Kinetx：一种结合流式细胞术检测与分析软件框架的实时定量测量与分类血小板活化的方法

摘要

血小板对多种刺激可迅速产生反应。本文介绍了一种基于实时流式细胞术的血小板功能检测方法，以及新开发的定制开源软件（Kinetx），可用于定量测定血小板颗粒释放、纤维蛋白原结合和细胞内钙离子流的动力学参数。

摘要

血小板在血管损伤后迅速反应，并在多种刺激下发生激活，以限制血液流失。许多血小板功能检测方法仅测量在特定时间点后的终点反应，而非血小板激活的速率。然而，血小板将胞外刺激转化为功能性反应的速率，是决定其响应损伤、结合正在形成的血栓以及信号传导以募集其他血小板效率的关键因素。本文介绍了一种基于流式细胞术的血小板功能检测方法，可实现样本刺激与数据采集的同步进行，并利用新开发的开源定制软件（Kinetx），对血小板颗粒释放、纤维蛋白原结合及胞内钙离子流进行定量动力学测量。Kinetix 使用 R 语言开发，用户可调整平滑程度、异常数据点识别或时间尺度等参数。为方便不熟悉 R 环境的用户，Kinetix 的数据分析可通过单条命令完成。该方法可准确且可重复地测量和分类实时血小板激活指标，如激活速率、加速度、达峰速率时间、达峰钙浓度时间以及定性形态变化。对血小板激活过程的动力学测量，可深入揭示其在激活初期的行为特征，并可能为预测血小板向正在形成的血栓募集提供方法。

引言

血小板在止血过程中发挥核心作用，能够对血管损伤产生快速且多方面的反应^1,2。目前的血小板功能检测方法可测量血小板反应性的不同方面，以代表其在体内的止血功能。in vivo。传统上，血小板功能评估依赖终点法检测，通过测量经充分刺激以达到最大程度活化的血小板的纤维蛋白原结合、颗粒释放或聚集情况来实现^3,4。这些检测方法未考虑血小板将胞外刺激转化为胞内信号和钙离子流，进而发生脱颗粒并结合到正在形成的血栓中的所需时间。静脉内血流的剪切速率可达20 dynes/cm³，大动脉中可达80 dynes/cm³⁵，这凸显出血小板必须快速检测、处理并响应胞外刺激，以对抗高速血流，及时结合到形成中的血栓并支持其持续生长的重要性。

血小板活化速率可独立于血小板活化的最大程度而变化。整合素连接激酶（ILK）是一种参与调控血小板中β1和β3整合素的蛋白质。^6,7. ILK的抑制或特异性缺失 体内 证明在缺乏功能性ILK的情况下，血小板活化的速率受到影响，但其最大活化程度不受影响⁸在CALDAG-GEFI缺陷小鼠中，也观察到聚集速率和最大聚集水平的差异。^9,10一种通过RAP1参与调控内向外信号转导的信号分子¹¹.

这些发现表明，血小板活化速率与最大活化水平可以是相互独立的，因此对最大活化水平的测量可能无法准确描述血小板在此之前的活化行为。血小板达到活化状态所需时间的差异，可能极大地影响其在血栓生长初期与血栓的结合，从而影响血栓的结构及总体大小。血小板活化速率与最大活化水平之间的这种差异，凸显了建立一种能够准确测量血小板活化速率的检测方法的必要性，该方法也可用于检测人群中的个体差异。

本文介绍了一种能够实时准确测量血小板活化和钙离子流变的方法，并计算一系列参数，包括血小板活化的速率以及达到最大活化速率和最大钙离子流所需的时间。这些对血小板活化的动力学测量有助于更深入地了解血小板在血栓形成初期的行为，并提供了一种预测血小板被募集到正在形成的血栓中速度的方法。

方案

本方案使用了来自健康供体的全血和血小板，供体无基础性疾病，且未服用任何已知会影响血小板功能的药物，在获得书面知情同意后进行实验，并已获雷丁大学研究伦理委员会批准。

1. 血液采集及富血小板血浆的制备

1. 使用含有3.2%枸橼酸钠的真空采血管采集外周血
2. 弃去最初的3 mL血液。
3. 将血液在30 °C下静置30分钟，然后再进行离心。
4. 通过在室温下以140 x g离心20分钟制备富血小板血浆（PRP），随后在37 °C孵育以进行检测，检测需在离心后60分钟内完成。

2. 仪器准备

注意：非加压流体系统对于实时流式细胞术至关重要，因为血小板在流式细胞仪记录事件的同时即受到刺激。

1. 使用非加压流式细胞仪进行实时流式细胞术分析。
2. 若需在 37 °C 下进行实验，将小鼠解剖垫固定在载物台上以放置 96 孔板，并在实验全程将垫子加热至 37 °C。
3. 将 96 孔板置于加热垫上，以实现 37 °C 的持续孵育（图 1）

3. 检测准备

1. 纤维蛋白原结合与P-选择素表达
   1. 在4 °C条件下，用含5%牛血清白蛋白（BSA）的HEPES缓冲盐水（HBS；10 mM HEPES，pH 7.4；150 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgSO₄·7H₂O）包被聚丙烯96孔圆底未处理微孔板，过夜孵育。
   2. 在含5 mM葡萄糖的HBS（HBS-G）中配制抗体混合液。向HBS-G中加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗纤维蛋白原抗体（FITC-FGN；稀释比例1:37.5（v/v））和别藻蓝蛋白（APC）标记的抗P-选择素抗体（APC-CD62P；稀释比例1:37.5（v/v）），终体积为225 µL，并在37 °C下于96孔板中孵育。
   3. 在采集事件前立即以1:600（v/v）的比例将富血小板血浆（PRP）加入HBS-G-抗体混合液中。
      注意：使用低体积PRP可确保不超过事件计数上限，并减少样本中血小板聚集。预实验已评估血小板稀释比例，结果表明其不影响激活率。
   4. 将含有FITC-FGN（稀释比例1:37.5（v/v））、APC-CD62P（稀释比例1:37.5（v/v））及激动剂的激活混合液在37 °C孵育。激动剂包括凝血酶（thr；0.0012–1 U/mL），并加入Gly-Pro-Arg-Pro肽（GPRP；1.18 mM）、交联胶原相关肽（CRP-XL；0.004–10 µg/mL）、二磷酸腺苷（ADP；0.04–4 µM）、肾上腺素（epi；20–200 µM）、9,11-二去氧-11α,9α-环氧甲烷前列腺素F2α（U46619；0.02–5 µM）以及凝血酶受体激活肽6（TRAP-6；0.04–10 µM）。
2. 钙离子流检测
   注意：本实验使用商业钙离子检测试剂盒进行（材料表）
   1. 在4 °C条件下，用含5% BSA的HEPES缓冲盐水（HBS）包被聚丙烯96孔圆底未处理微孔板，过夜孵育。
   2. 配制钙离子检测试剂：向一瓶钙试剂中加入100 mL钙缓冲液和2 mL丙磺舒储存液（250 mM），配制成2倍浓度的钙试剂加载溶液。
   3. 配制Fluo-4/HBS-G：将钙检测试剂与HBS-G按1:1比例稀释，经0.22 µm滤膜过滤。向96孔板各孔中加入225 µL Fluo-4/HBS-G，并置于37 °C。
   4. 将PRP与Fluo-4/HBS-G以1:1比例稀释后，在37 °C孵育30分钟 。
   5. 在Fluo-4/HBS-G中配制激活混合液，并在37 °C孵育。激动剂包括凝血酶（1 U/mL）并加入GPRP、CRP-XL（0.5 µg/mL）、ADP（1 µM）、肾上腺素（20 µM）、U46619（1 µM）和TRAP-6（1 µM）。
   6. 在采集事件前立即向225 µL Fluo-4/HBS-G混合液中加入PRP/Fluo-4/HBS-G，最终PRP稀释比例（加入激动剂后）为1:600（v/v；0.5 mL加入至终体积300 mL中）。

4. 检测步骤与数据收集

1. 将流式细胞仪的流速设置为“慢速”，平均每秒记录1000个事件（eps），最高不超过3000 eps。将阈值设为20000，以避免记录细胞碎片。
2. 使用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）图门控血小板群体。在数据采集时，绘制FSC-A 对 SSC-A 图以准确圈定血小板群体，并绘制FL1或FL4 对时间图，以记录随时间变化的荧光事件。
3. 流式细胞仪需14秒开始记录事件；在此之后，让仪器在每个孔中继续记录5秒事件，然后使用加样枪头快速加入75 µL激活混合液 ，以确保迅速混匀（图1）。
4. 持续采集事件5分钟，并设置绘图以记录488 nm（FL1；533/30滤光片 - FITC-纤维蛋白原/FLUO-4）通道和633 nm（FL4；675/25滤光片 - APC-P-选择素）通道的信号随时间变化。
5. 将每个孔的488 nm和633 nm通道的绘图数据保存为CSV文件。

5. 数据分析

1. 下载最新版本的 Kinetx¹²。
   注意：下载内容包含分析该检测所产生的数据所需的全部代码，并附带一个来自十名供体的实验数据测试集以及相应的分析结果（这些结果可通过以下步骤重新生成并验证）（图 2）。
2. 设置 R 环境
   1. 通过 RStudio 环境使用编程语言 R。安装 R¹³、RStudio¹⁴ 及以下软件包：ggplot2、dplyr、plotrix、minpack.lm、tidyverse、psych。确保所有必需的前置软件包均已成功安装。
   2. 创建元数据：在与数据相同的目录中放置一个文本文件（命名为 wellData.txt）。该文件描述了激动剂、其浓度、所用抗体以及用于生成每个 CSV 文件的检测类型（功能检测或钙流检测）。
   3. 在相同目录中放置第二个文本文件（“IsotypeData.txt”），用于定义同型对照。下载包中提供的文件（“data/wellData.txt” 和 “data/IsotypeData.txt”）可作为模板，易于适配不同的激动剂、抑制剂和浓度。
   4. 分析数据：Kinetx 包含三个函数，定义见步骤 5.2.5–5.2.7。
   5. kinetxProcess.R：该函数用于处理原始的功能性流式细胞术数据。运行方式为输入 kinetxProcess('数据位置','输出存放位置','FL1'（用于 FITC-anti-fibrinogen）或 'FL4'（用于 APC-CD62P）)
   6. kinetxProcessCalcium.R：该函数用于分析并标注钙流数据。运行方式为输入 kinetxProcessCalcium('数据位置','输出存放位置','FL1')
   7. kinetxSummary.R：该函数用于汇总数据。运行方式为输入 kinetxSummary('数据位置','输出存放位置','FL1')。
   8. 要在测试数据上运行上述所有函数（5.2.5–5.2.7），请使用脚本（test.R）。
      注意：前两个函数将为每位供体生成图表，显示原始数据及拟合曲线。所有输出结果以及一份数据汇总电子表格将被保存至指定的输出目录中。

结果

功能性实时流式细胞术分析揭示了激动剂之间以及不同供体之间激活曲线形态的差异
使用 Kinetx 对功能性数据（P-选择素暴露和纤维蛋白原结合）进行分析时，会剔除超出合理范围的数据点（>200000 或 <1）以及 <2.80 s（将零时间设定为此时间点）的数据，随后将数据归一化至同型对照的中位值，并通过 loess 函数拟合平滑的移动平均曲线。Kinetx 还根据拟合的平滑曲线形态、绝对值及变化速率分配指标和分类，具体如下：（1）RoC —— 平滑曲线上前 120 秒内的平均上升幅度；（2）label —— 根据 FL1 的 40 和 80 以及 FL4 的 5 和 10 设定阈值，将反应分类为快速、中速或慢速；（3）EarlyRoC —— 平滑曲线上前 20 秒内的平均上升幅度；（4）shape —— 低应答者、上升型、线性或下降型（图 3A）—— 低应答者的判定标准为 FL1 < 4000 或 FL4 < 1000；“上升型”、“线性”和“下降型”的标签由 shapeMetric 决定，即 RoC(120 秒)/EarlyRoC：当 shapeMetric >2 时为上升型，shapeMetric 在 0.9–2 之间为线性，shapeMetric <0.9 时为下降型；（5）生成一个汇总数据的电子表格，提供 0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、60 s、90 s、120 s、180 s 时的信号水平和变化速率、同型对照中位值、最大与最小变化速率和加速度，以及所有标签和分类信息。

在30名供者中，分析了血小板在ADP、TRAP-6、CRP-XL、肾上腺素和U46617等激动剂单一浓度刺激后5分钟内纤维蛋白原结合及P-选择素暴露的情况。不同激动剂诱导的纤维蛋白原结合和P-选择素暴露指标显示，反应曲线形态存在显著差异（图3）。TRAP-6和ADP刺激的血小板表现出更快的纤维蛋白原结合加速过程，但在许多供者中，后期结合速度减缓（图3B）。CRP-XL、凝血酶和肾上腺素诱导的纤维蛋白原结合更倾向于呈现持续上升或线性反应速率。许多供者在CRP-XL刺激下表现出相对较长的滞后时间，之后纤维蛋白原结合速率才迅速增加。U46619的反应通常被归类为低水平。相比之下，除U46619再次表现为低反应水平外，其余所有激动剂诱导的P-选择素暴露更倾向于呈现线性或持续上升的反应速率（图3C）。

使用实时流式细胞术可准确测量血小板活化过程中的细胞内钙离子流
钙流测定的数据分析会剔除超出合理范围的数据点（< 2.80 s，将此点设为零时间），然后通过loess函数拟合平滑的移动平均曲线。Kinetx软件根据拟合曲线的形态、绝对值以及变化速率分配指标和分类，具体如下：（1）类别——根据钙反应早期上升、最大值以及从最大值下降的终末阶段所呈现的曲线形态进行分类，描述为线性型、峰型或持续型（图4A）；（2）速率——描述前30秒内的快速变化速率，定义为无变化、慢速、中速或快速（阈值分别为10、40和80）。Kinetx还会生成一个数据汇总电子表格，提供0 s、10 s、20 s、30 s、40 s、60 s、90 s、120 s、180 s时的信号水平及变化速率，以及最大和最小变化速率、加速度，同时包含所有标签与分类信息，并为每位供体生成对应的数据图。在30名个体中应用该方法检测钙流的示例再次显示，不同个体及不同激动剂之间存在不同的活化模式（图4B）。CRP-XL主要引起持续型钙反应，而TRAP-6的反应则多表现为峰型。其余所有激动剂主要引发线性型反应。

实时流式细胞术可识别不同激动剂及其浓度刺激下最大激活水平的差异
结果表明，实时流式细胞术能够检测到不同受体刺激下纤维蛋白原结合（图5A）和P-选择素暴露（图5D）最大水平的差异（10 µg/mL CRP-XL vs. 3 U/mL 凝血酶， P < 0.001；10 µg/mL CRP-XL vs. 1 U/mL 凝血酶， P < 0.001）。此外，该方法对激动剂浓度的变化具有敏感性，随着激动剂浓度升高，纤维蛋白原结合和P-选择素暴露的最大水平均相应增加（纤维蛋白原结合——CRP-XL：0.004 µg/mL vs. 0.4、5、10 µg/mL，P < 0.01；凝血酶：0.0012 U/mL vs. 1 和 3 U/mL，P < 0.01；ADP：0.04 µg/mL vs. 1 和 4 µM，P < 0.05）。

实时流式细胞术检测方法足够灵敏，能够检测到不同供体之间血小板活化速率的差异
通过将平滑移动平均法（loess）拟合到荧光数据，并据此计算纤维蛋白原结合和P-选择素暴露的最大速率，从而确定血小板活化的最大速率（图5B、E）。数据显示不同个体供体之间存在显著差异，而流式细胞术检测方法足以检测到这种差异。结果表明，增加激动剂浓度对纤维蛋白原结合的最大速率影响较小（图5B）。相比之下，P-选择素暴露的最大速率随凝血酶和CRP-XL浓度的升高而增加，但不随ADP浓度的升高而增加（图5E）。

使用实时流式细胞术可检测血小板活化滞后时间的差异
通过计算纤维蛋白原结合和P-选择素暴露达到最大速率的时间点，确定血小板活化达到最大速率所需的时间（图5C、F）。不同供体之间的纤维蛋白原结合及P-选择素暴露的最大速率存在差异，尤其在较低激动剂浓度下更为明显。随着CRP-XL浓度递增刺激血小板，较高浓度的激动剂达到纤维蛋白原结合最大速率所需时间更短，且供体间变异性较小；然而，该趋势在凝血酶或ADP刺激条件下均未观察到（图5C）。本实验表明，在某些情况下，增加激动剂浓度可缩短血小板活化启动所需的时间（即滞后时间），但不改变血小板活化的最大速率，且该检测方法能够同时评估这两个参数。

图1：湿实验实时流式细胞术。（A）抗凝全血经过（B）离心处理以获得富血小板血浆（PRP）。（C）将含有适当抗体或钙离子指示剂染料的稀释PRP加入96孔板中，置于非加压流式细胞仪上，并使用解剖垫维持在37 °C。在数据采集过程中，通过加样枪头快速向孔中加入含有抗体或钙指示染料及激动剂的激活混合液，以确保迅速混匀。（D）每个样本采集5分钟，每个孔的数据以CSV文件格式保存。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：数据分析流程示意图。（A）配置R分析环境，并创建元数据。（B）剔除异常值数据，并拟合平滑的移动平均（loess）曲线。（C）定义反应类型，以及（D）反应形状。（E）计算各项指标，导出数据，并为每位供体制作图表。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：实时血小板纤维蛋白原结合与P-选择素表达的Kinetx分析代表性结果。（A）Kinetx不仅提供最大变化速率（RoC）及不同时间点的RoC等指标，还可对曲线形态进行分类，从而提供关于血小板活化状态的额外信息，而这些信息难以通过单一指标捕捉。30名个体的代表性数据显示了在激动剂ADP、TRAP-6、CRL-XL、肾上腺素和U46619刺激下，实时血小板（B）纤维蛋白原结合和（C）P-选择素表达的典型变异情况。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：实时血小板钙流Kinetx分析的代表性结果。（A）Kinetx不仅提供最大变化速率（RoC）以及不同时间点的RoC等量化指标，还可对钙流曲线的形态进行分类，从而提供关于血小板活化的额外信息，而这些信息难以通过单一指标捕捉。30名个体的代表性数据显示了在激动剂ADP、TRAP-6、CRL-XL、肾上腺素和U46617刺激下，实时血小板（B）钙流反应的典型变异情况。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：激动剂浓度决定血小板最大活化程度，但不影响血小板活化速率。 血小板最大活化程度——纤维蛋白原结合（A）或 P-选择素暴露（D）——随激动剂（CRP-XL、凝血酶或 ADP）浓度显著正向变化。血小板活化速率（B 和 E）以及达到最大活化速率的时间（C 和 F）与激动剂浓度的变化无明显关系或仅有较弱关联。P 值表示在整个浓度范围内差异的显著性（Kruskal-Wallis 检验），星号表示与最低浓度相比，个别数值存在显著差异（多重比较检验）。* P < 0.05，** P < 0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

血小板检测、处理并响应激活刺激的速率可能是血栓形成的关键决定因素。先前的研究发现，抑制影响血小板激活速率但不影响其最终激活程度的信号分子，会导致不稳定血栓的形成⁸。目前许多血小板功能检测方法用于测量在不同条件和处理下血小板激活与聚集的程度；然而，这些方法并未考虑血小板激活的速率以及这一复杂过程所需的时间^3,4。本研究开发的基于流式细胞术的创新性检测方法能够可重复地动态监测血小板激活过程，并将其转化为一系列指标，用于计算血小板激活的最大速率以及血小板达到该最大速率并完全激活所需的时间。

实验数据凸显了实时检测方法在识别不同激动剂类型和浓度引起的反应差异以及个体间差异方面的能力。以往许多研究已表明，血小板反应性在健康个体之间具有高度变异性^15,16，提示血小板活化速率在人群中也可能存在显著差异。本研究的数据表明，血小板脱颗粒速率及纤维蛋白原与血小板结合的速率，其变异性甚至高于血小板活化的最大水平。这说明实时流式细胞术也可作为一项有价值且可靠的工具，用于识别人群中血小板反应速率的差异，并检测不同抑制性或促活化因子对血小板反应速率的影响，从而为评估血小板功能提供额外的测量手段。

当使用终点检测法测量血小板功能时，可比较不同激动剂之间纤维蛋白原结合或颗粒释放的程度。通过洛斯曲线（loess curves）对血小板活化最初5分钟内的纤维蛋白原结合情况进行比较，可展示实时检测法在解析血小板活化动力学差异方面的优势，而这些差异是单次终点检测法无法测量的。

实时检测所收集的数据表明，纤维蛋白原与血小板结合的速度模式因激活通路的不同而略有差异（图3）。为了准确评估血小板活化的动力学，必须使用非加压流式细胞仪，以实现数据采集与样本刺激的同步进行。此外，激动剂必须快速加入，以确保激动剂与血小板近乎瞬时且充分混匀。使用凝血酶、ADP和肾上腺素进行刺激时，产生相似的曲线，代表受体致敏后信号转导迅速启动，导致纤维蛋白原以快速且稳定的速度结合至血小板。相比之下，由CRP-XL刺激的血小板在初始受体致敏后，纤维蛋白原的结合速度起初非常缓慢；然而，在此初始延迟之后，其结合速率迅速上升。使用TXA2类似物U46619刺激血小板，则导致纤维蛋白原结合的初始速率较快，但随后迅速下降至极低水平，仅随时间推移出现轻微且稳定的结合增加。

Kinetx 被设计为开源、可重复且易于实施的工具，以解决专有软件存在的成本高和灵活性差等问题。因此，它必须基于非专有的软件进行开发。R 语言被选中，因为它在生物学家当中广泛应用、安装简便、免费且为开源软件。这一开源环境允许熟悉 R 的用户调整参数，例如平滑程度、异常数据点的识别或时间尺度。然而，为了帮助不熟悉 R 的研究人员，Kinetx 还被开发成可通过单条命令（根据所分析的数据类型，为 kinetxProcess 或 kinetxProcessCalcium）完成分析的形式。本文展示的 Kinetx 软件能够计算一系列指标，包括纤维蛋白原结合或 P-选择素暴露的最大水平、速率和加速度，以及这些最大值出现的时间点。利用这些数值，可以更准确地比较血小板在不同刺激通路作用下的活化动力学。

不同激动剂刺激下纤维蛋白原结合的最大水平以及纤维蛋白原与血小板结合速率之间的比较，是血小板活化速率可独立于最大结合量而变化的典型示例。比较经 0.04 µM ADP（3.85 LogFU）和 0.04 µg/mL CRP-XL（3.70 LogFU）刺激 5 分钟后的最大纤维蛋白原结合量，两种激动剂诱导的结合纤维蛋白原量相似（图 5A）。最大结合速率之间的差异更小（0.04 µM ADP：0.0050 LogFU/分钟；0.04 µg/mL CRP-XL：0.0054 LogFU/分钟），表明这两种刺激条件下纤维蛋白原结合的整体速率相近（图 5B）。然而，当比较血小板活化的滞后时间时，可观察到明显差异：CRP-XL 达到最大速率所需时间为 117 秒，加速过程明显慢于 ADP（47 秒即达最大速率）（图 5C）。因此，与 CRP-XL 相比，ADP 刺激引起的初始反应显著更快（P < 0.001）。综合观察这些指标可见，血小板对两种不同激动剂的动力学响应表现为：ADP 刺激引发快速的初始反应，随后缓慢加速并维持稳定速率；而 CRP-XL 刺激则导致初始活化速率较慢，在较晚阶段迅速加速，最终达到与 ADP 相似的整体结合速率和纤维蛋白原结合水平。这些在纤维蛋白原结合的最大水平、速率及加速过程中的差异表明，测量血小板活化速度涉及多个参数。实时检测结合 Kinetx 分析方法能够量化并比较这些参数，描述从受体致敏到血小板响应所需的时间，并可用于不同信号通路间的比较。

增加激动剂浓度对纤维蛋白原与血小板结合速率的影响不显著。然而，随着激动剂浓度的升高，达到纤维蛋白原最大结合速率所需的时间缩短，表明血小板以相对稳定的速率结合纤维蛋白原，而受体饱和在决定血小板结合纤维蛋白原的速度方面起着更为主导的作用。

本文所述的钙流测定及分析方法是一种快速且易于操作的钙离子检测方法，可作为额外样本整合到实时检测中，从而在同一批样本检测中同时分析钙离子、血小板纤维蛋白原结合以及P-选择素。定制的分析软件包可对钙流动力学进行深入评估，包括反应曲线形态、最大反应值以及达到最大反应所需时间。这些参数可用于比较不同供体之间的差异以及对各种药物干预的反应。血小板中的钙流此前已通过多种基于流式细胞术的检测方法进行了研究^17,18,19。Aliotta 等人¹⁴描述了一种精巧的检测方法，能够分析多种细胞内离子的动力学过程。本文所展示的钙流检测在先前已发表的方法基础上，进一步引入了分析软件包，从而提供了更高的灵活性，能够在短时间内对多位供体实现高通量分析，并对数据进行更深入的挖掘。

既往研究表明，某些信号分子的抑制或缺失会导致血小板活化速率发生改变，这直接影响血栓的形成^8,9。过去，可通过流式细胞术在多个固定时间点测量血小板活化动力学，进而用于计算和比较不同激动剂刺激下 GPIIbIIIa 外化等指标的速率²⁰。本文所述的实时检测方法及 Kinetx 分析提供了一种简单、免费且准确的方法，可用于测量静息血小板活化的速率和终点。该方法在识别血小板功能中具有生理相关性的变异方面可能具有重要意义，而这些变异在仅测量终点读数时可能被遗漏。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
9,11-二脱氧-11α,9α-环氧亚甲基前列腺素 F2α - U46619	Sigma-Aldrich, Poole, 英国	D8174-1MG
配备 BD Csampler 的 Accuri C6 流式细胞仪	Beckton Dickinson, 英国	660517 + 660519
二磷酸腺苷	Sigma-Aldrich, Poole, 英国	A2754-1G
APC 标记的抗 P-选择素（CD62p）抗体	BD Biosciences, 英国	550888
Corning 聚丙烯 96 孔圆底未处理微孔板	Sigma-Aldrich, Poole, 英国	CLS3879-50EA
交联胶原相关肽（CRP-XL）	CambCol, 英国
肾上腺素	Sigma-Aldrich, Poole, 英国	E4375-1G
FITC 标记的抗纤维蛋白原抗体	Dako, Agilent Technologies, 英国	F011102-2
Fluo-4 Direct 染料	Thermo-Fisher Scientific	F10472
凝胶加样吸头	Starlab, 英国	I1022-0600
Gly-Pro-Arg-Pro 肽	Sigma-Aldrich, Poole, 英国	G1895-5MG
凝血酶	Sigma-Aldrich, Poole, 英国	SRE0003-10KU
凝血酶受体激活肽 6（TRAP-6）	Bachem, St Helens, 英国	H-2936.0005
Vacuette 9NC 凝血用 3.2% 枸橼酸三钠（0.109 mol/L）	Greiner Bio-one LTD, Stonehouse, 英国	454327