使用聚焦离子束扫描电子显微镜数据对神经元亚细胞细微结构进行三维重建与分析

摘要

一种灵活的方法学流程，利用用户友好的开源软件包，在聚焦离子束扫描电子显微镜图像数据中识别、可视化并定量分析纤细的亚细胞神经元突起。

摘要

扫描电子显微镜技术的最新进展使得对超薄亚细胞结构进行快速三维（3D）分析成为可能。本文介绍了一种方法学流程，用于识别、可视化和分析细小的神经元突起，例如伸入其他神经元突触前末梢的结构（称为“突触小芽”或“spinules”）。利用免费开源的软件工具，本方案展示了如何在聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）图像数据中，基于形态学标准构建决策树，以识别常见的神经元亚细胞结构，并特别关注识别伸入突触前末梢的多种类型的突触小芽。具体而言，本方案详细描述了如何在神经元突触内追踪突触小芽，从而实现对这些细小亚细胞突起、其母体神经突以及突触后伙伴的三维重建。此外，本方案还提供了一份可用于分析FIB-SEM数据的免费开源软件列表，并给出了若干提升三维重建质量以用于可视化和发表的实用建议（如平滑处理、光照设置等）。这一可灵活调整的方案为在FIB-SEM图像数据中快速开展纳米尺度下亚细胞结构的分析提供了入门途径。

引言

对纳米级亚细胞组分的结构-功能关系的研究通常得益于三维可视化与分析¹。然而，连续切片透射电子显微镜研究因需要使用金刚石刀切割并排列数百至数千个厚度≥40 nm的连续超薄切片，而在时间和空间上受到限制。这些限制阻碍了对较细小（直径<40 nm）亚细胞结构的取样与有效分析，同时掌握超薄连续切片技术的难度也限制了三维结构分析的应用^2,3。然而，聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）技术的最新进展已彻底提升了可获取图像体积的速度与分辨率，使得大规模定量分析诸如光面内质网^4,5、神经元突触^3,6以及突触小泡^7,8等细小亚细胞结构成为可能。此外，FIB-SEM图像体积数据的广泛应用也加速了开放获取FIB-SEM图像数据库⁹和三维分析软件（例如 Espina¹⁰、IMOD¹¹、Neuromorph¹²、Reconstruct¹³、TrakEM¹⁴）的发展，进一步拓展了该技术的应用范围，使人们对精细亚细胞结构的结构与功能开展深入研究成为现实。

一种这样的纳米级亚细胞结构是神经元突触中的“棘小体”（spinule）。棘小体是细长的（约0.06–0.15 µm宽，0.1–1 µm长）、指状突起，从一个神经元发出并被另一个神经元的神经突（例如，突触前终扣）所包裹^15,16。在电子显微镜文献中，已有近60年报道了嵌入神经元过程中的棘小体¹⁷，而类似棘小体的突起是兴奋性突触中一种保守^18,19,20且普遍存在^21,22的特征。然而，尽管突触棘小体广泛存在，其功能仍不明确，且缺乏必要的数据来解释其丰度和结构保守性。对棘小体缺乏实验表征，主要归因于难以定量分析其出现频率和尺寸大小。由于其尺寸微小，最适宜采用此前难以实现的z轴（深度）分辨率（即≤15 nm）进行分析。

本文介绍了一种聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）分析流程，用于识别、可视化和分析亚细胞水平的细微结构（横截面宽度≤40 nm），可为FIB-SEM领域的新手和专家提供入门指导。该实验方案旨在帮助研究者在三维FIB-SEM图像数据中识别神经元的亚细胞结构，重点阐述如何利用特定标准来辨认并分类棘状突起（spinules）和突触的不同亚型。此外，本方案还演示了如何将图像数据导入免费的三维分析软件平台（Reconstruct），使用该软件追踪兴奋性神经元突触内的棘状突起，并对这些亚细胞突起、其母级神经突以及包裹它们的突触前终扣进行三维重建。最后，本方案介绍了如何利用免费开源的三维渲染软件（Blender）对三维重建模型的表面进行平滑处理，以优化可视化效果并满足潜在的发表需求，同时详细说明了该技术的优势与可能存在的局限性。

方案

1. 图像体积数据与亚细胞结构大小：注意事项与注册

1. 获取包含目标亚细胞结构的感兴趣区域的高质量聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）图像数据集。
   注意：本方案使用来自晚期青少年雪貂初级视觉皮层的 FIB-SEM 图像体积的片段（24.2 x 16.2 x 2.4 µ微米，4 纳米各向同性体素），以及来自成年大鼠 CA1 海马区的公开可获取的 FIB-SEM 三维图像数据（10.2 × 7.7 × 5.3 µm；5 nm 各向同性体素）由 Knott 实验室提供（https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/）。使用能够保持超微结构细节并在 FIB-SEM 成像条件下产生高对比度的方案制备 FIB-SEM 用组织块至关重要。^23,24重要的是，组织成像时应确保最终的 FIB-SEM 图像体素分辨率达到 <0.5 × 感兴趣亚细胞结构最小直径的尺寸。例如，由于突棘突起进入突触前终末的位点直径可小至30 nm，因此体素尺寸应 <15 nm 的采样尺度将足以满足奈奎斯特判据对这些结构的成像要求。此外，以各向同性（在所有维度上相等）的分辨率（例如 5 × 5 × 5 nm 体素）对组织进行成像，有助于可视化和重建在 x/y/z 各平面尺寸相近的细微结构。
2. 下载并安装 ImageJ 的 Fiji 发行版²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads)
3. 对图像体积进行对齐。
   注意：尽管现代 FIB-SEM 系统可生成大致对齐的图像体积，但图像间的配准仍可能存在亚像素级漂移。
   1. 在 Fiji 中，导航至 插件 | 图像配准 并选择 注册虚拟堆栈切片请参考用户手册获取帮助（https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices）。首先进行刚性配准，如有需要，随后使用仿射配准技术。
4. 缩放图像体积。
   1. 在 Fiji 中通过点击打开对齐的图像数据集 文件 | 导入 | 图像序列 并导航至包含对齐图像的文件夹。
   2. 在对话窗口中，单击 按数字顺序排列名称 如果图像按数字顺序命名。单击 使用虚拟堆栈 以提升 Fiji 的运行速度。
   3. 图像打开后，点击 图像 | 属性 并在像素高度、宽度和深度框中输入图像体积像素的物理尺寸（单位：微米）。输入 微米 或 µm 在最右侧的每个方框中。通过点击将对齐后的图像体积保存为 .tiff 文件 文件 | 另存为 | Tiff.
      ​注意：如果图像已被缩放，图像顶部现在应显示图像的尺寸（单位为微米，例如 9.82 x 8.65） µm)

2. 神经突和突触棘突的鉴定

1. 在浏览图像栈时（使用箭头键或鼠标滚轮），请参考神经突识别决策树（图1）以及切片神经突的示例（图2) 以定位和识别目标对象。
   1. 将突触棘状突起识别为来自神经突、并完全包埋于突触前或突触后神经突内的膜结合突起。
      注意：阳性突触棘突的鉴定需要有视觉证据显示棘突投射物体的膜凹陷进入突触前或突触后结构的内陷膜中，并且在至少一幅图像中，膜包裹的棘突完全被突触前或突触后结构的膜所包绕。
2. 在 Fiji 中创建感兴趣区域（ROIs）
   1. 单击 Fiji 工具栏中的适当工具（例如， 椭圆形 工具）然后在图像上单击并拖动以创建感兴趣区域（ROI）。将该 ROI 记录下来 ROI 管理器 通过输入字母 "T."
      注意：该 ROI 管理器 应以图像坐标作为其默认名称显示。
   2. 根据需要点击以重命名感兴趣区域（ROI） 重命名按钮 在 ROI 管理器 并在出现的文本框中输入所需名称。根据定量标准重命名感兴趣区域（例如，12^th 被分析的具有两个与突触后棘形成突触的突触前末梢可能被命名为 B12_s,s).
      注意：将每个 ROI 与一张图像关联 "切片" （而不是在整个图像堆栈中显示），并使ROI名称在单幅图像上可见，点击这些选项 ROI 管理器 | 更多 | 选项 窗口，然后单击 显示全部 和 标签 底部的复选框 ROI 管理器请注意，此步骤在保存图像体积内的感兴趣区域（ROI）时至关重要，因为将ROI与整个图像体积而非单个图像关联可能导致体积内对象的重复计数。
   3. 保存当前所有 ROI ROI 管理器 作为文件，首先，单击 取消选择按钮 在 ROI 管理器，点击 更多按钮，并向下滚动至 保存.
      ​注意：此保存的 .zip 文件现在可在 Fiji 中打开，以重新加载所有这些 ROI 到 ROI 管理器.

3. 确定感兴趣区域并将图像体积数据转移至3D分析软件

1. 确定是否需要将整个图像体积导入三维重建与分析软件，或是否应创建一个较小的子堆栈（见3.3.2），以分析原始图像堆栈中较少数量的图像和/或特定感兴趣区域。
2. 在包含感兴趣目标的相对较小区域内开展一项小规模“预试验”研究，以估算效应量以及为达到统计比较所需的统计功效而必须分析的感兴趣目标数量。若这些亚细胞结构在图像体积内分布不均，应保守估计采样所需图像体积的大小。
3. 若需使用图像体积的一部分进行三维分析，首先通过点击 图像 | 复制 来复制该图像体积。
   1. 若需使用裁剪后的图像区域进行分析，请从Fiji工具栏中选择 矩形工具，并绘制所需的感兴趣区域；若无需裁剪，请继续下一步。
   2. 进入 图像 | 堆栈 | 工具 | 创建子堆栈，在文本框中输入要包含在子堆栈中的图像范围（例如，输入 1 - 500 以包含第1至第500张图像）。
   3. 参考上述采样注意事项（1.1后的注释），根据感兴趣目标的大小确定所需的z轴分辨率。例如，若图像体积的体素深度为5 nm，则可在z轴方向以10 nm间隔进行采样，使Fiji在子堆栈中仅保留每隔一张的图像。为此，在范围后输入第n张图像的间隔数（例如，若要在1至500的图像范围内仅包含每隔一张的图像，请输入 1 - 500 - 2）。
      ​注：每种三维分析软件（见 表1）均有其特定的文件导入要求。本方案重点介绍如何将保存为.tiff格式的图像体积导入图像体积处理软件 Reconstruct 中。

4. 在 Reconstruct 中对亚细胞细小结构进行三维重建与分析

注意：使用 Reconstruct 时，配备滚轮的鼠标将极为有利。此外，如果大部分或全部描迹需手动完成，则在带有触摸屏的计算机上使用手写笔绘制轮廓可显著提高描迹效率。

1. 下载并安装 重建 （https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0）适用于在本地或虚拟环境中运行 Microsoft Windows 的计算机。
2. 通过创建一个用于存放重建文件的新文件夹来开始一项新的重建工作，点击 系列 | 新，并将该重建结果（.ser 文件）以所需的文件名保存至刚刚创建的文件夹中。
3. 将保存的 .tiff 图像数据导入 重建.
   1. 导航至 系列 | 导入 | 图像，点击 选择 在 导入图像 窗口中，找到图像体积文件。在 导入图像 窗口中，查找作为图像体积中每幅图像单独一行显示的图像体积文件。
   2. 重要：在 像素大小 与x/y像素大小对应的文本框（以 µ图像体积的 m）。完成后，单击 导入 按钮在 导入图像 窗口
      注意：图像导入后，中间应有一张图像 重建 窗口，以及 导入图像列表 应为空。
   3. 如果在中间有图像 重建 窗口和 导入图像列表 为空，点击 退出 在 导入图像 窗口
   4. 通过点击设置切片厚度（即体素高度或 z 维度） 章节 | 列出章节，高亮显示所有列出的章节，然后点击 修改 | 厚度 在 章节列表 菜单中输入切片厚度（以 µm) 输入到文本框中（例如，对于 5 nm 厚的切片，输入 0.005）。
      注意：如果使用的是从较大的原始图像体积中提取的子堆栈，且该子堆栈仅包含每隔 n 个切片的图像（参见步骤 3.3.3），则必须在计算总切片厚度时考虑这些“缺失”的切片。例如，若原始图像体积的切片厚度（即体素高度）为 0.005 µm，且子堆栈仅包含每第三个切片（例如 1-500-3），则该子堆栈的切片厚度为 0.015 µ米（即 0.005） µm × 3 部分
4. 对目标对象进行描迹。
   1. 前往 系列 | 选项 | 名称/颜色选项卡 为新对象命名。选择对象轨迹的轮廓和内部填充颜色，然后单击 好的.
      注意： 重建 将尝试把所有同名轨迹连接为一个对象。请参考 重建 轨迹命名规范手册（例如，名称中不得包含空格）。轨迹颜色仅用于可视化区分；该对象的三维重建颜色可在后续轻松修改。
   2. 在工具栏中，选择 自由绘制 形似铅笔的工具。按住鼠标左键并拖动鼠标以描迹物体的膜结构；松开鼠标左键以自动完成描迹。单击 页面向上 / 页面向下 或使用鼠标滚轮切换至图像体积中的下一个光学切片，并逐步绘制轨迹，直至结构完整。
5. 追踪突触棘突
   注意：嵌入在突触前末梢内的棘小体表现为膜包被的透明结构，其内部偶尔可见类似肌动蛋白的电子致密物质和/或类似膜的折叠结构。
   1. 在图像序列中逐步推进，定位棘突侵入突触前末梢的位点，注意将棘突与内质网、空泡、内体、自噬体及其他细胞器区分开来。
      注意：与膜包被的细胞器不同，突触棘突（spinules）必须始终从神经突/胶质细胞（即外翻的膜）发出，并被突触前或突触后结构（即内陷的膜）所接收。棘突内陷的这一视觉证据应在不少于2张图像中出现，且在不少于1张图像中，应可见完整的膜包被棘突完全包裹于突触前或突触后结构内。较小的棘突可能具有网格蛋白（clathrin）包被。为区分棘突内陷事件与网格蛋白介导的内吞作用（即网格蛋白包被的囊泡向突触前或突触后神经突内吞），必须在同一图像中观察到棘突母体结构的外翻膜与突触前或突触后结构的内陷膜同时存在，方可确认为网格蛋白包被的棘突。
   2. 在图像体积中逐步推进，定位自其母源神经突/胶质细胞发出的棘突投射/起源位点；参考 图1 和 图2 以帮助识别这些父级结构。
   3. 从膜突起进入接收结构（例如，突触前末梢）的位点开始追踪棘小体，并持续绘制棘小体，直至其在包裹的突触前或突触后神经突内不再呈现为膜包被结构为止。
   4. 在用鼠标指针描 trace 突棘膜时，持续按住鼠标左键（或在使用触摸屏计算机时，用触控笔沿突棘膜持续绘制）。
   5. 当到达轨迹起点时，松开鼠标左键。
      注意：过早松开鼠标左键将自动完成追踪，通常会导致不理想的结果。如果发生这种情况，只需按下 删除 当此轨迹在 轨迹列表.
   6. 对 spinule 出现的每一部分重复执行步骤 4.5.2–4.5.5。
      注意：在适当情况下，应将突棘视为轴突终末内的囊封膜结合结构进行追踪。因为 重建 不允许对被包裹的亚细胞结构（例如，突棘小体、亚细胞器）进行自动化减除以从其包裹结构的体积中分离，但这一操作可通过人工方式完成 事后 （例如，通过从突触前末梢的总体积中减去突触小芽的体积）。
6. 在三维中重建物体 重建
   1. 导航至 系列 | 选项 | 3D 选项卡，并确保 轨迹 单击单选按钮。
   2. 单击以打开对象列表 对象 | 列出对象.
   3. 当追踪对象的名称在窗口中加载后，双击对象的名称 物体列表 以在三维中观察它们。等待 3D 场景 窗口出现。
   4. 确保轨迹的起始点、终止点及计数均正确 对象列表 对于每个对象，使得计数 = 结束 - 开始。如果计数 ≠ 对象的终点与起点之间，可能有一个或多个来自该对象的轨迹被错误遗漏。
   5. 通过按住鼠标左键并移动鼠标，和/或按住鼠标右键前后移动以放大和缩小，来旋转对象的三维轨迹。确保对象的轨迹适当对齐，并且各连续轨迹之间呈现出平滑的过渡。
   6. 如有必要，重新描记单个轨迹，以消除导致尖锐边缘和/或轨迹间过渡不连续的错误。
   7. 放置一个四面体网格 皮肤 通过导航至对象 系列 | 对象 | 3D 选项卡 并点击 博瓦松纳表面 单选按钮
   8. 在 3D 场景 窗口，单击 场景 | 清除，然后在所需的对象名称上双击 对象列表.
   9. 旋转物体以确保轨迹之间的平滑过渡，必要时重新绘制轨迹。
   10. 要更改对象的颜色和透明度，请点击对象列表中该对象的名称 对象列表，然后点击 场景 | 颜色/透明度... 在 对象列表 菜单。在对象名称上双击 对象列表 以观察此变化 3D 场景 窗口。
       注意：可使用Blender（见5.4-5.6）更精确、更灵活地调整对象的颜色、透明度和平滑度。
7. 三维物体的定量分析
   1. 导航至 系列 | 选项 | 列表标签 并单击所有需要测量的项目 对象列表 和 轨迹列表 此窗口的各个部分。
   2. 通过打开导出对象测量值 对象列表 (对象 | 列出对象...）然后单击 列表 | 保存.
   3. 将对象测量值按显示内容保存 对象列表 作为逗号分隔的文件（.csv）。
   4. 将 .csv 文件导入所选的数据分析软件中。若要导入电子表格（例如 Microsoft Excel），可直接双击该文件，或打开一个新的空白工作簿，然后单击 文件 | 导入 | CSV 文件 选项，并按照说明操作。
   5. 要测量三维空间中物体之间的距离（例如，测量突触棘突在突触前终末内的投影距离），请使用 Z-追踪 功能在 重建.
   6. 首先，通过导航到为轨迹命名 系列 | 选项 | 名称/颜色标签页 并输入 Z-轨迹的名称。
   7. 接下来，单击 Z-追踪 工具栏中的工具。
   8. 要绘制突触棘突投射距离的Z轴轨迹，先用鼠标左键单击突触棘突的起始位置，然后按下 页面向上 或 下一页 通过点击每个切片中突触棘突膜上连续的点，同时使用按钮在图像序列中前进。
   9. 通过单击鼠标右键完成此 Z 轴追踪。
   10. 通过点击导出 Z 轴追踪测量结果 追踪 | 列出追踪... 调出 轨迹列表 然后点击 列表 | 保存 将轨迹列表的测量结果保存为 .csv 文件。
8. 添加比例尺立方体
   1. 导航至堆栈中的第一张或最后一张图像
   2. 前往 系列 | 选项 | 名称/颜色标签页 并为比例立方体输入一个名称。
   3. 在工具栏中，选择 绘制矩形 工具，在对象旁边绘制一个小方块（大小无关紧要），但不要遮挡对象。转到 系列 | 选项 | 3D 选项卡，点击 方框 单选按钮选项在 生成面积，并指定比例尺立方体的大小（以 µm）通过输入其尺寸 A：, B：, C： boxes in the 大小 面积（例如，输入 0.5 作为 A、B 和 C 的值，以生成 0.5 µm/side scale cube
      注意：在尝试三维重建比例立方体之前，务必已使用3D场景中的工具将所需三维对象完成重建。 轨迹 或 博瓦松纳表面 选项。请记得更改 生成 返回选项 博瓦松纳表面 以及A、B和C的大小恢复至 -1 在重建比例立方体后（即步骤 4.8.5 之后）。
   4. 打开 物品列表 并双击标尺立方体的名称；等待标尺立方体出现在 3D 场景 窗口
   5. 要移动相对于其他对象的标尺立方体，请前往 系列 | 选项 | 3D 选项卡 并输入 数量 µm 希望将比例立方体移入 X, Y和/或 Z 框。点击 好的 关闭窗口，然后双击 名称 比例尺立方体中的 对象列表.
      ​注：也可使用 Blender 完成此操作（见下文）。

5. 在 Blender 中导入、重新着色、平滑处理及为 3D 重建模型添加透明度

注意：如需详细了解如何使用 Blender，请查阅 Blender 手册，或搜索大量关于如何使用各项 Blender 功能的"操作指南"视频（只需在网页搜索中输入 Blender 和所需功能即可）。以下简要介绍如何对 3D 重建模型进行重新着色、平滑处理以及添加透明效果。

1. 下载并安装最新版本的 Blender，免费开源的 3D 软件套件（www.blender.org）。
2. 在 重建，通过调出所需的一个或多个对象来保存 3D 重建结果 3D 场景 窗口，然后单击 场景 | 导出为 | VRML 2.0.
3. 在 Blender，导航至 文件 | 导入 | X3D 可扩展三维（.x3d/.wrl） 单击从 重建 然后点击 导入 X3D/VRML2 按钮。
4. 重新着色重建图像。
   1. 在 场景采集 窗口右上角，单击以取消选中/取消勾选 眼 默认图标 立方体 选择对象，点击各个对象的名称以在场景中高亮显示。根据需要重命名这些对象。
   2. 单击要重新着色的第一个对象的名称 场景采集 窗口
   3. 单击圆形 背景. 材料 右侧图标栏底部的图标，然后单击 添加材料. 下方应出现一个选项列表。接着，点击旁边的栏 基础颜色 选项并选择对象所需的亮度和色调。
   4. 要改变物体的金属外观、光泽度和反射特性，请调整 金属质感、镜面反射、粗糙度，以及 Sheen 实现预期效果的选项。
      注意：为了在场景中显示某些选项（例如透明度、光泽度），可能需要处于 视口着色：外观开发 或 视口着色：渲染 视口设置。要更改为任一视口设置，可将光标悬停于 球体 右上角的图标，然后单击所需的视口设置。
   5. 要更改照明角度，请点击 光照 物体在 场景采集 窗口，单击 显示控件 右上角的图标，然后拖动光源围绕场景以达到理想的光照效果 光照效果。调整光照强度以 对象数据 场景集合窗口下方出现的窗口 光照 选择目标对象。
   6. 要分别沿选定轴旋转对象，请点击对象列表中对象的名称 场景采集 窗口，点击 R 键，然后单击旋转轴的字母（x，y，或 z 键），并移动鼠标以实现所需的旋转。 抓取 并移动对象，在其中选择它们 场景采集 窗口，点击 G 按住键，然后使用鼠标在场景中移动物体。
5. 对重建结果进行重网格化（即平滑）处理。
   1. 单击感兴趣对象的名称 场景采集 窗口，然后使用球形控制器和鼠标滚轮将物体居中并放大。
   2. 点击 上下文.修饰符 扳手 右侧图标栏中的图标，点击 添加修饰符，然后 重网格化 （在以下 生成 标题）。使用下拉菜单进行选择 平滑，点击 平滑着色 按钮，并更改 八叉树深度 和 比例尺 以达到理想的平滑度。
      注意：最好处于 视口着色：线框 窗口球体 右上角的图标选项）以实时查看重网格化效果。重网格化将在对象上生成不同尺寸的四面体网格。在对对象进行平滑处理以消除切片或追踪伪影时，需注意保留其原始形状和轮廓。从较低的 八叉树深度 = 7，比例 = 0.95，如有必要可逐步缓慢减少这些数值。需特别关注体积较小且纤细的结构，例如突棘小体和突触后致密区，由于这些结构体积微小，可进行平滑处理的范围有限，过度处理会改变其原始形态。
6. 为对象添加透明度。
   注意：当需要展示位于某一结构内部的其他亚细胞组分（如突触小棘、突触前囊泡、线粒体、内体）与该结构之间的三维空间关系时，使外部结构透明化尤为重要。
   1. 单击所需对象名称 场景采集 窗口。滚动至底部 背景。材料 窗口（右侧列表中的右下角图标），打开 设置 切片，并使用下拉菜单更改 混合模式 至 α混合接下来，打开 表面 部分，向上滚动至 阿尔法，将数值更改为小于1的值（1 = 完全不透明，0 = 完全透明）。
7. 导出三维重建的快照。
   1. 在获得3D重建图像的最佳着色、平滑和光照效果后，通过点击菜单标题在场景中保存图像 窗口，以及选择 保存截图.
   2. 在 保存截图 在左下角的选项中，选择所需的文件类型、颜色格式和压缩方式。
   3. 输入 名称 在上方的文件名文本框中输入新截图的名称，然后将截图保存到指定位置。

结果

量化雪貂初级视皮层兴奋性突触前终扣内突触小芽所占的百分比
尽管数十年来已观察到神经突起向兴奋性突触前终扣内延伸出类似小芽的突起^19,26，但其在突触功能中的潜在重要性仍不明确。本实验旨在测定雪貂初级视皮层（V1）在出生后发育过程中，不同阶段含有突触小芽的兴奋性突触前终扣所占比例，以评估突触小芽在发育关键节点中对突触功能的潜在意义。为此，使用FEI Helios 660 DualBeam FIB-SEM在52°倾角、4.2 mm工作距离、3 kV加速电压和400 pA背散射模式下，获取了出生后第（p）21天（15.1 × 14.1 × 2.8 µm）、p46（9.7 × 8.4 × 2.7 µm）、p60（24.2 × 16.2 × 2.4 µm）以及>p90（24.2 × 16.2 × 2.4 µm）雪貂V1的4 nm/体素各向同性FIB-SEM图像序列。尽管图像序列在采集时已通过FEI软件进行粗略对齐，但所有图像序列均进一步使用Fiji进行亚像素级对齐（参见1.4.3节）...

讨论

该FIB-SEM图像体积分析流程可对细小的亚细胞结构进行可靠的三维重建和定量测量。尽管当前基于深度神经网络和分割算法的半自动化技术能够提高在大图像体积中重建具有相对较高膜对比度的细胞结构的速度和效率³³，但由于膜对比度较低和/或形态迂曲，许多亚细胞结构（如突触小芽、滑面内质网、内体）仍难以通过自动化方法可靠地识别；尽管较新的方法已开始能够识别对比度较高的线粒体和粗面内质网^34,35。此外，未标记的亚细胞结构之间存在的细微差异（如网格蛋白介导的内吞作用与具有网格蛋白包被尖端的突触小芽，或内体与内质网）将要求对任何自动化重建结果进行反复的人工校验³⁶。因此，本方案强调在开始对FIB-SEM图像中的亚细胞结构进行分析之前，必须建立明确的亚细胞结构阳性鉴定标准。

为实现这些目标，必须熟悉特定亚细胞结构在不同随机切面角度（例如，图2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fiji（ImageJ）			https://imagej.net/software/fiji/downloads
重建			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
搅拌器	Blender 基金会		https:/www.blender.org