方法文章

用于再生医学的高保留人脱细胞皮肤基质制备的脱细胞化方法

DOI：

10.3791/62935

⸱

2021年9月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Public Health, University of Naples Federico II, Naples, Italy, 2Department of Medicine, Surgery and Dentistry, Scuola Medica Salernitana, University of Salerno, Baronissi, Italy

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脱细胞人皮肤适用于组织再生。脱细胞过程中的一个主要问题是保持天然结构架构，同时保留适量的结构蛋白、糖胺聚糖（GAGs）和生长因子。本研究所提出的方法可实现快速且有效的脱细胞，所获得的脱细胞皮肤具有良好的天然特性保留。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外基质（ECM）因其含有多种生物活性分子，可为周围细胞的自我更新、增殖、存活和分化提供生物物理和生化刺激。基于这些特性，ECM 近来被认为是一种极具前景的生物支架材料，可用于促进组织再生。新兴研究表明，去细胞化的人体组织在结构和生化特征上可模拟天然 ECM，保留其三维（3D）结构以及关键生物分子的成分。因此，去细胞化 ECM 可用于促进多种器官的组织重塑、修复及功能重建。选择合适的去细胞化方法至关重要，以获得能够保留细胞理想微环境特性的无细胞组织。

本文所述方案详细介绍了获得可重复且高效的无细胞生物细胞外基质（ECM）的脱细胞方法。来自接受整形手术患者的皮肤碎片经裁剪后，采用十二烷基硫酸钠（SDS）、Triton X-100 和抗生素联合处理进行脱细胞。为促进溶液在样品中的规律且均匀传输，将样品置于包埋盒中，以避免机械损伤。脱细胞处理后，皮肤碎片呈现雪白色，表明脱细胞已完全且成功。此外，脱细胞样品显示出完整且保存良好的结构架构。结果表明，所提出的脱细胞方法高效、快速、可重复，并能有效保护样品结构免受损伤。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外基质（ECM）为细胞提供支架，通过不同组分维持的复杂结构对细胞起支持作用，是决定心脏及心肌组织机械特性和功能的主要因素之一1,2。越来越多的证据表明，ECM在组织重塑中发挥着主动作用，使得过去认为ECM仅为被动组分的传统观点已不再成立3,4,5,6。ECM的作用是为局部细胞提供生物物理和生化信号。已有充分研究证实，这些信号可影响多种基本的细胞行为，进而调控细胞的收缩功能、增殖、迁移以及分化潜能7,8,9。因此，ECM正越来越多地被应用于组织工程和再生医学中，作为治疗支持工具9,10,11,12,13。

细胞外基质（ECM）由多种蛋白质组成，如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和层粘连蛋白，以及与ECM结合的生长因子，这些成分均参与组织再生机制，包括细胞募集、迁移和分化，以及细胞排列与增殖14。组织的力学特性在器官的生理病理过程中也具有重要意义。事实上，力学特性的改变常与多种疾病的起始和发展相关。其原因在于，当细胞外基质发生改变时，来自微环境的信号会诱导基因和蛋白质表达发生变化，从而导致功能障碍15,16。

目前，器官修复的再生疗法主要致力于复制天然组织复杂的微环境，以在机体自身无法修复时实现器官的愈合。尽管组织工程领域的多种方法发展迅速，但人工手段仍难以完整而精确地再现组织的全部复杂性。迄今为止，合成材料已被广泛使用，因其可被适当调控以模拟细胞微环境的力学和生化特性。然而，这些材料存在局限性，例如难以模拟天然组织内部的多种相互作用、制备技术成本较高，以及相较于天然组织其自然性和生物相容性较差17,18,19。此外，它们在蛋白质和可溶性因子等组分上与天然组织存在显著差异，而这种天然组成极难复制20。

再生医学领域的前沿方法是利用脱细胞化细胞外基质（d-ECM）制备支架，并以适当的细胞类型重新定植，从而缩小患者需求与器官移植之间的差距。脱细胞化是指将细胞外基质（ECM）从其原有的细胞和遗传物质中分离出来，形成一种天然且具有生物模拟特性的支架，能够在植入患者体内后避免免疫反应和排斥反应21,22,23。由此获得的ECM可进一步重新接种细胞，以生成功能性组织。开发d-ECM过程中面临的主要问题在于所采用的方法。无论使用何种脱细胞化技术，首要目标始终是保持ECM原有的成分、刚度和三维结构，而各种策略均存在各自的优缺点。由于需要清除组织中的细胞成分和DNA，必须使用化学或物理试剂，或二者联合使用，因此每种脱细胞化过程都会在不同程度上造成ECM的破坏。因此，最大限度地减少对ECM的损伤至关重要24,25,26。

利用天然细胞外基质作为重建天然细胞外基质的平台 体外 是十分理想的。为此，已有多种脱细胞化方案被应用于多种组织27,28,29,30事实上，自脱细胞化研究和细胞外基质（ECM）开发初期以来，已对来自动物和人类的多种组织（如动脉、主动脉瓣和外周神经）进行了脱细胞处理，其中一些脱细胞细胞外基质（d-ECM）至今仍作为商品化产品用于组织替代或伤口愈合31,32,33近年来，由于人皮肤的组成和机械性能能够增强心脏前体细胞（CPCs）的再生潜能并适应心肌收缩力，因此也成为制备用于心脏修复的脱细胞支架的理想候选材料。34本文描述了一种简单快速的方案，用于从成人人类皮肤制备脱细胞支架，从而获得结构良好保存的脱细胞细胞外基质（d-ECM）。

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方案

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人体组织标本的采集遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并遵守大学医院 "Federico II" 的指南。本研究中所有患者均签署了书面知情同意书。

1. 溶液的配制

  1. 1% 脱细胞溶液 1200 mL 的制备
    1. 通过量筒量取 588 mL 双蒸水，转移至 1 L 烧杯中，配制 600 mL 2% Triton X-100 溶液。使用血清移液管向烧杯中加入 12 mL Triton X-100 和一个搅拌子。将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至 Triton X-100 完全溶解。
    2. 停止搅拌。使用搅拌子回收器取出搅拌子。室温保存。
    3. 通过量筒量取 550 mL 双蒸水，转移至 1 L 烧杯中，配制 600 mL 2% SDS 溶液。
    4. 在塑料称量舟中称取 12 g SDS 粉末，并转移至步骤 1.1.3 中含有双蒸水的烧杯中。
      注意：步骤 1.1.4 必须在化学通风橱中操作，操作者应佩戴个人防护装备。
    5. 加入一个搅拌子，将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至 SDS 完全溶解。
    6. 停止搅拌过程。使用搅拌子回收器取出搅拌子。
    7. 将溶液转移至量筒中，用双蒸水定容至 600 mL。
    8. 将步骤 1.1.1 中配制的 2% Triton X-100 溶液倒入 2 L 量筒中。
    9. 将步骤 1.1.3–1.1.7 中配制的 2% SDS 溶液倒入同一 2 L 量筒中，总体积达到 1200 mL。
    10. 用封口膜封口，轻轻倒置混匀，获得均一溶液。
    11. 使用漏斗将混合溶液转移至 2 L 瓶中，避免产生泡沫。溶液于 +4 °C 保存。
  2. 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）的制备
    1. 将 0.1 g 一水合磷酸二氢钾、0.1 g 氯化钾、4.0 g 氯化钠和 0.575 g 二水合磷酸氢二钠溶解于无菌双蒸水中，配制 500 mL 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS）。检测 pH 值（7.4）。
    2. 使用前于 +4 °C 保存。
  3. 抗生素溶液的制备
    1. 在塑料称量舟中称取 625 µg 两性霉素 B。
    2. 用移液器吸取 8 mL 青霉素-链霉素（青/链）混合液，加入 15 mL 离心管中。
    3. 将称量好的两性霉素 B 加入青/链混合液中，再加入青/链混合液定容至 10 mL。盖紧管盖，剧烈振荡使两性霉素 B 溶解。

2. 第1天——开始脱细胞程序。

  1. 将400 mL脱细胞溶液倒入500 mL烧杯中。
  2. 加入2.0 mL抗生素溶液。

3. 皮肤样本的制备

  1. 将接受腹部整形术患者的腹部人皮肤样本置于塑料托盘中，用0.9% NaCl等渗生理溶液通过振荡并反复翻转清洗，以去除多余的血液及其他生物体液。
  2. 使用精细镊子去除毛发，并用大型手术剪去除脂肪组织。
  3. 将皮肤样本放置于解剖板上，以解剖板上的刻度为参考，使用解剖刀进行切割，获得3 cm × 2.5 cm（长×宽）的组织片段，注意避开瘢痕、污损或烧灼区域。
  4. 将每个组织片段放入包埋盒中，关闭盒盖，并确保所有包埋盒均牢固锁紧，以防脱细胞过程中样本泄漏。
  5. 将最多四个装有样本的包埋盒放入烧杯中，并加入脱细胞溶液。放入搅拌子，用铝箔覆盖烧杯，在铝箔顶部标注所有用于识别样本及记录操作起始时间的信息。
  6. 将烧杯置于磁力搅拌器上，以150 rpm的转速开始搅拌。停止搅拌后，揭开覆盖的铝箔，用长柄镊子取出包埋盒。
    注意：停止搅拌后，应检查溶液的澄清程度。根据细胞碎片释放导致的溶液浑浊程度，调整搅拌时间（少于或超过8小时）。
  7. 将每个包埋盒转移至100 mm培养皿中。更换脱细胞溶液，并重复步骤3.5–3.6过夜。

4. 第2天——检查皮肤样本的状态。

  1. 停止振荡过程。移去覆盖烧杯的铝箔，用长镊子取出包埋盒。
  2. 将每个包埋盒放入一个100 mm培养皿中并打开，观察样品的颜色。
    注意：样品颜色可能从原本的浅褐色变为雪白色。
  3. 去除残留毛发，并将表皮与真皮分离。重复步骤3.5–3.6，更换脱细胞溶液。
  4. 8小时后停止振荡。重复步骤4.1–4.2，直至样品呈现雪白色，然后终止脱细胞过程。
    注意：如有需要，可延长样品接触去垢剂的时间。
  5. 用量筒量取400 mL的1×PBS，倒入500 mL烧杯中，加入2 mL青霉素-链霉素/两性霉素B混合液，放入搅拌子。
  6. 每个盛有1×PBS/抗生素溶液的烧杯中最多放入四个含有样品的包埋盒，用铝箔覆盖，并在顶部标注所有信息，如同步骤3.5所示。
  7. 将烧杯置于磁力搅拌器上，在室温下以150 rpm的转速持续振荡过夜。

5. 第3天——样本的最后一次洗涤

  1. 停止振荡。将1× PBS溶液替换为400 mL的双蒸水，加入搅拌子。用铝箔覆盖，并在顶部如步骤3.5所述写明所有信息。
  2. 将烧杯置于磁力搅拌器上，以150 rpm的转速开始搅拌，持续30分钟。
  3. 停止搅拌过程。移去覆盖烧杯的铝箔，用长镊子取出包埋盒。
  4. 将每个含有脱细胞皮肤样本的包埋盒放入一个100 mm培养皿中。打开包埋盒，用实验室擦拭纸轻轻按压皮肤样本以吸干水分。
  5. 将每份脱细胞皮肤样本放入已标记样本信息的称量舟中。用铝箔覆盖称量舟，并在顶部写明所有信息以标识样本。于-80 °C保存。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案的目的是从生物组织中获取皮肤脱细胞细胞外基质（d-ECM）样品，同时保持其结构良好的三维结构以及生物分子成分的充分保留（图1）。该方法主要基于在含有两种去污剂Triton X-100和SDS的溶液中持续搅拌样品，从而在缩短脱细胞过程暴露时间的同时，保留天然组织典型的生物学和结构特征。样品收到后，经清洗并进行预处理，制备成3 cm × 2.5 cm大小、无毛发或脂肪组织残留的洁净皮肤片段（图2和 图3）。使用包埋盒可最大限度减少组织损伤（图3），从而获得结构更为完整的样品。经肉眼观察，脱细胞后的皮肤未显示明显的机械或化学损伤迹象。在脱细胞过程中，表皮层发生脱落（图4A、B），样品颜色由天然组织典型的米色转变为雪白色，表明脱细胞已完全且成功（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管上述方案相较于先前发表的方法已得到优化和改进，但仍存在几个需要特别注意和精确操作的关键步骤。在配制脱细胞溶液时，必须避免产生泡沫，以防去垢剂被错误稀释。可通过缓慢倾倒溶液并使其沿容器内壁流下以减少泡沫产生。此外，在手动去除样品中的脂肪组织时需格外小心，因为使用Triton X-100和SDS等去垢剂进行脱细胞处理并不能有效清除脂肪，残留的脂质可能对方法的有效性产生不利影响。另一个关键步骤是从样品中去除表皮。在脱细胞过程中，表皮会逐渐从皮肤表面分离。在此阶段，必须仅在表皮已完全松脱时，才使用镊子将其剥离，以避免撕裂或碎片化，防止碎片残留在组织内部。

本方案主要通过两种策略来降低脱细胞化过程对样本的影响：一是联合使用两种去污剂以缩短样本在处理过程中的暴露时间28,35,36；二是将样本置于包埋盒中，以保护其免受机械损伤37。此外，该方案在应用于皮肤以...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% NaCl 等渗生理溶液Sigma-AldrichS87760.9% 水溶液
1 L 烧杯VWR511-0318使用前清洗并高压灭菌
10 mL 血清移液管Falcon357551无菌的，  聚苯乙烯
100 mm 培养皿Falcon351029经处理的无菌细胞培养皿
15 mL 无菌管Falcon352097离心无菌管，聚丙烯
1 L 量筒VWR612-1524使用前清洗并高压灭菌
2 L 瓶VWR215-1596使用前清洗并高压灭菌
25 mL 血清移液管Falcon357525无菌的，  聚苯乙烯
2 L 量筒VWR612-3072使用前清洗并高压灭菌
500 mL 烧杯VWR511-0317使用前清洗并高压灭菌
两性霉素BSigma-AldrichY0000005粉末
解剖板VWR100498-398由高密度聚乙烯制成。
解剖刀VWR233-5526无菌且一次性使用
包埋盒Diapath070191外部尺寸：40×26×7 毫米（宽×深×高）
精细镊子VWR232-1317使用前清洗并高压灭菌
漏斗VWR221-1861使用前清洗并高压灭菌
六边形称量皿，M号Sigma-AldrichZ708585六边形，聚苯乙烯，底部内径 51 mm，顶部内径 64 mm
六边形称量皿，S号Sigma-AldrichZ708577六边形，聚苯乙烯，底部内径 25 mm，顶部内径 38 mm
大型手术剪VWR233-1211使用前清洗并高压灭菌
长柄镊子VWR232-0096使用前清洗并高压灭菌
青霉素和链霉素Sigma-AldrichP4333-100ml稳定保存，含青霉素10,000单位和链霉素10 mg/mL，0.1 μm 过滤。于 -20 保存°C.  溶液  应分装为较小的工作体积，以避免反复冻融循环。
移液枪Eppendorf613-2795Eppendorf Easypet® 3
塑料托盘VWRBELAH162620000耐腐蚀聚丙烯塑料托盘
氯化钾Sigma-AldrichP9333粉末
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP5665粉末
氯化钠Sigma-AldrichS7653粉末
十二烷基硫酸钠Sigma-Aldrich62862粉末
磷酸氢二钠Sigma-Aldrich94046粉末
刮勺VWRRSGA038.210使用前清洗并高压灭菌
勺子VWR231-1314使用前清洗并高压灭菌
搅拌子VWR442-0362使用前清洗并高压灭菌
搅拌子取出器VWR89026-262采用纯质、经FDA批准的PTFE模制而成
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1液体

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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