了光学底板和微流控装置在研究中的应用。然而，当生物膜形成条件允许时，可将生物膜在微流控腔室或流动池中培养。随后可通过微流控装置对生物膜进行清洗，并引入微珠，从而对生物膜的干扰降至最低。

在生物膜生长过程中加入微珠。我们选择在生物膜中加入过量的微珠，然后通过轻柔洗涤去除未结合的微珠，以优化分析过程中存在的微珠数量。在黏稠的E. faecalis生物膜中，微珠可能在20分钟的成像时间内发生解离和再结合。如果在生物膜生长的不同阶段分次加入少量微珠，或许可使微珠被固定在生物膜内，从而更准确地表征黏稠生物膜的运动情况。

成像区域的选择。在研究材料特性时，最好选择生物膜的较厚和较薄区域。然而，在研究经处理的生物膜材料特性的变化时，可对较厚且连续的区域进行成像，以确定这些区域中黏弹性特性和微珠渗透性的变化。在此情况下，寻找那些已穿透生物膜并最终被困在盖玻片表面的微珠，是评估生物膜结构破坏的有效指标。

流动条件下的成像。利用光学玻璃流动池或微流控装置，可在流动条件下对生物膜中微珠或细菌的运动进行成像。该过程可通过多种方式实现。一种方法是将微珠注入整个腔室，短暂孵育以使微珠与生物膜结合，随后通过洗涤去除未结合的微珠，并在有或无流动的条件下对生物膜进行成像。另一种方法是将少量微珠从腔室的一侧引入，在流动条件下追踪其在生物膜内部及穿过生物膜的运动轨迹。当使用流动条件时，需谨慎选择 Mosaic 微珠追踪的参数设置（步骤 4.5）。在本研究中，动力学模式设定为布朗运动。均方位移（MSD）计算结果证实，该运动模式可能为扩散性运动，因此选择布朗运动模式是合适的。

基质染色。在当前的研究中，使用Syto9染色检测的是细胞密度，而非生物膜基质结构的密度。例如，淀粉样蛋白的存在可能会增加生物膜基质材料的密度。通过使用荧光基质染料替代Syto9，可以确定运动对淀粉样蛋白密度的依赖性。

荧光标记的细菌。 荧光标记的细菌可用于追踪外源性细菌在生物膜中的移动（例如，含质粒的细菌）。使用荧光标记细菌（如Enterococci）的难点在于，它们以单细胞、成对双球菌以及短链形式存在，这使得准确追踪细菌变得复杂。若细菌具有单细胞形态，则该过程将更为简便。

局限性
轨迹可视化与拼接中的局限性。
该方法的一个局限性在于轨迹的可视化与拼接。重建并分析得到的轨迹由 x、y、z 坐标点组成，后续的点之间定义了连接这些点的线性路径。此类分段线性轨迹可通过多种工具进行可视化。一种方法是结合使用 Python 和 Jupyter 笔记本，以及 Python 插件 Pandas 和 Matplotlib。尽管在最初发表该技术的《细菌学杂志》文章中已能够可视化单个现有轨迹34，但仍存在显著的局限性，有待在未来的研究中加以解决。

目前，重建的轨迹数量多于生物膜中的微球数量，这意味着多个轨迹可能对应同一个微球。这可能是由于某一帧中激光共聚焦信号较弱，导致 Mosaic 终止一条轨迹并启动另一条轨迹，从而将单个微球记录为多条较短的轨迹，尤其是在黏性较低的生物膜中。轨迹数量较多的另一个原因是缺乏轨迹拼接功能。特别是在 E. faecalis 光学底板培养孔的生物膜中，微球在成像过程中在视觉上始终与生物膜保持关联（补充视频 2）。然而，没有一条轨迹的长度超过 10 帧，且超过 90% 的轨迹寿命为 5 帧或更短（图 3D）。如果软件仅用于分析长度超过特定阈值的轨迹（例如，追踪能够转移质粒的细胞），则可自动从数据集中剔除较短的轨迹。然而，在其他研究目的中，轨迹的拼接可能至关重要。最后，由于肠杆菌科生物膜中微球在 Z 方向的快速运动导致其呈椭圆形（图 2G），软件无法将快速移动的微球识别为单一轨迹，从而导致轨迹数量增多。解决由快速各向异性运动导致轨迹中断的拼接问题，对于研究肠杆菌科中 curlin 淀粉样基质的作用将具有重要意义。

意义
开发了一种计算工作流程，用于研究微珠轨迹，以比较三维生物膜的材料特性。该工作流程使研究人员能够识别关键参数，这些参数可用于异质性生物膜流体动力学的计算建模。借助这一开源的微珠分析工具，可研究细菌淀粉样蛋白纤维（curli）对材料特性的影响，结果表明curli会增加生物膜基质的刚性。在更广泛的应用背景下，该分析工具可用于研究生物膜处理或不同环境条件（如流体剪切力）所诱导的生物膜结构变化。例如，该工具正在与Tükel实验室（LKSOM 天普大学）合作，用于分析单克隆抗体治疗对生物膜结构破坏的影响。微珠分析工具箱采用模块化设计，可通过VRL-Studio进行完全自适应和功能扩展，以进一步增强其功能。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GQ实验室和BAB实验室的研究工作未从公共、商业或非营利部门的任何资助机构获得特定资助。作者感谢坦普尔大学数学系的Isaac Klapper博士（Ph.D）在讨论中提供的帮助，以及坦普尔大学微生物学与免疫学系的Çagla Tükel在包含本技术的初始出版物中对肠杆菌科（Enterobacteriaceae）专业知识的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔板，1.5 号未包被盖玻片，5 mm 玻璃直径MatTekP96G1.55F
Fisherbrand 盖玻片：圆形Fisher Scientific12-293-232P1.5 光学玻璃盖玻片
Invitrogen Syto 9 绿色荧光核酸染料InvitrogenS34854
Molecular Probes FluoSpheres 羧基修饰微球，1 µm，深红色荧光（625/645）Molecular ProbesF8816

参考文献

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