方法文章

活体荧光、倒置成像观察细胞皱褶形成及巨胞饮作用

DOI：

10.3791/62870

⸱

2021年8月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案通过连续摄取和反向成像技术，展示在活细胞中对葡聚糖进行成像的方法，以优化细胞皱褶、大胞饮体成熟过程的可视化，以及葡聚糖和其他细胞标记物的分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

巨胞饮是一种高度保守但尚未完全阐明的过程，对细胞摄取液体、液相营养物质及其他物质至关重要。细胞表面皱褶的显著延伸、皱褶闭合形成巨胞饮体，以及内化后的巨胞饮体成熟，是该通路中的关键事件。使用传统共聚焦成像技术追踪荧光示踪物团块时，这些过程往往难以捕捉。实验中通常采用荧光葡聚糖作为巨胞饮体及其他内吞通路的液相标记物。本实验室采用的一种优化葡聚糖摄取成像的方法是：将细胞置于含有高浓度荧光葡聚糖的培养基中进行活细胞成像，未标记的细胞以对比形式（呈黑色）显现。该方法可突出显示细胞皱褶，便于观察皱褶闭合过程，而内化的巨胞饮体则表现为细胞内部的荧光空泡。此方法非常适合可视化巨胞饮体的特征，并有利于后续的分割与定量分析。本文描述了使用不同大小的葡聚糖对通路进行双标记，以及共表达脂质探针和荧光膜蛋白以区分巨胞饮体与其他内体的方法。同时展示了利用光镜与电镜关联成像技术（CLEM）在超微结构水平检测内化葡聚糖的方法。这些细胞过程可通过多种活细胞成像方式观察，包括三维成像。综上所述，这些方法可针对多种实验条件和体系优化巨胞饮体的成像效果。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大多数脊椎动物的细胞类型都具有非选择性摄取液体的先天能力，这种能力在进化过程中与其祖先一脉相承，可追溯至单细胞的阿米巴原虫1。这种通过巨胞饮作用（“大量饮水”）进行液体相摄取的高度保守过程，在阿米巴原虫中主要用于获取营养物质1，而在脊椎动物细胞中，它同样可在应激条件下作为获取营养的供应途径，并被免疫细胞用于对组织环境的取样与监视2。巨胞饮作用具有一些区别于其他内吞形式的特征，包括独特的大尺寸（直径>0.2 mm）空泡样巨胞饮体、对液体和溶质的非选择性摄取，以及伴随大量质膜被机会性地内化进入巨胞饮体3。由于这种摄取具有非选择性，细胞必须迅速进行分选和再循环，将重要的可溶性蛋白和质膜蛋白回收至细胞表面。进入巨胞饮体的大部分物质最终将被运送至溶酶体中降解，并通过巨胞饮体的成熟及其与其他内体的融合，被导入内体/溶酶体通路。质膜蛋白也可从巨胞饮体被再循环回细胞表面。在癌症研究领域，人们对巨胞饮作用过程的兴趣日益浓厚，因为该过程在癌细胞中被激活，有助于维持其营养供给和增殖能力2,4,5,6。巨胞饮作用既可组成性发生，也可在免疫细胞中通过受体介导的刺激进一步诱导；在免疫细胞中，巨胞饮体容纳受体信号传导，参与抗原呈递相关的内体/溶酶体加工过程，并为多种病毒、细菌及其他病原体提供入侵门户3,7。

巨胞饮泡缺乏特异或独特的标记物。它们最易于在形成过程中被识别，即在富含肌动蛋白的细胞表面皱褶底部，这些皱褶闭合以吞噬液体8。闭合后立即，巨胞饮泡周围的F-肌动蛋白发生去聚合，巨胞饮泡自身则经历与同型和异型融合、管状化及收缩相关的动态变化9。巨胞饮泡在超微结构水平上也难以识别，因为它们没有特征性的包被或其他结构特征，仅表现为大小不一的空泡。由于缺乏明确的膜标记物，巨胞饮泡最常用且传统的定义方式是通过其液体内容物，实验上通常使用荧光标记的葡聚糖进行示踪。葡聚糖是一种来源于葡萄糖的复杂多糖，可偶联多种荧光或电子致密标记物，并添加至培养基中供细胞摄取，或灌注于组织中以实现摄取。此外，高分子量（MW）葡聚糖（70 kDa）目前被认为是一种对巨胞饮泡具有尺寸选择性的示踪物，因为它无法进入其他较小的内吞囊泡，因此已成为巨胞饮作用最常用的标记物10,11。观察巨胞饮作用通常涉及将细胞与一段脉冲式的荧光葡聚糖共同孵育，随后利用固定细胞或活细胞进行荧光成像，以观察巨胞饮泡内聚集的葡聚糖信号。由于其体积较大，在某些细胞类型中也可通过相差显微镜或明场显微镜观察未标记的巨胞饮泡，此时巨胞饮泡呈现为较大的白色空泡。相差显微镜图像可提供一定的细胞背景信息，这些图像还可进一步与荧光图像叠加，以展示荧光葡聚糖的摄取情况12,13。不同大小和不同标记的葡聚糖可用于监测液体进入多种细胞及内吞途径的过程10,14,15，葡聚糖既可用于细胞培养体系，也可灌注至小鼠体内用于活体成像16，甚至可注射至果蝇胚胎中进行活体成像17。

使用葡聚糖追踪巨胞饮体时存在一些困难，包括细胞经固定或通透处理后葡聚糖从巨胞饮体中泄漏、在不进行强烈巨胞饮作用的细胞中葡聚糖浓度稀释或难以检测，以及在巨胞饮体成熟过程中葡聚糖在细胞内的动态分布和扩散3。这些问题在大多数实验中尤为突出，因为这些实验旨在追踪单次脉冲加入细胞后又被洗去的葡聚糖的摄取过程。

本文描述了一种将荧光葡聚糖应用于细胞并在活细胞成像过程中持续保留在培养基中的方法，以记录细胞对葡聚糖的连续摄取过程。该方法可增强大胞饮体及其后续内体中的葡聚糖信号，从而展示整个成熟通路。通过将标记的大胞饮体与未标记（黑色）的细胞内部进行高对比度的反向观察，可清晰呈现大胞饮体的所有特征；相反，在细胞外部，高荧光强度的培养基则凸显了细胞表面动态的膜皱褶活动。本方法涵盖了葡聚糖在光学显微镜、共聚焦显微镜下的活细胞成像，以及细胞固定后通过相关光电子显微镜（CLEM）进行检测的技术流程。文中所展示的成像实验在多种不同类型的细胞中进行，以证明该方法的广泛适用性，包括大胞饮作用非常活跃且迅速的活化巨噬细胞和小胶质细胞，以及大胞饮作用相对较少的癌细胞。

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方案

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1. 在35 mm玻璃底培养皿中接种细胞（第0天）

  1. 在含10%热灭活（用于RAW264.7）或普通胎牛血清及1% L-谷氨酰胺的完全培养基中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养和传代细胞系。
  2. 将适量细胞接种于35 mm玻璃底培养皿中，使其在24 h内达到60%融合度。
    ​注意：本实验所描述的RAW264.7、BV2小胶质细胞和MDA-MB 231乳腺癌细胞推荐接种密度为每毫升0.15 × 106 至 0.25 × 106 个细胞，接种体积为2 mL。

2. 荧光DNA质粒转染（第1天）——可选步骤

注意：不同的荧光标记蛋白和探针可以在克隆细胞系中瞬时或稳定表达，以特异性地标记肌动蛋白皱褶以及内吞途径中的区室，例如早期内体、晚期内体或溶酶体。

  1. 转染前一天在组织培养罩内接种细胞，然后使用脂质体转染试剂盒按照生产商说明书进行细胞转染。
  2. 将2 µg无内毒素的纯化DNA质粒溶于125 µL最低必需培养基（减血清）中。轻轻混匀，室温静置5分钟。
  3. 将5 µL转染试剂加入125 µL最低必需培养基（减血清）中稀释。轻轻混匀，室温静置5分钟。
  4. 将稀释后的DNA质粒与稀释后的转染试剂混合，室温孵育10分钟，然后逐滴加入细胞中。
  5. 在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中，将细胞与转染复合物共孵育3–4小时，随后更换为新鲜的完全培养基。
  6. 次日使用转染后的细胞进行实验，或进行有限稀释克隆以获得稳定表达的细胞系。

3. 内吞囊泡和巨胞饮囊泡的观察（第2天）

注意：使用不同分子量的荧光葡聚糖（10 kDa 分子量的 Dextran Alexa Fluor 488/647 和 70 kDa 分子量的 Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine，阴离子型，可被赖氨酸固定）来监测液相内吞进入多种内吞途径的情况14。其中，70 kDa 葡聚糖用于巨胞饮泡，10 kDa 葡聚糖用于所有途径。

  1. 将葡聚糖配制成2倍浓缩的悬液，浓度为200–500 ng/mL，使用预热的培养基，并加入细胞中。
  2. 可选：实验可能需要预先或同时添加补充剂或药物以调节内吞活性。例如，用生长因子（如200 ng/mL CSF-1）或激活配体（如100 ng/mL LPS 或 300 ng/mL CpG）预处理巨噬细胞和小胶质细胞，以增强细胞膜皱褶形成和巨胞饮作用。在完全培养基中进行葡聚糖摄取实验前，将癌细胞置于适当的无血清培养基中培养12–16小时。有关推荐的细胞密度，请参见步骤1.2。
  3. 为进行活细胞成像，将生长在玻璃底培养皿中的细胞置于倒置共聚焦显微镜载物台上，显微镜需配备37 °C加热板和5% CO2恒温保湿培养箱。
  4. 吸除多余培养基，保留500 µL完全培养基在玻璃底培养皿中。
  5. 选择合适的细胞区域并调焦。对于时间序列成像，在开始采集前预先选择合适的荧光激光器、滤光片和设置参数。使用以下设置以分辨单个细胞和巨胞饮体。
    1. 在配备63倍1.4数值孔径油浸Plan Apochromat物镜的倒置共聚焦显微镜上对目标区域进行成像。
    2. 图像尺寸设为512 × 512，采用双向扫描以实现快速成像。
    3. 聚焦于细胞的一个特定焦平面。设置为单层切片采集，或设置约0.3 µm的光学切片厚度（符合奈奎斯特采样定理），用于构建Z轴堆叠图像。
    4. 设置时间间隔为5秒的时间序列成像，持续时间为20–45分钟，具体时长根据细胞类型而定。
    5. 选择硬件自动对焦/焦点追踪功能，以在图像采集期间根据特定细胞类型维持适当的图像稳定性。
    6. 立即加入等体积的2倍浓度葡聚糖添加培养基，并立即开始对巨噬细胞进行活细胞成像。对于MDA-MB-231细胞中较慢的摄取过程，需在加样后等待20分钟再开始成像。
      ​注意：采用此方法，BV2细胞在加入葡聚糖混合物后，可在单一层面上以最大速度追踪连续成像45分钟，并成功获取两个荧光通道的图像。为了检测RAW 264.7细胞中的早期巨胞饮体（其巨胞饮作用发生非常迅速），应在加入葡聚糖后以5秒间隔进行20分钟的时间序列成像，采集单层切片（用于快速成像）或4–6层Z轴堆叠图像（用于三维成像）。对于MDA-MB-231细胞，建议采集10–15层的最优Z轴堆叠图像，时间间隔为5秒，持续40分钟。

4. 相关光镜与电镜（CLEM）（第3天）——可选步骤

  1. 根据方案的步骤1、2和3进行细胞准备，并作相应调整。简言之，将RAW264.7细胞以0.2 × 106 个/mL的密度接种于带网格的玻璃底培养皿（35 mm培养皿，No. 1.5 带网格盖玻片，玻璃直径14 mm，未包被）中，转染荧光质粒（例如mCherry-2xFYVE），过夜孵育后加入dextran-488（70 kDa），在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育20分钟。
  2. 用1 mL预冷的PBS快速洗涤细胞，随后用0.1%戊二醛固定。
  3. 在共聚焦显微镜下采集dextran-488和mCherry-2xFYVE的固定细胞图像。
  4. 在将培养皿送检进行透射电子显微镜（EM）分析前，先采集明场图像以确定网格位置，具体步骤如前所述18。简要而言，细胞经2.5%戊二醛进一步固定，1%还原四氧化锇后固定，2%醋酸铀进行块染，随后通过一系列乙醇梯度脱水，最后包埋于LX112树脂中。从包埋块中切取对应网格位置，使用超薄切片机收集超薄切片。在电子显微镜下以80 kV电压，结合适当的成像系统软件采集图像。

5. 数据处理与可视化（第4天）

注意：使用开源图像分析软件 FIJI 进行可视化和分析33。

  1. 复制原始数据以进行处理，以符合 F.A.I.R. 数据原则，即科研数据应具备可发现性（Findable）、可访问性（Accessible）、可互操作性（Interoperable）和可重用性（Reusable）。
  2. 利用直方图数据对图像集进行统一的亮度和对比度调整。
  3. 将所获取的Z轴层扫图像以最大强度投影方式显示。
  4. 为图像集插入比例尺。
  5. 裁剪或旋转视野（FOV）数据（可选），并为时间序列数据创建代表性图示。
  6. 为进一步分析和定量，将细胞摄取的葡聚糖荧光强度作为巨胞饮活性的衡量指标进行量化。为将分析限定于单个细胞，使用此处描述的成像方法。
    1. 反转查找表（LUT），使无荧光信号的细胞区域颜色发生翻转，以进行阈值分割。
    2. 分割前景目标，生成细胞掩膜以识别单个细胞。
    3. 结合本研究中所述的细胞掩膜与一种先前发表的方法19，用于识别并测量单个巨胞饮体。利用这些参数对巨胞饮作用进行定量，包括每个细胞中巨胞饮体的大小、数量及总摄取量。

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结果

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将未标记的活细胞浸没在高浓度荧光葡聚糖溶液中进行成像，相较于传统的巨胞饮作用追踪技术具有多项优势。通过以浮雕形式呈现图像，细胞本体呈黑色，与明亮的荧光背景形成对比，从而更清晰地观察到细胞表面剧烈的皱褶活动，以及随后富含TMR葡聚糖（70 kDa）的巨胞饮泡进行液相内吞的过程，如图1A所示。在此最大强度投影图像中，可观察到癌细胞从皱褶边缘处将巨胞饮泡摄入细胞内。细胞内部呈黑色，无背景荧光或离焦荧光干扰，因而能够高对比度地清晰界定巨胞饮泡，精确展示其大小和形态，并揭示其在成熟过程中发生的动态变化，如图1B所示，并在图1C的视频序列中进一步突出显示。同型融合伴随巨胞饮泡体积增大（图1C），且巨胞饮泡的管状结构清晰可见（图1D）。因此，我们现在能够对巨胞饮泡携带液相货物进入细胞及其后续成熟各阶段的动态轨迹进行成像。活细胞成像避免了使用化学固定剂可能引...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种对传统葡聚糖标记法的改进，用于通过持续将细胞浸泡在荧光葡聚糖溶液中并结合活细胞成像，追踪巨胞饮作用。该方法可在无标记细胞的暗背景上直观显示胞吞过程。优化后的实验方案能够区分不同的细胞内囊泡，并实现对多种巨胞饮和内吞货物及蛋白的时空动态追踪。将细胞浸入葡聚糖培养基以监测液相内吞动态过程的方法最早在 盘基网柄菌23. 其他先前研究的示例也采用浮雕成像观察细胞摄取情况15,16本文所述方案对该方法提供了更全面的处理与分析，将有助于在未来多种细胞和组织环境中的研究。该方法同样适用于浸泡在葡聚糖中的类器官 体内 在右旋糖酐通常被灌注或注射到难以清洗的组织、胚胎和完整生物体的实验环境中。

分别或同时摄取小分子和大分子葡聚糖，可为定量分析以及巨胞饮作用与其他内吞途径的比较提供有力的实验体系。在双标记样品中，可通过红色和绿色通道分别区分早期内体群体，或进行图像合并以实...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Tatiana Khromykh 提供的专业技术协助。荧光成像在 IMB 显微镜中心完成，该中心包含由澳大利亚癌症研究基金会资助的癌症超微结构与功能设施；电子显微镜实验在昆士兰大学显微镜与微分析中心完成。本研究获得澳大利亚国家健康与医学研究理事会（JLS APP1176209）和澳大利亚研究理事会（DP180101910）的资助。NDC 由陈·扎克伯格倡议组织 DAF（硅谷社区基金会下属的受托基金）通过资助编号 2020-225648 作为 CZI 成像科学家提供支持。YH 获得澳大利亚政府博士奖学金以及 Yulgilbar 阿尔茨海默病研究计划的资金支持。Z-JX 获得中国科学院奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2% 四氧化锇ProSciTechEMS19192
647-转铁蛋白Molecular Probes, Invitrogen  T23366
BV2 细胞由利维乌·博迪亚博士（昆士兰脑研究所）慷慨馈赠-
CpG（B类）BIntegrated DNA Technologies定制订单
10 kDa 分子量的葡聚糖 Alexa Fluor 488 Life Technology Australia Pty LtdD22910
10 kDa 分子量的葡聚糖 Alexa Fluor 647 Life Technology Australia Pty LtdD22914
70 kDa 分子量的葡聚糖 Oregon Green 488Life Technology Australia Pty LtdD1818
70 kDa 分子量的葡聚糖四甲基罗丹明Life Technology Australia Pty LtdD7173
含丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺的 DMEM 培养基Gibco Invitrogen#11995
胎牛血清Interpath Services Pty LtdSFBS-F
25% 水溶液戊二醛，电镜级ProSciTechC002
Jeol 1011 电子显微镜JEOL-
L-谷氨酰胺Gibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  35 mm 无涂层网格玻璃底培养皿MatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek 35 mm 无涂层玻璃底培养皿MatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 细胞ATCCHTB-26
Opti-MEM 低血清培养基Thermo Fisher Scientific31985088
质粒 mCherry-2XFYVE由弗雷德里克·穆尼耶博士（昆士兰大学）慷慨馈赠-
质粒 mCherry-PLCδ-PH由弗雷德里克·穆尼耶博士（昆士兰大学）慷慨馈赠-
Raw264.7 细胞ATCCTIB-71
不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基Gibco Invitrogen#21870
超纯 LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
醋酸铀酰ProSciTechC079
蔡司 LSM880 倒置共聚焦显微镜Zeiss-

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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