方法文章

单颗粒干涉反射成像表征单个细胞外囊泡及其群体动力学

DOI：

10.3791/62988

⸱

2022年1月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center, 2NanoView Biosciences

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案介绍了用于细胞外囊泡（EV）尺寸、EV 数量、EV 表型及 EV 生物标志物共定位的多层级和综合性测量的单颗粒干涉反射成像技术。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外囊泡（EVs）是一类由大多数细胞分泌的、具有脂质双层结构的纳米级囊泡。EVs 携带多种不同的生物分子，包括蛋白质、脂质、DNA 和 RNA，被认为可在多种组织和器官中介导细胞间的通讯。近年来，EVs 作为疾病诊断的生物标志物以及多种疾病的治疗载体，受到了广泛关注。目前已有多种用于 EVs 表征的方法，但现有的 EVs 分析技术均存在各自的局限性。因此，随着这一前沿研究领域的不断发展，开发高效且可靠的 EVs 分离与表征方法仍是其中的关键步骤之一。本文提供了一种详细的实验方案，介绍单颗粒干涉反射成像传感器技术（SP-IRIS），该方法可用于直接检测未经纯化的生物样本或经其他方法纯化后的 EVs，并对其进行表征。这一先进技术可实现对 EVs 尺寸、EVs 数量、EVs 表型及生物标志物共定位等多层面、全面的分析测量。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外囊泡（EVs）是源于细胞的纳米级膜性囊泡，可从多种生物体液中分离获得，包括血液、乳汁、唾液、尿液、胆汁、胰液以及脑脊液和腹腔液。EVs 的产生源于 通过 三种主要机制：凋亡、释放 通过 多泡体与质膜的融合，以及质膜的出芽现象1有证据表明，细胞外囊泡（EV）可将供体细胞的组分转移至邻近或远端的细胞与组织，提示这些由膜包被的颗粒可能在旁分泌以及远距离或内分泌信号级联反应中发挥重要作用1,2,3由于细胞外囊泡（EVs）能够反映细胞的表型特征，其作为多种疾病诊断和治疗工具的潜力已成为当前研究的热点领域。4,5,6,7,8.

目前已开发出多种旨在对细胞外囊泡（EV）进行表征的方法9,10,11,12,13。这些方法大多可提供关于EV群体的独特且有价值的信息，主要针对的是整体样本。尽管其中部分技术能够提供有关单个EV内部或表面物质的详细信息，但在单个EV水平上对其进行表征仍存在局限性。例如，免疫电子显微镜可用于研究单个EV及其组成，但该技术通量较低，难以用于描述群体动态，且需要大量的方法学开发工作14。

近年来，单粒子干涉反射成像传感器（SP-IRIS）技术的开发与商业化， 通过 ExoView 平台通过一种常规且简单的自动化数据采集方法，实现了单个细胞外囊泡（EV）的表征。该技术的核心是芯片，一种尺寸为 1 cm × 1 cm 的 Si/SiO₂2 双层结构，可实现单个生物纳米颗粒的干涉测量。芯片上设有包含多个独立功能化抗体点的微阵列，支持最多六种不同捕获类型的多重检测。标准芯片包含常用的四跨膜蛋白标记物（CD81、CD63 和 CD9），用于孵育步骤中的捕获，用户还可添加额外的定制捕获点，以分离出不同于四跨膜蛋白标记物的特定EV亚群。孵育步骤完成后，每个捕获点均结合了大量表达相应标记物的EV。这些被捕获的EV可经简单洗涤、干燥后，在读取仪中进行扫描，定量分析结合在捕获点上的囊泡尺寸（50–200 nm），获得基于数量加权的粒径分布。 通过 SP-IRIS15该系统还提供三个荧光检测通道，用于对捕获的细胞外囊泡（EVs）进行免疫标记，并可同时提供每个荧光染料的平均荧光强度（该参数不受囊泡尺寸限制，不同于SP-IRIS测量）以及共定位信息。这使得用户能够根据每个EV上显示的四种不同生物标志物（一种捕获标志物加三种免疫荧光标记）来定义单个EV的亚群。该系统不仅限于通过免疫荧光检测表面蛋白，其可选的载荷检测方案还可使用户检测捕获EV内部的蛋白质以及跨膜表面标志物的腔内表位，同时评估EV膜的完整性。本文提供了一套详细的操作流程，阐述了在大量EV样本中获取关于EV尺寸和数量的一致性数据所需步骤，并可在单个EV水平上同时检测多达四种不同的生物标志物。该技术既可用于未经处理的生物体液，也可用于通过多种方法（如超速离心、超滤、沉淀试剂、免疫亲和捕获、微流控技术及尺寸排阻色谱）分离得到的EV。

以下方案采用既定的分离方法16，从HEK 293细胞培养基和小鼠血清中提取细胞外囊泡（EV）。该方案已成功应用于多种其他生物液体、细胞培养基，以及从生物液体中纯化的细胞外囊泡。本方案分为两天完成，典型实验的工作流程如图1所示。

芯片清洗的样本孵育流程图，包含标记和染色步骤。
图1：检测工作流程。 用于选择对样本进行何种分析的工作流程，包括粒径与计数分析、粒径计数联合表面染色分析，以及粒径计数联合载物染色分析。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血清样本根据堪萨斯大学医学中心（KUMC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案从小鼠采集。在这些实验中使用这些生物样本也已获得KUMC的批准。

1. 样品制备（第1天）

  1. 使用纳米颗粒追踪法或等效技术测定EV浓度。
  2. 用孵育溶液将样本稀释至浓度为 5 × 107–5 × 108 EVs/mL；所需样本体积至少为 50 µL。
    注意：对于EV浓度未知的样本，可使用总蛋白浓度1 µg/mL作为替代指标。若样本预期浓度较低，上样前应至少以孵育溶液进行1:1稀释。
  3. 将24孔板置于平坦、无振动且避免剧烈移动的表面上。
    注意：为增强对比度，可在板下方放置一张白纸。
  4. 向孔周围区域加入水（图2）。

24孔板中微生物静态液体培养装置，ddH2O添加蓝色染料以可视化。
图2：24孔板布局。图中显示了ddH2O分装位置（仅为了可视化目的添加了蓝色染料）以及芯片放置的孔位。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 芯片的准备与预扫描

  1. 从 4–8 °C 冰箱中取出装有芯片的密封 48 孔板，在打开密封前使其升至室温（约 15 分钟）。
    注意：此步骤至关重要，可避免芯片表面产生冷凝水，从而防止斑点受损。若打开包装后发现芯片表面有冷凝现象，应延长平衡时间，再取出其他芯片。
  2. 继续执行步骤 8，取出卡盘以准备进行预扫描运行（图 3）。
    注意：预扫描数据将用于识别在与样本孵育前即可在捕获斑点上检测到的任何颗粒，以便在分析步骤中将其排除。

用于DNA分离实验的电泳凝胶梳具，带框架，实验室设备。
图3：将芯片装入仪器所用卡盘的图像。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 使用镊子从48孔板中取出所需数量的芯片（每个样本使用一个芯片），并将芯片直接装入载物台进行预扫描运行。当所有计划用于实验的芯片均按步骤8所述完成装载和预扫描后，进入步骤2.4。
    注意：操作芯片时，切勿触碰芯片中央的方格区域，因为抗体捕获位点位于此区域，若被镊子触碰会造成损伤（图4）。

使用镊子测试LED显示屏对齐；示意图显示成功和失败的放置位置。
图4：芯片及其正确操作方法。（A）黄色虚线表示点样抗体的位置，即芯片的功能面。芯片编号位于该线下方（“58”）。该图还展示了正确的操作方式。（B）展示不恰当的芯片操作方式。（C）芯片的非功能面。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 将每块预先扫描的芯片功能化表面朝上放入已准备好的24孔板中。功能化表面可通过明显的编号、对齐网格以及中间的三个黑色方框轻松识别。非功能化表面则为平整的银色均匀表面。
  2. 使用尖头镊子确保每块芯片位于孔的中央（图5）。
    注意：将芯片置于孔中央至关重要，因为如果芯片接触孔壁，加样后样品可能被虹吸移除。

用于检测比较的微流控装置示意图，展示最佳设置（A）和次优设置（B）
图5：芯片在孔中正确放置的示意图。（A）芯片应置于孔的中央，四个角不得接触孔壁。（B）芯片放置不当的示意图，其中芯片的角接触到了孔壁。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 芯片与样品的加载及孵育

  1. 取35 µL已制备的样品（来自步骤1），用移液器将其加入芯片上。
    注意：务必小心避免产生气泡或用移液器枪头接触芯片表面，否则可能导致样品在芯片上分布不均，或损坏芯片上的抗体点。样品应均匀覆盖整个芯片表面。若在加样过程中样品发生沿芯片边缘爬液而损失，可向孔中补充样品至总体积250 µL，或补充孵育液至250 µL，并记录该样品稀释倍数的变化。
  2. 使用试剂盒中提供的板膜密封板子，以防止样品蒸发。
  3. 将样品/芯片在室温、无振动或移动的环境中，于密封板中孵育过夜（约16小时）。
    ​注意：过夜孵育后，用户应根据研究问题选择合适的第二天操作方案。若仅需获取EV的粒径和数量信息，请继续进行步骤4（第二天）；若需进行多种表面标志物分析，则跳至步骤5（第二天）。

4. 确定细胞外囊泡（EV）的大小和数量（第2天）

  1. 在含有芯片的每个孔的侧壁加入1 mL溶液A，注意不要将溶液直接加在芯片上，也不要让移液器吸头刮伤芯片。
  2. 将培养板置于摇床中，室温下以约500 rpm的速度振荡3分钟。
    注意：如果芯片在板上发出咔嗒声，应立即降低速度，使液体呈漩涡状但无咔嗒声。
  3. 移除 750 µL 液体。移液时避免倾斜培养板，以防芯片意外干燥。
  4. 使用4.1步骤中所述技术加入750 µL溶液B，在室温下以约500 rpm振荡3分钟。
  5. 重复步骤 4.3–4.4 两次，共用溶液 B 洗涤三次。
  6. 最后一次洗涤结束时，移除750 µL溶液，使每孔中剩余250 µL的B溶液。
  7. 加入 750 µL 双蒸水（ddH₂O）2O）并在室温下以约500 rpm振荡3分钟。
  8. 用 50 mL 去离子水填充一个 10 cm 的培养皿2用镊子将芯片逐个从孔中转移至培养皿中。
    注意：转移芯片时需保持水平，确保芯片不干燥。在更换 ddH₂O 之前，最多可同时清洗八个芯片。2O.
  9. 在 ddH₂O 中2用镊子夹住芯片边缘，在培养皿中旋转三圈以去除碎片。
  10. 以45°角将芯片从水中取出，并将芯片ID朝上放置于吸水纸上（图6).
    注意：芯片现已准备就绪，可进行读取。请跳至第8步，使用SP-IRIS读取仪进行扫描。

培养皿中镊子夹持小样品，材料分析装置示意图
图6：以45°角从ddH2O水中取出芯片的正确方法。（A）俯视图，（B）侧视图，展示取出芯片时应保持的角度。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 抗体溶液的制备（第2天）

  1. 向适当大小的离心管（0.5 至 3 mL）中每张芯片加入 300 µL 封闭液。
  2. 每 300 µL 封闭液中加入 0.6 µL 抗体。通过轻弹管壁混匀，并短暂离心。
    ​注意：相应试剂盒中包含针对人 CD9、CD81 和 CD63 或小鼠 CD9、CD81 和 CD63 的抗体。如需使用其他荧光标记抗体，应采用典型梯度稀释法，在 0.1 至 10 µg/mL 范围内确定最佳染色浓度，同时保持样本加样量恒定，方法与流式细胞术相同。

6. 通过免疫荧光染色测定细胞外囊泡的大小、数量及表型

  1. 在含有芯片的每个孔的孔壁一侧加入 1 mL 溶液 A，注意不要直接将溶液加在芯片上，也不要让移液器吸头刮伤芯片。
  2. 将板置于转速约为 500 rpm 的旋转摇床上，在室温下振荡 3 分钟。
    注意：如果芯片在板上发生碰撞，请立即降低转速，使液体呈漩涡状但无碰撞现象。
  3. 移除 750 µL 液体。在移除液体过程中避免倾斜板子，以防芯片意外干燥。
  4. 使用步骤 6.1 中描述的技术，向每个孔中加入 750 µL 溶液 A，并在室温下以约 500 rpm 振荡 3 分钟。
  5. 重复步骤 6.3 和 6.4 两次，共完成三次溶液 A 的洗涤。
  6. 最后一次洗涤结束后，移除 750 µL 溶液，每个孔中保留 250 µL 溶液 A。
    注意：若用户希望进行货物染色（Cargo Staining），请在此处进入步骤 7；否则进入步骤 6.7。
  7. 向每个孔中的芯片加入 250 µL 抗体溶液（步骤 5），用铝箔覆盖板子以避光，并在室温下于旋转摇床上振荡 1 小时。
  8. 加入 500 µL 溶液 A，使每孔总体积约为 1,000 µL。
  9. 立即移除 750 µL 溶液，再加入 750 µL 溶液 A，在室温下以约 500 rpm 在旋转摇床上振荡 3 分钟。
  10. 移除 750 µL 溶液，加入 750 µL 溶液 B，在室温下以约 500 rpm 振荡 3 分钟。
  11. 再重复步骤 6.10 两次，共完成三次洗涤。
  12. 加入 750 µL 双蒸水（ddH2O），在室温下以约 500 rpm 振荡 3 分钟。
  13. 在 10 cm 培养皿中加入 50 mL 双蒸水（ddH2O），用镊子将一个芯片从孔中水平转移至培养皿中。
    注意：转移时应保持芯片水平，确保其不干燥。最多可将八个芯片依次放入同一培养皿中，之后再更换新鲜的 ddH2O。
  14. 在 ddH2O 中，用镊子夹住芯片边缘，在培养皿中旋转三圈，以去除碎片残留。
  15. 以 45° 角将芯片从水中取出，将芯片 ID 面朝上放置于吸水纸上（图 6）。
    ​注意：芯片现已准备就绪，可进行读取。请跳至步骤 8（数据采集），获取在读板仪上设置芯片进行扫描的操作说明。

7. 可选的货物染色

注意：本方案可同时标记内部和表面标志物。

  1. 每个孔中保留 250 µL 溶液 A，再向每个孔中加入 250 µL 溶液 C。
  2. 立即置于轨道摇床上，设定转速约为 200 rpm，精确振荡 10 分钟。
    注意：此步骤及下方步骤 7.8 中，时间和较低的摇动速度均至关重要；确保转速仅使孔内液体缓慢旋转，并使用计时器准确计时。
  3. 与溶液 C 孵育 10 分钟后，向每个孔中加入 500 µL 溶液 A。
  4. 立即移除 750 µL 液体，再向每个孔中加入 750 µL 溶液 A，并在轨道摇床上以约 500 rpm 的速度于室温下振荡 3 分钟。
  5. 重复步骤 7.4 两次，共完成三次洗涤。
  6. 最后一次洗涤结束后，移除 750 µL 溶液，每个孔中保留约 250 µL 溶液与芯片一同留存。
  7. 向每个孔中加入 250 µL 溶液 D。
  8. 立即置于设定为约 200 rpm 的轨道摇床上，精确振荡 10 分钟。
  9. 与溶液 C 孵育 10 分钟后，向每个孔中加入 500 µL 溶液 A。
  10. 立即移除 750 µL 液体，再向每个孔中加入 750 µL 溶液 A，并在轨道摇床上以约 500 rpm 的速度于室温下振荡 3 分钟。
  11. 重复步骤 7.10 两次，共完成三次洗涤。
  12. 最后一次洗涤后移除 750 µL 溶液，然后返回上方步骤 6.7，进行染色并完成检测流程。

8. 数据采集

注意：使用 ExoView R100 从芯片采集数据的过程是自动化的，无需用户输入。有关加载芯片载体（即“chuck”）及数据采集的详细操作说明，请参见用户指南及其对应的视频教程17。

  1. 使用仪器背面的两个电源开关打开EV表征平台电源，然后通过双击桌面图标启动扫描软件。
    注意：当扫描软件启动时，读取器将自动进入主界面，并提示用户“打开门以加载芯片”。
  2. 通过抬起读取器前面的银色把手打开门。这将弹出载物台，使用户能够接触到卡盘，并在软件中设置新的扫描。
  3. 通过点击保存文件夹并选择一个目标位置，确定用户希望保存数据的位置。
    注意：通常建议将保存位置命名为具有提示性的名称（如实验名称），然后创建两个子文件夹，一个用于预扫描数据，另一个用于后扫描数据。这有助于在分析过程中更方便地查找和匹配数据。
  4. 要扫描芯片，请在控制计算机上找到相应的芯片文件。
    注意：芯片文件是当前所用芯片上抗体点阵布局的地图，使扫描仪能够识别每个芯片上的扫描位置。每个试剂盒中均附带一个包含对应芯片文件的U盘。收到试剂盒后，应将这些文件保存至控制计算机上的固定位置，以便用户可靠地查找。
  5. 将芯片加载到卡盘上，使芯片上的编号朝向卡盘的把手方向；然后在计算机的芯片下拉菜单中，从芯片文件列表中选择每个芯片，并将其放置在扫描软件中虚拟卡盘的相应匹配位置。完成后，屏幕上将出现提示，要求用户“将卡盘放置到载物台上”。
  6. 将已加载芯片的卡盘放置到载物台上；卡盘上的磁性对位结构会自动将其调整至载物台上的正确位置，然后点击“将卡盘放置到载物台上”旁边的确定按钮。扫描仪将随即开始自动数据采集程序。
    ​注意：当软件报告每个芯片的扫描状态为“成功”时，数据即可用于分析。

9. 数据分析

  1. 在控制电脑桌面上双击ExoView Analyzer。软件启动后，点击Prescan Data按钮，并在第8.3节中选择预扫描数据集的文件夹位置。
  2. 点击Postscan Data按钮，并在第8.3节中选择后扫描数据集的文件夹位置。
    注意：如果在两个文件夹中均正确检测到数据（至少部分芯片），软件将在芯片文件位置按钮旁显示检测到的芯片数量“X”。正确保存时，检测到的芯片数量应与扫描的芯片数量一致。
  3. 在数据加载区域底部点击Next。
  4. 在元数据表下拉菜单中，每个芯片对应一个单元格。通过点击相应的框并输入信息，填写样本名称、稀释倍数以及各检测通道所使用的标记物；完成后再次点击Next。
    注意：此元数据将随数据一同保存。
  5. 点击左上角QC按钮下方的Disable标签，执行质量控制（QC）。
    注意：此功能允许在分析中关闭特定探针或芯片。软件将提供两种关于数据的警告：一种是高计数值，可能表示某个捕获信号已饱和；另一种是高变异系数（CV），表示某类捕获的重复样本之间存在差异。
    1. 点击高CV的Warning Spot，查看软件标出的点位，检查是否存在明显的物理损伤；确认损伤后，点击Spot Number以在分析中关闭该点位。
    2. 重复此过程，直至所有警告均被评估完毕，然后点击Next。
  6. 点击左上角QC按钮下方、Disable标签旁边的Cutoff标签，执行阈值分析。
    注意：此步骤将以图表形式显示对照点的荧光响应，并为用户提供每个颜色通道（红/绿/蓝）的最小值和最大值设置。为每个荧光检测通道设定阈值是唯一需要进行的数据调整，操作相对简单。重要的是，所选的最终阈值应在整个实验中保持一致，通常应遵循经验规则：红色和绿色通道为300–400 a.u.，蓝色通道为400–700 a.u.；软件也为此范围提供了颜色编码的参考指南。
    1. 点击Green Color标签，加载该通道的数据并显示当前阈值。观察同型阴性对照点，可能会发现荧光强度极低的检测信号；此时，用户通常应将绿色通道阈值设为300–400 a.u.。
      1. 逐步提高各检测通道的最小值，直到数据展示下方的“Avg % Inc”（高于阈值的对照点上检测到的颗粒平均百分比）在单元格中不再出现红色或黄色高亮警告。
        注意：最大值通常无需从默认值调整，但可适当降低以过滤强荧光颗粒或将荧光检测范围限制在更窄区间。
      2. 点击Next按钮。
    2. 点击Red Color标签，加载该通道的数据并显示当前阈值。再次检查同型阴性对照点，可能会观察到荧光强度极低的检测信号；此时，用户通常应将红色通道阈值设为300–400 a.u.。操作步骤与9.6.1.1–9.6.1.3相同。
    3. 点击Blue Color标签，加载该通道的数据并显示当前阈值。同样检查同型阴性对照点，操作步骤与9.6.1.1–9.6.1.3相同。
      注意：蓝色通道具有特殊性，因其点位中的抗体本身具有足够水平的自发荧光，即使在空白芯片上也需要略高的阈值，通常为400–700 a.u.。
  7. 完成阈值分析后，点击Next，热图将显示，提供整个实验中颗粒结合情况的概览。用户可使用多种可视化工具绘制数据。通过点击Add Plot Report按钮，可将这些图表及关联的原始数据添加至报告中。
    注意：热图是默认的数据展示方式，显示某一特定检测下所有样本、所有捕获点的综合视图。默认展示的是结合到每个捕获点的独特EV总数。
  8. 点击Export Report按钮，并选择报告的保存位置。
    注意：报告将在浏览器中打开。查找附在报告中的“Filtered Particle List”电子表格文件；该文件即为需提交至EVTRACK的信息。
  9. 继续使用屏幕顶部下拉菜单中的不同“样本”和“捕获类型”选项添加报告。数据展示由左上角的通道检测按钮控制。通过点击各颜色按钮，可切换该检测通道的开启（彩色）或关闭（灰色）状态，以设定特定的表型/样本选择/捕获通道。
  10. 点击Add Plot to Report按钮，将所需图表汇总至报告中。
  11. 点击Export Report，并定义最终报告的保存位置。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图7（左图）显示了一个三色复合图像，该图展示了来源于HEK293条件培养基的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡结合在芯片的CD63点上，并分别在绿色、红色和蓝色通道中对CD81、CD63和CD9进行染色。图7（右上图）为放大图像，显示每个被捕获的EV可表现出一种或多种颜色在各通道中的共定位，且各通道信号强度不同。被捕获EV染色的差异反映了三种四跨膜蛋白在单个囊泡上表达的异质性，可通过数据分析软件进行量化。图7（右下图）展示了EVs的粒径分布直方图，其粒径均大于50 nm。粒径直方图显示，在CD63点上捕获的EVs的众数粒径为50 nm。每个结合在点阵上的EV的荧光共定位、信号强度和粒径构成了表型数据，这些数据是测量中的基础数据。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前的细胞外囊泡（EV）表征方法在很大程度上依赖于纯化的EV，而这受到现有EV纯化技术实验局限性的制约9,10,11,12,13。单颗粒干涉反射成像技术（SP-IRIS）是一种有效的技术，能够消除样本分析所需的纯化步骤，从而节省时间并降低典型EV工作流程中的成本。该方法所需的样本投入量通常非常小，剩余样本仍可用于其他分析方法。

此外，以抗原特异性方式检测细胞外囊泡（EVs）的能力，对于基础EV研究以及诊断和治疗应用中的稀有事件检测都具有重要意义。然而，与血液中其他循环EVs和污染物相比，疾病特异性的EVs可能浓度较低2,11,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clayton Deighan 和 George Daaboul 是 NanoView Biosciences 公司的员工和股东。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分由堪萨斯大学医学院研究设备与资源采购奖项目资助。PCG、LKC、FD 和 AR 获得了美国国家老龄化研究所（NIA）R21 AG066488-01 项目资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 厘米无菌培养皿FisherFB0875712
15 毫升无菌离心管n/a各种
24 孔细胞培养板，平底Fisher08-772-1
封闭溶液NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
芯片文件（Chipfiles）NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
芯片（Chips）NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
芯片夹具（Chuck）NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
Corning Easy Grip 一次性聚苯乙烯无菌瓶，250 毫升Fisher09-761-4
Corning Easy Grip 一次性聚苯乙烯无菌瓶，500 毫升Fisher09-761-10
去离子水（DI 水）FisherLC267404
EMS 型碳纤维尖头镊子Fisher50-193-0842
ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒NanoView BiosciencesEV-TETRA-C可捕获 hCD81、hCD9、hCD63 及 IgG 对照
 + 标记 hEV-A（hEV-CD63-647、hEV-CD81-555、hEV-CD9-488），每试剂盒含 16 片芯片
ExoView R100 成像仪NanoView BiosciencesEV-R100干涉显微镜，配备高性能相机，支持三色荧光检测，并可对细胞外囊泡进行无标记的粒径分析与计数
荧光标记的人源 CD9 IgG 抗体NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
荧光标记的人源 CD63 IgG 抗体NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
荧光标记的人源 CD81 IgG 抗体NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
孵育溶液NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
可调节转速至 500 rpm 的轨道摇床或微孔板摇床n/a各种
板封膜（Plate Seal）NanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 ANanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 BNanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 CNanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 DNanoView BiosciencesEV-TETRA-C包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
方形/平头镊子Fisher50-239-62
直头尖锐 Boley 型镊子Fisher16-100-124
Thermo Scientific 粘性 PCR 板封膜FisherAB-0558

参考文献

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