一种用于细菌糖原颗粒分子结构表征的非降解性提取方法

摘要

细菌糖原的结构受提取方法影响显著，这些方法可能导致分子降解和/或产生有偏倚的取样。因此，开发能够最大限度减少这些问题的方法至关重要。本研究采用分子大小分布和链长分布作为关键评价指标，比较了四种提取方法。

摘要

目前存在多种糖原提取方法，这些方法要么会破坏糖原的空间结构，要么只能部分提取糖原，从而导致对糖原精细分子结构的表征出现偏差。为了理解糖原结构的动态变化及其在细菌中糖原颗粒的多种功能，至关重要的是以最小降解的方式分离糖原。本研究展示了一种温和的糖原分离方法，即采用冷水（CW）沉淀法 通过 蔗糖密度梯度超速离心法（SDGU-CW）。同时采用传统的三氯乙酸（TCA）法和氢氧化钾（KOH）法进行对比。实验使用了一种常用的实验室菌株， 大肠杆菌 BL21(DE3)被用作本研究的模式生物以进行示范。采用不同方法提取糖原颗粒后，通过尺寸排阻色谱法（SEC）分析颗粒大小分布，以及通过荧光标记毛细管电泳法（FACE）分析线性链长分布，对所得颗粒结构进行分析与比较。分析结果证实，所提取的糖原 通过 SDGU-CW 降解程度极低。

引言

糖原是一种高度分支的多糖，由葡萄糖基残基组成，还含有少量但具有重要意义的蛋白质，其中所有葡萄糖基残基相互连接 通过 直链中的α-1,4-糖苷键和分支点处的α-1,6-糖苷键¹糖原颗粒的结构通常分为三个层级：1）短链寡聚体，2）直径约20 nm的球形β颗粒，以及3）由β颗粒聚集形成的直径可达约300 nm的大型玫瑰花结状α颗粒。最近研究发现，真核生物中的糖原α颗粒存在两种结构状态，即不稳定状态和稳定状态。此处的“不稳定”是指在变性剂（如DMSO）存在下，较大的α颗粒会解离为较小的β颗粒。²进一步分析发现，糖尿病肝脏中的糖原α颗粒始终较为脆弱³ 且不稳定的α粒子比稳定的α粒子降解得更快⁴因此，糖原结构的脆弱性可能会加剧糖尿病中的高血糖状况^2,4，这使得脆弱的α颗粒在分子水平上成为糖尿病潜在的病理生物标志物。然而，糖原α颗粒在原核生物中的存在仅被零星报道⁵，且目前尚未见关于细菌中糖原α颗粒存在两种不同结构状态的报道。

为了理解细菌糖原颗粒的生理功能，必须确定糖原分子的精细结构，这需要以最高得率和最小降解程度分离糖原¹迄今为止，已开发出多种糖原提取技术，包括但不限于热水提取法、三氯乙酸（TCA）提取法和热碱（氢氧化钾，KOH）提取法。⁶此外，另一种常用于真核生物糖原分离的方法——蔗糖密度梯度超速离心法（SDGU），也已有报道用于细菌糖原的分离。 Selenomonas ruminantium 和 Fibrobacter succinogenes^7,8尽管这些方法的优缺点已在真核生物研究中被广泛讨论^9,10，很少有关于分离得到的糖原精细结构的比较研究 通过 从糖原颗粒结构的角度比较细菌中的不同提取方法。

在本研究中，通过使用该问题已得到解决 大肠杆菌 以BL21(DE3)为模式生物，比较了四种糖原提取方法，分别为三氯乙酸沉淀热水分步提取法（TCA-HW）、三氯乙酸沉淀冷水分步提取法（TCA-CW）、热30%氢氧化钾溶液提取法（KOH-HW）以及蔗糖密度梯度超速离心冷水分步提取法（SDGU-CW）。随后测定糖原颗粒的粒径分布 通过 凝胶过滤色谱（SEC），同时检测链长分布 通过 荧光辅助碳水化合物电泳（fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, FACE），以上两种方法均用于评估提取方法的质量。此外，通过比较不同提取方法所得细菌糖原α颗粒在常用变性剂二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）处理前后颗粒尺寸分布的变化，进一步比较了这些颗粒的稳定性和脆弱性。糖原提取及结构表征的详细步骤如下所述。综上所述，SDGU-CW方法在糖原结构完整性方面整体效果最佳，因此推荐在今后的相关研究中用于细菌糖原的提取。

方案

1. 细菌培养与收集

1. 复苏 E. coli 从-80 °C甘油菌种保藏管中取BL21(DE3)菌株，接种于无菌LB琼脂平板（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/L琼脂）上。将平板置于普通培养箱中，37 °C过夜培养。
2. 挑取单菌落，接种于10 mL无菌LB液体培养基（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl）中，充分混匀 通过 涡旋混匀，于37 °C、220 rpm振荡培养过夜。
   注意：除非另有说明，所有液体培养条件均为37 °C，摇床转速220 rpm。
3. 转移1 mL的过夜培养物 大肠杆菌 将菌种接种于100 mL无菌LB液体培养基中，培养5小时。取50 mL转移至1 L的1×M9最小培养基（3 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，6.78 g/L Na₂HPO₄，以及 1 g/L NH₄Cl）并含有0.8% D-(+)-葡萄糖的溶液中。充分混匀，培养20小时。
   注意：1x M9 最小培养基和葡萄糖分别灭菌，然后在无菌条件下冷却至室温时混合。
4. 培养 20 小时后，于 6,000 x g 4 °C下离心15分钟，弃去上清液。将细胞沉淀于-80 °C保存过夜，然后进行冻干。
5. 将冻干的细菌粉末密封后，于冰箱中（-20 °C）保存，以备后续使用。

2. 糖原提取

1. 三氯乙酸沉淀热提取法（TCA-HW）
   1. 精确称取500 mg冻干粉 E. coli BL21 (DE3) 菌体粉末重悬于 20 mL 冰冷的 0.05 M 三乙醇胺（TEA）缓冲液中。使用超声细胞破碎仪（25% 能量，4 °C）破碎细菌细胞，处理 3 分钟（工作周期为 30 秒，间隔 2 秒）。确保溶液中无明显沉淀颗粒。
      注意：细胞破碎在冰上进行。用 HCl 调节 TEA 缓冲液的 pH 至 7，室温保存。
   2. 将所有细菌匀浆转移至两支10.4 mL超速离心管中（每管10 mL）。用去离子水加满至管顶，于104,000 x g 在4 °C下以超速离心机离心90分钟。弃去上清液。
   3. 向每管中加入 2 mL 去离子水以重悬沉淀。将悬液转移至 50 mL 离心管中，并加入去离子水至终体积为 20 mL。加热煮沸 5 min，使所有蛋白质变性。
   4. 将悬液在18,000 x g下离心10分钟 g 并保留上清液（S1）。将沉淀物按照步骤2.1.3的相同方法处理，将新获得的上清液（S2）与S1合并。
   5. 向（S1+S2）上清液中加入50%三氯乙酸（TCA）（0.1体积），冰上放置10分钟，使DNA、RNA、蛋白质等大分子物质沉淀。将混合物在18,000 x g 10分钟，然后将上清液与1.5倍体积的无水乙醇混合。
      注意：TCA 的浓度为 50% v/v。储存时需避光。
   6. 在冰上沉淀糖原20分钟，然后在18,000 x g下离心 g 10 分钟后倒出上清液。
   7. 将沉淀溶解于5 mL ddH₂O中₂O，然后加入5 mL预冷的无水乙醇。4 °C下孵育过夜，18,000 x g 10 分钟后弃去上清液，保留沉淀。
   8. 重复该步骤 "洗涤与沉淀" 重复步骤 2.1.7 两次。
   9. 最后，将沉淀的糖原溶解于400 µL的ddH₂O中。₂在2 mL离心管中，于-80 °C预冷冻，然后冻干以获得干燥的糖原粉末。
2. 三氯乙酸沉淀冷水分步提取法（TCA-CW）
   注意：TCA-CW 法与 TCA-HW 法相同，区别在于弃去上清液后，沉淀物不进行煮沸处理（见步骤 2.1.3），而是将其重悬于 20 mL ddH₂O 中。₂含1 mg/mL蛋白酶抑制剂混合物的O
   1. 配制1 mg/mL蛋白酶抑制剂混合液：将50 mg蛋白酶抑制剂混合物溶解于1 mL去离子水中，然后按50:1的比例（去离子水:蛋白酶抑制剂混合液）稀释。
3. 利用蔗糖密度梯度超速离心进行冷水提取（SDGU-CW）
   1. 溶解并充分混匀1 g冻干粉 E. coli 在4 mL含1 mg/mL蛋白酶抑制剂混合物的糖原提取缓冲液（GEB）中研磨成粉末。
      注意：GEB 包含 50 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM NaF 和 5 mM 焦磷酸钠。需用 HCl 将 GEB 的 pH 值调节至 8。
   2. 使用超声波细胞破碎仪（25% 能量，4 °C）在冰上对细菌细胞进行破碎处理，总时长为 3 分钟（工作周期为 8 秒，间歇周期为 9 秒）。超声处理结束后，将细菌匀浆液转移至离心管中，加入 GEB 缓冲液定容至 10 mL，涡旋混匀。
      注意：不要匀浆过长时间，以免产生的热量降解糖原。
   3. 以 6,000 x g 4 °C下离心10分钟。将上清液转移至10.4 mL超速离心管中，用GEB加满至管顶，然后在360,000 x g 4 °C 下孵育 2 小时。
      注意：确保试管已完全充满，且无气泡存在。
   4. 离心后弃去上清液，用2 mL去离子水重悬沉淀。
   5. 在新的超速离心管中，缓慢加入4 mL 75%蔗糖溶液，并叠加4 mL 37.5%蔗糖溶液。然后将步骤2.3.4中获得的悬液加在蔗糖溶液上方，再用去离子水补足至管顶（见 图1).
      注意：蔗糖浓度分别为75% [v/v] 和37.5% [v/v]。制备蔗糖密度梯度时需谨慎操作，确保两种蔗糖溶液之间形成清晰可辨的分层。同时，确保超速离心管中无气泡存在。
   6. 360,000 x g 离心 g 4 °C下孵育2.5小时，弃去上清液。将沉淀物溶于200 µL去离子水中。加入800 µL无水乙醇以沉淀糖原。
   7. 在 -20 °C 下过夜沉淀糖原。4,000 x g 离心 g 4 °C下离心10分钟，弃去上清液。
   8. 将所得沉淀溶解于400 µL ddH₂O中₂在2 mL离心管中，于-80 °C预冷冻，冻干获得干燥糖原粉末。将干燥糖原粉末于4 °C保存，用于结构分析。
      注意：详细步骤见下文图示 图1.
4. 热30%氢氧化钾溶液提取法（KOH-HW）
   1. 煮沸冻干的 E. coli 将粉末（50 mg）溶于1 mL 30% [w/v] KOH中，反应1小时。
   2. 加入含15 mM LiCl的67% [v/v] 乙醇，在-20 °C沉淀至少1小时。将样品在16,000 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。
      注意：67% [v/v] 乙醇含 15 mM LiCl 的溶液包含 0.6358 g LiCl、67 mL 无水乙醇和 33 mL 去离子水。
   3. 将沉淀物重新溶解于1 mL ddH₂O中₂在95 °C下加热10分钟，期间间歇性振荡。
   4. 重复步骤2.4.2中的乙醇沉淀步骤三次。将最终沉淀物重新溶解于400 µL ddH₂O中。₂在2 mL离心管中，于-80 °C预冷冻，然后冻干以获得干燥的糖原粉末。

3. 糖原结构测定

1. 透射电子显微镜（TEM）
   1. 将糖原粉末重悬于50 mM Tris缓冲盐水（pH 7）中，终浓度为1 mg/mL。
   2. 将悬液进行10倍稀释，然后将稀释后的悬液滴加到经辉光放电处理的400目铜网上。
   3. 2分钟后，用滤纸吸去载网上的多余样品，并用2-3滴1%醋酸铀对载网进行染色。
   4. 使用在75 kV下运行的透射电子显微镜观察样品。
2. 尺寸排阻色谱法（SEC）
   1. 流动相的配制：在去离子水中配制0.02%（w/w）叠氮化钠和50 mM硝酸钠溶液，经0.45 µm滤膜过滤。使用超声水浴对溶液超声处理15分钟以上，以去除气泡。
   2. 样品制备：使用流动相溶解糖原粉末，使终浓度为 1 mg/mL。将溶液在 80 °C 下于恒温混匀仪中孵育过夜。将溶解后的样品在 6,000 x g 室温孵育10分钟，将上清液转移至标准SEC小瓶中。
   3. DMSO处理的糖原样品制备
      1. 将1 mg糖原粉末溶于300 µL DMSO中，在恒温混匀仪中80 °C孵育过夜。加入4倍体积乙醇沉淀糖原，于6,000 x g离心 g.
      2. 用乙醇洗涤沉淀物两次，将沉淀物溶于ddH₂O中₂O 并冻干。
      3. 分析冻干糖原粉末 通过 通过按上述方法制备样品进行尺寸排阻色谱（SEC）。
   4. 使用带有预柱的SEC系统，以及1000和10000柱，分析糖原颗粒的粒径分布。保持柱温为80 °C，流速为0.3 mL/min。
3. 荧光染料辅助碳水化合物电泳（FACE）
   1. 糖原去分支
      注意：使用 FACE 检测链长分布（CLD）时，所有待测样品均需进行去分支预处理。
      1. 加入0.5 mg糖原粉末、90 µL热蒸馏水（90 °C）、1.5 µL NaN₃ 溶液，3.5 µL 异淀粉酶（200 U/mL），以及 8 µL 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 3.5）加入试管中。
         注意：添加异淀粉酶可特异性切割待测样品的支链结构。异淀粉酶是一种去分支酶，能特异性破坏α-(1-6)糖苷键而不破坏α-(1-4)糖苷键，因此可特异性切断糖原的侧链，同时不破坏主链结构。
      2. 在37 °C下于恒温混匀仪中孵育混合物3小时。加入8 µL 0.1 M NaOH溶液调节pH至中性后，于80 °C在恒温混匀仪中继续孵育1小时。
      3. 加入4倍体积的无水乙醇至混合物中以沉淀糖原。随后，在6,000 x g 室温下孵育10分钟。用乙醇洗涤沉淀两次，将沉淀溶于ddH₂O中。₂O 并冻干。
   2. 荧光溶液的制备
      1. 将APTS（8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐）试剂瓶（每瓶含5 mg APTS）在4,000 x g 2分钟。加入50 µL 15%乙酸溶液以溶解粉末，充分混匀，于4,000 x g 室温下反应2分钟，得到0.2 M APTS乙酸溶液。
         注意：APTS 溶液需保存在 -20 °C 冰箱中。一旦开启，必须在两周内使用完毕，否则将失活。APTS 是一种常用的带负电荷的染料，可结合糖原链的还原末端。由于不同聚合度（DP）的糖原链均只携带一个负电荷，因此 FACE 可根据其不同的质荷比进行分离。通过此方法，荧光检测器可检测到不同 DP 值的信号。
   3. 将去分支的糖原转移至离心管中，加入1.5 µL APTS溶液和1.5 µL氰基硼氢化钠溶液。在避光条件下于60 °C孵育1.5小时。加入80 µL去离子水，于4,000 x g 室温孵育10分钟，保留上清液。
   4. 以0.5 psi（高于大气压3.4 kPa）的压力进样3秒，将样品引入毛细管电泳系统。
      注意：通过施加30 kV电压和约14 mA电流，在25 °C条件下分离荧光标记的线性葡聚糖。峰面积反映了不同分子量葡聚糖的相对含量（相邻峰中葡聚糖的聚合度（DP）相差1个DP）。样品温度保持在18 °C。

结果

糖原颗粒的大小分布
一系列研究表明，糖尿病肝脏中的糖原α颗粒较为脆弱，在氢键破坏剂DMSO中容易破裂解体^11,12,13,14本研究检测了通过四种不同方法提取的细菌糖原在颗粒大小和结构稳定性方面的变化。四种方法获得的所有糖原样品分别用水（蓝色曲线）和DMSO（红色曲线）处理。其重量分布， w（日志R_h），在文中给出 图2经水处理提取的糖原 通过 TCA-HW（图2A，蓝色曲线）和 TCA-CW（图2B，蓝色曲线）以较小的颗粒为主，峰值出现在 R_h 约 ...

讨论

糖原是一种重要的能量储备物质，已在多种细菌中被发现¹⁶。为了深入解析糖原颗粒的生理功能，必须更清楚地了解糖原分子的精细结构。迄今为止，已有多种方法被开发用于从细菌培养物中提取糖原。然而，不同提取方法所获得的糖原颗粒尺寸分布存在差异，表明糖原结构可能受到损伤。因此，有必要对提取步骤进行比较和标准化，以确保不同研究中获得的糖原结构具有可比性。本研究提供了一项详细的操作方案，描述了从大肠杆菌（E. coli）液体 培养物中提取糖原的四种常用方法，并通过糖原颗粒的结构表征对这些方法进行评估。

至于粒径分布，TCA-CW 和 TCA-HW 提取的糖原颗粒均表现出向较小粒径方向的重量分布，其峰值位于 R_h ≈ 20 nm（β 颗粒）。因此，这两种方法不适合用于提取用于结构表征的糖原颗粒。事实上，这可能部分解释了为何仅有 β 颗粒被认为存在于细菌中，因为TCA方法已广泛用于细菌糖原研究。另一方面，KOH-HW和SDGU-CW方法提取的糖原颗粒主要具有...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
Agilent 1260 infinity SEC 系统	Agilent	1260 infinity II	粒径分布
分析柱	PSS	10-1000	-
离心机	Eppendorf	5420	-
滤膜	Cambio	Km-0220	-
荧光辅助毛细管电泳系统	Beckman Coulter	-	链长分布
冷冻干燥机	Xinzhi	SCIENTZ-10N	细菌与糖原的冻干
冷冻柜	Thermo Fisher	Forma 900	样品储存
保护柱	PSS	SUPPERMA	-
培养箱	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
低速大容量离心机	Hexi	HR/T20MM	样品离心
Multiskan FC 微孔板读数仪	Thermo Fisher	1410101	-
Optima XPN 超速离心机	Beckman	XPN-100/90/80	用于糖原
振荡器	Xinbao	SHZ-82	-
PA-800 Plus 系统	Beckman Coulter	A66528	-
pH 计	Mettler Toledo	FE28 -TRIS	-
示差折光检测器	Wyatt	Optilab T-rEX	-
冰箱	Haier	BCD-406WDPD	-
恒温混匀仪	Shanghai Jingxin	JXH-100	样品孵育
透射电子显微镜	Hitachi Corporation	H-7000	糖原颗粒形态
超速离心管	Beckman	355651	-
超声细胞破碎仪	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	细菌破碎
超声波水浴振荡器	Jietuo	JT-1027HTD	-
涡旋混合器	Tiangen	OSE-VX-01	-
纯水系统	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	去离子水
材料
8-氨基-1,3,6-三磺酸芘三钠盐	Sigma-Aldrich	196504-57-1	-
无水乙醇	Guoyao	10009228	-
琼脂粉	Solarbio	A1890	-
α-淀粉酶	Megazyme	E-BLAAM-40ML	-
淀粉葡萄糖苷酶	Megazyme	E-AMGDF-40ML	-
cOmplete Mini	Roche	4693159001	-
D-(+)葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-1kg	-
D-葡萄糖检测试剂盒（GOPOD 法）	Megazyme	K-GLUC	糖原定量
二甲基亚砜	Vicmed	Vic147	变性剂
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02	-
乙二胺四乙酸	Vicmed	Vic1488	-
冰醋酸	Guoyao	10000218	-
甘油	Guoyao	10010618	细菌保存
盐酸	Guoyao	10011008	-
三羟甲基氨基甲烷	Sigma-Aldrich	V900483-500g	-
异淀粉酶	MegaZyme	9067-73-6	糖原去支链
氯化锂	Sigma-Aldrich	62476-100g	-
M9 最小盐培养基，5×	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	细菌培养
氢氧化钾	Guoyao	10017008	-
支链淀粉标准品	PSS	-	-
三水合乙酸钠	Guoyao	10018718	-
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	26628-22-8	-
氯化钠	Guoyao	10019318	细菌培养
氰基硼氢化钠	Huaweiruike	hws001297	-
焦磷酸钠	Sigma-Aldrich	71515-250g	-
氟化钠	Macklin	S817988-250g	-
氢氧化钠	Guoyao	10019762	-
硝酸钠	Guoyao	10019928	-
焦磷酸四钠	Sigma-Aldrich	V900195-500g	-
蔗糖	Guoyao	10021463	-
三氯乙酸	Guoyao	40091961	-
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042	细菌培养
酵母提取物	Oxoid	LP0021	细菌培养