方法文章

用于研究人类神经退行性疾病中核孔蛋白改变的细胞核分离与超分辨率结构光照明显微镜技术

DOI：

10.3791/62789

⸱

2021年9月10日

 , 
1Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种优化的工作流程，用于从诱导多能干细胞分化的神经元和人死后组织中分离细胞核，并通过超分辨率结构照明显微镜对核质内及核孔复合体中的单个核孔蛋白进行评估。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

核孔复合体（NPC）是一种复杂的大型分子结构，由约30种不同的核孔蛋白（Nups）各自多个拷贝组成。这些Nups共同参与调控基因组结构、基因表达以及核质运输（NCT）。近年来，研究发现NCT功能障碍及特定Nups的异常是多种神经退行性疾病早期且显著的病理特征，包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病（AD）/额颞叶痴呆（FTD）以及亨廷顿病（HD）。光学显微镜和电子显微镜技术的进步使得对亚细胞结构（包括NPC及其Nup组分）的观察达到了更高的精确度和分辨率。在常用技术中，超分辨率结构照明显微镜（SIM）为利用常规抗体标记策略研究单个Nups的定位与表达提供了独特优势。在进行SIM前分离细胞核，可实现对NPC及核质中单个Nup蛋白在完整且精确重建的三维空间中的可视化。本方案描述了一种用于分离细胞核并结合SIM技术，以评估人诱导多能干细胞来源的中枢神经系统细胞及死后组织中Nup表达与分布的实验流程。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

随着人口老龄化，年龄相关性神经退行性疾病的患病率正在上升1。尽管这些疾病的遗传基础和病理特征已被充分阐明，但导致神经元损伤的精确分子事件仍不清楚2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。最近，C9orf72基因第一个内含子中的G4C2六核苷酸重复扩增被确定为相关神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆症（FTD）最常见的遗传病因13,14。目前多项研究支持核转运机制（包括核孔复合体（NPCs）和核转运受体（NTRs，karyopherins））的功能障碍在C9orf72相关ALS发病中起核心作用15,16。在大鼠脑内的非分裂细胞中，支架核孔蛋白（Nups）具有极长的寿命。因此，在衰老过程中已报道NPCs和核转运（NCT）发生改变17,18,19,20。此外，某些核孔蛋白或转运蛋白发生突变时，与特定神经系统疾病相关21,22。例如，Nup62的突变与婴儿双侧纹状体坏死（IBSN）相关，这是一种影响尾状核和壳核的神经系统疾病23；Gle1的突变与胎儿运动神经元疾病人类致死性先天性关节挛缩综合征-1（LCCS1）相关24；Aladin的突变则导致三A综合征（Triple-A Syndrome）25。在ALS、亨廷顿病（HD）和阿尔茨海默病（AD）等年龄相关性神经退行性疾病中，功能性NCT的异常进一步加剧16,26,27,28,29,30,31。此外，已有研究报道某些特定Nups和NTRs可作为C9orf72介导的毒性在Drosophila眼部模型中的修饰因子28，或通过生化方式改变与疾病相关的蛋白（如FUS和tau）的聚集状态27,32,33,34。综上所述，这些早期研究表明，NCT的异常可能是ALS和FTD的主要且早期的病理特征。基于过表达模型系统的研究提示，特定Nups和karyopherins的错误定位可能影响NCT16,35,36,37,38。然而，这些病理学研究并未真正将NPC蛋白在细胞质中的积聚与NPC结构或功能缺陷联系起来。例如，这种病理改变可能仅仅反映了细胞质中Nup蛋白池的失调，而对NPC的组成和功能影响甚微。相比之下，最近一项采用超分辨率结构照明显微镜（SIM）的研究表明，在人类C9orf72 ALS/FTD神经元中，NPC本身出现显著损伤，表现为核质和NPC中特定Nup水平降低，最终导致NPC功能异常，这可能是致病级联反应的早期启动事件15。

大分子在细胞核与细胞质之间的转运由核孔复合体（NPC）调控。NPC是一种嵌入核膜的大型大分子复合物，由30种核孔蛋白（Nups）的多个拷贝组成39,40,41。尽管不同细胞类型中Nup的化学计量比存在差异42,43,44，但维持NPC整体组成的稳定性对于核质转运（NCT）、基因组结构组织以及细胞整体存活能力至关重要39,41,45,46。因此，NPC组成发生改变以及随之而来的功能转运缺陷，可能会影响大量下游细胞功能。NPC中的Nup组分高度有序地组装成多个亚复合物，包括细胞质环和纤维、中央通道、外环、内环、跨膜环以及核篮结构。其中，内环、外环和跨膜环的支架Nup共同将NPC锚定于核膜中，并为细胞质环、中央通道和核篮的Nup提供附着位点。小分子（<40–60 kD）可通过NPC被动扩散，而较大货物分子的主动转运则依赖于核转运受体（NTRs，即karyopherins）与细胞质纤维、中央通道及核篮中的FG重复序列Nup之间的相互作用39,40,41,45。此外，少数Nup还可存在于NPC之外，在核质内发挥调控基因表达的功能46,47。

由于单个人类核孔复合体（NPC）的横向尺寸约为100–120 nm40，传统的宽场显微镜或共聚焦显微镜无法分辨单个NPC48。透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）等电子显微技术常用于评估NPC的整体结构39,40。尽管这些技术在解析NPC超微结构方面具有优势，但它们较少用于评估NPC内单个核孔蛋白（Nup）的存在情况。将抗体或标签标记技术与这些先进的电子显微技术（TEM和SEM）结合存在技术局限性，通常难以对NPC或核质内单个Nup蛋白进行准确且可靠的评估。此外，这些技术操作复杂，目前尚未被所有研究人员广泛掌握。然而，近年来光学显微镜和荧光显微镜技术的进步提高了超分辨率成像技术的可及性。特别是结构光照明显微镜（SIM），能够以前所未有的分辨率对单个Nup蛋白进行成像，其分辨率接近单个人类NPC的横向尺寸40,48,49,50,51。与其他超分辨率成像方法（如随机光学重建显微镜STORM和受激辐射损耗显微镜STED）相比，SIM兼容常规的基于抗体的免疫荧光染色49。因此，只要存在特异性针对某一Nup蛋白的抗体，SIM即可实现对该Nup蛋白的全面分析。在同一制备样本中对多个不同Nup蛋白进行取样和成像的能力，使得SIM在研究构成NPC的众多蛋白质时相比其他成像方法具有显著优势。以下实验流程详细描述了一种优化后的方案，用于评估由诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元（iPSNs）及死后人类中枢神经系统（CNS）组织中分离的细胞核内的NPC单个Nup组分。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

用于iPSC生成和尸检组织采集的所有血液样本均经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会（IRB）批准，并接受约翰斯·霍普金斯大学伦理监督。所有患者信息均符合《健康保险可携性和责任法案》（HIPAA）规定。以下方案遵循约翰斯·霍普金斯大学的所有生物安全操作规程。

1. 免疫染色和成像用载玻片的制备

  1. 将带正电荷的玻璃显微镜载玻片放入空的细胞计数漏斗中，并使用疏水屏障笔在载玻片上画一个圆圈，以界定细胞核的沉积区域。
  2. 向第1.1步所画圆圈的中心加入50 μL浓度为1 mg/mL的胶原蛋白溶液（用1×PBS稀释），并在室温下孵育5分钟。
  3. 吸除胶原蛋白溶液，并将载玻片在室温下静置晾干约1小时。

2. 裂解缓冲液和蔗糖梯度的制备

  1. 根据细胞核分离试剂盒说明书配制裂解缓冲液和蔗糖梯度溶液。
    1. 每个样本使用一个50 mL锥形管，通过混合11 mL提供的裂解缓冲液、110 μL提供的10% Triton X-100溶液以及11 μL新鲜配制或解冻的1 M DTT（二硫苏糖醇），配制裂解缓冲液。
    2. 每个样本使用一个50 mL锥形管，通过混合27.75 mL提供的2 M蔗糖缓冲液、2.25 mL提供的蔗糖缓冲液以及30 μL新鲜配制或解冻的1 M DTT，配制1.85 M蔗糖垫层溶液。
      注意：1.85 M蔗糖垫层溶液适用于iPSNs及死后人中枢神经系统（CNS）组织，但应根据其他细胞类型或组织样本进行调整。有关HEK293细胞、iPSC来源的星形胶质细胞，以及从死后人CNS组织中富集少突胶质细胞核的更多细节，最近已有发表15。
  2. 通过轻轻倒置锥形管使裂解缓冲液和蔗糖垫层溶液充分混匀，并置于冰上保存。

3. iPSN 和死后人脑中枢神经系统组织的裂解

  1. 开始裂解前，将超速离心机转子（不带样品架）放入超速离心机中，并使其预冷至 4 °C。
  2. iPSN 的裂解。
    注意：iPSN 与死后人脑中枢神经系统（CNS）组织的裂解方案不同。请根据以下指定的样本类型选择相应方案（步骤 3.2：iPSN，步骤 3.3：死后人脑 CNS 组织）。
    1. 将 iPSN 从培养箱中取出，吸除培养基。用 1× PBS 快速冲洗一次，然后直接向孔板或培养皿中加入裂解缓冲液。
      注意：请确保使用足量的 1× PBS 充分冲洗 iPSN，以去除碎片和死亡细胞。加入 iPSN 培养板中的裂解缓冲液体积会有所不同，请参见表 1。确保起始材料为 >250 万个 iPSN。
    2. 使用细胞刮刀刮取 iPSN，并将其转移至装有剩余裂解缓冲液的 50 mL 锥形管中。
    3. 盖紧每个锥形管，涡旋震荡样品 20 秒，以促进 iPSN 裂解。
    4. 将样品置于冰上静置 1–2 分钟后再进行后续操作。
  3. 死后人脑 CNS 组织的裂解。
    1. 将培养皿置于干冰上，使用剃刀片切割约 100 mg 冷冻的死后人脑 CNS 组织进行称重。操作时务必在铺有一次性防护垫的台面上进行，以避免局部组织污染。注意在组织解剖时区分特定的灰质与白质区域（例如皮层灰质与下方白质）。
      注意：处理冷冻的死后人脑组织样本时，应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括护目镜和手套。此步骤也可提前完成，将组织分装后储存于 -80 °C。50 mg 组织已足够用于细胞核分离。然而，当组织量超过 100 mg 时，常会导致细胞核分离不完全，表现为部分细胞核周围仍存在完整的细胞质。
    2. 使用蒸馏水清洗并彻底冲洗 Dounce 匀浆器，然后将其置于冰上预冷。
    3. 将 100 mg 组织加入已新鲜清洗、冲洗并预冷（置于冰上）的 Dounce 匀浆器中，其中含有 2 mL 配制好的裂解缓冲液。
    4. 在冰上按照标准操作程序使用 Dounce 匀浆器进行匀浆。
      注意：通常每支研杵进行 10–20 次研磨即可顺利通过样品而无明显阻力。
    5. 将 2 mL 死后人脑组织匀浆液转移至锥形管中，其中已含有 9 mL 裂解缓冲液。
    6. 剧烈涡旋震荡 30 秒，然后置于冰上静置 5 分钟以促进裂解。

4. 从iPSNs和人脑死后中枢神经系统组织中分离细胞核

  1. 在超速离心管底部加入10 mL 1.85 M蔗糖缓冲液（步骤2.1.2中制备），并向每份裂解液中加入18 mL 1.85 M蔗糖缓冲液。
  2. 通过倒置50 mL锥形管，轻轻混匀裂解液与蔗糖缓冲液的混合物（在步骤4.1中合并）。
  3. 将28 mL裂解液/蔗糖缓冲液混合物缓慢加至超速离心管中已有的10 mL 1.85 M蔗糖缓冲液上方（来自步骤4.1）。
    注意：50 mL锥形管中共有29 mL裂解液/蔗糖缓冲液混合物（步骤4.1–4.2）。请在50 mL锥形管中保留1 mL该混合物。由于蔗糖缓冲液具有黏性，此操作可确保所有样品间的移液准确且一致。
  4. 将超速离心管放入转子套管中，并根据需要添加额外的1.85 M蔗糖缓冲液（步骤2.1.2中制备）以平衡样品。
  5. 将样品套管放入预冷的超速离心机转子中，在30,000 ×g、4 °C条件下离心45分钟。
  6. 从转子套管中取出超速离心管，弃去上清液。细胞核将以沉淀形式附着在超速离心管底部侧面，肉眼可见。
  7. 用1 mL提供的细胞核储存缓冲液通过涡旋重悬细胞核沉淀，并转移至微量离心管中。
  8. 在2,500 × g、4 °C条件下离心微量离心管5分钟。
  9. 弃去上清液，用新鲜的1 mL provided nuclei storage buffer通过涡旋重悬细胞核。
  10. 立即进行免疫染色，或将细胞核在-80 °C保存。
    ​注意：细胞核可在-80 °C保存长达6个月，在结构完整性受损前可经历两次冻融循环。

5. 分离细胞核的免疫染色

  1. 取10 μL核悬液，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行计数。
  2. 将已制备的载玻片（来自步骤1.3）组装到细胞离心涂片装置（cytofunnel）中。
  3. 向每个细胞离心涂片装置中加入200 μL新鲜的核保存缓冲液和约100,000个细胞核。
  4. 将细胞离心涂片装置放入细胞离心机（cytospin）中，在100 × g 条件下轻柔离心3分钟，使细胞核沉降到载玻片上。
  5. 拆开细胞离心涂片装置，并立即向载玻片上加入约100 μL的4%多聚甲醛（PFA），室温孵育15分钟。
    注意：也可使用甲醇固定细胞核。应根据每种抗体选择合适的固定方法。若使用甲醇固定，则跳过通透步骤（5.7）。细胞离心涂片装置为一次性使用，此时应予以丢弃。
  6. 用1× PBS洗涤细胞核3次，每次5分钟。
  7. 用含0.1% Triton X-100的1× PBS在室温下对细胞核进行通透处理，持续10分钟。
  8. 用封闭液（含10%山羊或驴血清的1× PBS）在室温下封闭细胞核30分钟。
  9. 将细胞核与用封闭液稀释的一抗在4 °C条件下孵育过夜。
  10. 用1× PBS洗涤细胞核3次，每次5分钟。
  11. 将细胞核与用封闭液稀释的二抗在室温下孵育1小时。
    注意：推荐使用Alexa Fluor 488、568和647标记的二抗。
  12. 用1× PBS洗涤细胞核3次，每次5分钟。
  13. 可选：将细胞核与DAPI或Hoechst染料孵育5分钟，随后再用1× PBS额外洗涤两次，每次5分钟。
  14. 用无绒布擦拭载玻片上含有细胞核的圆形区域边缘，彻底去除最后一次PBS洗涤液。
  15. 向每张载玻片上加一滴（约10 μL）不含DAPI的硬封片抗荧光淬灭封片剂，并轻轻盖上高耐受性18 mm × 18 mm方形盖玻片。
    注意：若使用硬封片剂，且载玻片在适当时间内进行成像，则无需密封边缘。通常情况下，未密封的载玻片在4 °C保存约6个月后，核孔复合体蛋白（Nup）的免疫反应性仍保持稳定。然而，若使用湿封片剂或需长期保存，可用一层薄指甲油密封盖玻片边缘。
  16. 将载玻片避光保存，并在室温下静置过夜使其充分固化。
  17. 可通过超分辨率结构光照明显微镜（SIM）对细胞核进行成像。
    注意：蔡司（Zeiss）、尼康（Nikon）和GE Healthcare均生产SIM显微镜。请遵循各系统特定的图像采集与处理方案。根据每种核孔蛋白（Nup）和荧光染料选择合适的成像参数（激光功率、滤光片组、曝光时间）。成像时应避免采集圆形区域（步骤1.1形成）的边缘部分，因为这些区域的细胞核通常因离心步骤（5.4）而被压扁并扩散。完全去卷积和处理后的图像可进行多种分析，包括使用FIJI或Imaris图像分析软件中的标准3D分析模块进行荧光点检测和体积测量。有关分析方法的更多细节最近已有发表15。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了研究POM121在人神经元细胞核中的核孔复合体（NPC）及核质分布与表达情况，我们按照先前所述方法对对照组和C9orf72 iPSNs进行了分化15。将死后人运动皮层组织和第32天的iPSNs裂解，并如上所述进行细胞核分离和免疫染色。通过超分辨率结构照明显微镜（SIM）（Zeiss）对NeuN阳性的分离细胞核进行成像，并采用先前所述的默认结构照明去卷积参数进行图像处理15（实验流程见图1）。图像采集使用63倍油浸物镜，1倍放大倍数，HR Diode 448激光器（功率1%），曝光时间为100 ms，发射滤光片为BP495-550/LP750，z轴切片厚度为110 nm，共进行5次光栅旋转。如图2中的三维最大强度投影所示，在iPSNs和死后神经元细胞核中均可分辨出单个POM121信号点。随后，使用FIJI或Imaris软件中的3D套件插件对这些图像进行信号点检测，方法如前所述15

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鉴于近期研究已将核质转运（NCT）功能障碍确定为多种神经退行性疾病中一种早期且显著的现象16,27,28,30,31，迫切需要深入探究该病理过程的发生机制。由于核孔复合体（NPC）及其各个核孔蛋白（Nup）对功能性NCT具有关键调控作用39,41，因此在神经退行性疾病模型中研究NPC的组成至关重要。然而，传统的宽场显微镜和共聚焦显微镜技术不足以分辨单个NPC40,48,49,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尸检人中枢神经系统组织由约翰斯·霍普金斯大学ALS尸检库和靶向ALS尸检组织中心提供。本研究工作得到了美国肌萎缩侧索硬化症协会（ALSA）米尔顿·萨芬诺维茨博士后奖学金（ANC）、美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）、美国国防部、肌萎缩侧索硬化症协会、肌肉萎缩症协会、F Prime基金、罗伯特·帕卡德肌萎缩侧索硬化症研究中心Answer ALS项目以及陈-扎克伯格倡议基金的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 锥形管Fisher Scientific14-959-49A
Beckman 超速离心机Beckman Coulter
细胞刮刀Sarstedt83.183
胶原蛋白Advanced Biomatrix5005
盖玻片MatTekPCS-170-1818
细胞沉降装置（Cytofunnel）Thermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4 细胞离心涂片机Fisher ScientificA78300003
Dounce 匀浆器DWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf 管Fisher Scientific05-408-129
山羊抗鸡 Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
山羊抗小鼠 Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
山羊抗小鼠 Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
山羊抗小鼠 Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
山羊抗兔 Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
山羊抗兔 Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
山羊抗兔 Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
山羊抗大鼠 Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
山羊抗大鼠 Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
山羊抗大鼠 Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
血细胞计数板Fisher Scientific267110
显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
正常山羊血清Vector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep 核分离试剂盒Sigma AldrichNUC201包含裂解缓冲液、10% Triton X-100、2 M 蔗糖梯度液、蔗糖垫溶液和核储存缓冲液；在实验方案中引用为 "nuclei isolation kit"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930在实验方案中引用为 "hard mount antifade mounting media"
SW 32 Ti 超速离心转子Beckman Coulter369694在实验方案中引用为 "ultracentrifuge rotor"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
台盼蓝Thermo Fisher Scientific15-250-061
超速离心管Beckman Coulter344058
核孔蛋白一抗可用于免疫荧光检测单个核孔蛋白的一抗由多家公司提供 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

视频即将推出

相关文章