小鼠腹腔细菌感染模型中脾脏微囊泡的分离

摘要

从质膜脱落的微囊泡可作为细胞效应因子。脾脏微囊泡（SMVs）是病理生理状态的替代标志物。在大鼠和小鼠中，SMV的含量和特性可表征衰老或炎症状态，并可因细胞保护性治疗而发生改变，使其成为临床前研究中一种有价值且易于获取的监测工具。

摘要

微囊泡（MVs）是活化细胞质膜释放的亚微米级片段，具有促炎性和促凝血性的细胞效应功能。在大鼠中，脾脏微囊泡（SMVs）是病理生理状态的替代标志物。此前 体外 研究表明 牙龈卟啉单胞菌 (P. gingivalis），一种主要的牙周致病菌，能够 内皮细胞脱落和凋亡，而脂多糖（LPS）则促进脾细胞来源微囊泡（SMVs）的脱落。 在体 研究表明，药物控制SMV释放是可行的。本方案建立了从脾脏中分离SMVs的标准化操作流程。 P. gingivalis 急性小鼠感染模型 P. gingivalis 通过腹腔注射（共注射3次，每次5 x 10）在幼年C57BL/6小鼠中诱导感染⁷ 细菌/周）。两周后，采集脾脏，称重并计数脾细胞。通过蛋白质、RNA和凝血酶原酶活性检测分离并定量SMV。细胞活力通过碘化丙啶或台盼蓝排斥染料法评估。脾细胞提取后，经24小时脾细胞培养，采用流式细胞术获得中性粒细胞计数。在 P. gingivalis注射小鼠的脾脏重量增加了2.5倍，脾细胞数量上升了2.3倍，而中性粒细胞数量则升高了40倍。来自脾脏的脾细胞的细胞活力 牙龈卟啉单胞菌-注射小鼠的MV释放率在75%–96%之间，在无任何显著差异的情况下，24小时培养后较未暴露对照组下降50%。然而，来自注射小鼠的脾细胞通过凝血酶原酶活性检测或蛋白定量测定显示出释放更多的微囊泡（MVs）。数据表明，具有促凝活性的脾源性微囊泡（SMVs）是评估腹腔注射后早期脾脏反应的可靠工具 P. gingivalis 感染

引言

微囊泡（MVs），也称为微颗粒或外泌体，是细胞在多种刺激下释放到体液和细胞外空间的质膜碎片，直径为0.1-1.0 µm。MVs最初被发现是暴露促凝血磷脂（主要是磷脂酰丝氨酸，PSer）的血小板尘状物，可作为凝血复合物组装的额外表面^1,2。循环MVs作为促凝血效应分子的关键作用已在Scott综合征患者中得到证实²，该病是一种罕见的遗传性疾病，表现为PSer暴露功能障碍并伴随出血倾向（补充图1）。MVs已被广泛研究作为与糖尿病、慢性肾病、子痫前期和高血压等心血管疾病相关的慢性疾病中血栓风险的循环生物标志物^3,4。目前，MVs已被认为是在体液或器官组织（如心肌）中具有真实细胞效应功能的分子¹。由于MVs携带活性蛋白、脂质和miRNA，它们可远距离调控血管反应，如止血、炎症、血管生成以及血管生长或组织重塑⁵。

尽管临床研究探讨了微囊泡（MVs）在风险因素方面的预后价值，但从患者体液或组织中分离出的微囊泡能够实现 离体 效应特性的评估⁶解析微囊泡（MV）生物发生及其相互作用能力的机制通常在细胞培养模型中进行，以鉴定由MV暴露或包封的活性分子及其下游信号通路。MV与靶细胞的相互作用取决于膜蛋白与蛋白之间的结合（当存在相应的配体时）和/或脂质融合。⁷.

在生理条件下，血浆中循环的微囊泡（MVs）主要来源于血管细胞，可通过谱系分化簇标志物（CD）^8,9加以识别。然而，在病理状态下，特别是在癌症¹⁰和移植物排斥反应^11,12中，MVs 由受损组织释放，具有促凝血和促炎性等有害特性。这些微囊泡可在全身循环中被检测到，因此可作为监测保护性或再生治疗效果的有用探针，并可能成为药理学干预的靶点¹³。由于 MVs 以动态储存池的形式循环，反映了健康与疾病状态下血管和组织细胞的稳态，因此还需在小动物经静脉注射或鼻腔灌注后，通过in vivo实验进一步研究其远端作用机制^14,15。事实上，MVs 已被视为介导炎症反应与血栓形成之间复杂关联通路中的关键参与者¹⁶。

牙周炎是一种由感染引起的炎症性疾病，影响牙齿支持组织^17,18，并与血栓风险相关。其特征为牙龈出血、牙槽骨破坏、牙齿松动，最终可能导致牙齿脱落。牙周炎在全球范围内患病率很高，影响超过50%的人群，其中11%表现为重度形式¹⁹。牙周炎由龈下生物膜中细菌生态失衡引发，这种失衡持续引发过度的炎症反应，进而导致组织破坏²⁰。在过去十年中，牙周炎已被证实与多种全身性疾病相关，如心血管疾病、糖尿病和类风湿性关节炎。可能的机制包括牙周致病菌的远端作用和/或由促炎性细胞因子（如白细胞介素（IL-1、IL-6） 和TNF-α）介导的全身性炎症增强^21,22。

在与牙周炎发生和发展相关的病原体中，牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）²³存在于大多数严重病变中，该菌携带多种毒力因子，包括脂多糖（LPS）²⁴，可诱导Toll样受体（TLR）介导的炎症反应²⁵，并在初始感染部位募集中性粒细胞和多形核白细胞（PMNs）²⁶。来自P. gingivalis的LPS可激活TLR-4或TLR-2，促进免疫识别并帮助细菌逃避免疫清除²⁷。在血管水平，LPS对TLR2的激活与免疫性血栓形成相关。P. gingivalis具有激活TLR-2信号通路的独特能力，而TLR-4依赖的识别功能则显著受损，这一特性有利于其建立持续性的低度感染^28,29。

用于研究微囊泡（MV）对低级别病原体慢性持续感染反应的in vivo 实验方法十分有限。组织来源MV提取的方法学在文献中描述较少，通常仅涉及从实体瘤、肝脂肪变性、动脉粥样硬化血栓斑块或移植组织等病变组织中获取MV^11,29,30，而脾脏则能够感知血液中的细菌和病毒。此外，脾脏还储存参与免疫反应的红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。红髓中的粒细胞（如中性粒细胞）还可产生活性氧（ROS）和蛋白酶，以清除病原体并防止感染扩散^31,32。然而，据我们所知，目前尚无研究探讨在病原体诱导的组织损伤背景下脾脏来源MV的作用。在生理病理条件下，系统性研究组织MV变化的需求尚未得到满足。

体外 我们实验室的数据表明，LPS 可诱导大鼠脾细胞释放具有促凝活性的微囊泡（MVs），这些微囊泡继而引发培养的冠状动脉内皮细胞衰老，并导致连续的促炎性和促凝性内皮表型¹¹通过使用优化的omega-3配方处理动物，进一步证明了药物调控脾脏微囊泡（MVs）的可行性。对中年和老年大鼠进行口服灌胃给药，可有效保护脾细胞，减少促凝微囊泡的释放，并减轻其对冠状动脉内皮细胞的促衰老毒性作用。³³.

与血液相比，脾脏具有作为个体重要白细胞来源的优势。此外，最近有研究提出了脾脏-心脏轴的概念^3,34，这使得脾脏可能在感染相关的、具有药理学调控意义的心血管风险中发挥一定作用。评估脾脏微囊泡（SMVs）的特性或释放情况，对于理解病原体诱导或炎症反应至关重要。有趣的是，这一评估可在经处理的动物以及多种生理病理模型（如年龄、高血压、糖尿病）中实现。事实上，通过比较中年和老年大鼠³³，仅需进行24小时脾细胞培养，即可揭示脾脏微囊泡在特性与释放方面的差异。

鉴于上述关于脾脏微囊泡（MVs）效应特性随生理病理状态改变以及在大鼠中对其进行药理调控可行性的证据，本文描述了一种用于分离小鼠脾脏微囊泡的标准化方案。该方法更适用于对脾脏微囊泡的深入研究 体内 支持工程小鼠中SMVs介导效应的机制。该方案在C57BL/6小鼠中建立，通过局部腹腔感染实现 P. gingivalis 以证实病原体对脾脏髓样来源效应细胞（SMV）特性的远端作用。

方案

所有实验方案均经当地伦理委员会（APAFIS#28745-2020121815051557）批准，并遵循所在大学及法国国家健康与医学研究院（INSERM）有关动物护理的相关指南。实验使用6至8周龄的雄性年轻C57BL/6小鼠。定期对小鼠进行检查以评估疼痛和应激情况，并每日监测其体重。除非另有说明，所有提取缓冲液和溶液必须无菌且处于室温。

1. 动物准备

1. 每2天对小鼠进行一次腹腔注射牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis，PG），共注射6次，持续2周（每周3次，每次5 × 10⁷个细菌，补充文件1）。
2. 使用100 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪联合麻醉小鼠。
3. 对麻醉后的小鼠实施安乐死，并通过剖腹手术取出脾脏。
   ​注：牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）感染的具体条件以及为获取脾脏而进行动物安乐死的操作详见补充文件1中的"动物实验"部分。本方案各步骤的示意图见图1。

2. 脾细胞的提取

1. 使用手术刀在已盛有 3 mL 含抗生素 RPMI 培养基（链霉素 (100 U/mL)/青霉素 (100 U/mL)、制霉菌素 (250 mg/mL)、L-谷氨酰胺 (2 mM)）并添加了 10% 胎牛血清 (FBS) 的培养皿中，将脾组织切成约 1 mm 的小片（参见材料表）。
2. 将组织片转移至筛网（参见材料表），该筛网事先已固定在 50 mL 聚苯乙烯管上。
3. 使用注射器的推杆作为研杵，在筛网上碾碎组织。
4. 用 RPMI 培养基（3 mL）冲洗筛网。
5. 将细胞悬液滤出物在室温下以 450 × g 离心 5 分钟，并小心通过反流弃去上清液。

3. 红细胞的去除 通过 渗透休克

1. 加入 1 mL ACK 缓冲液（参见材料表），充分混匀，在室温下孵育 3 分钟，并通过手动旋转轻轻振荡。
2. 加入 9 mL RPMI 稀释，使用抽吸和回流法充分混匀。
3. 在室温下以 450 × g 离心 5 分钟。
4. 通过抽吸和回流法弃去上清液，将沉淀重悬于 5 mL RPMI 培养基中。
5. 轻轻混匀（抽吸/回流），必要时通过移液或使用筛网去除任何脂质碎片。

4. 调整分离的脾细胞浓度

1. 取一个含有 900 µL RPMI 的 1.5 mL 微量离心管。
2. 使用微量移液器吸取 100 µL 细胞悬液，加入含有 900 µL RPMI 培养基的 1.5 mL 微量离心管中，并充分混匀。
3. 取 10 µL 稀释后的细胞悬液转移至另一微量离心管中，加入 10 µL 台盼蓝排斥染料，充分混匀。
4. 取 10 µL 上述溶液（步骤 3.3）加入自动细胞计数仪的计数载片中（参见材料表），测定细胞数量。
   注意：仪器软件将提供两个数值：总细胞数以及活细胞数和百分比。
5. 将活细胞浓度调整至 3 或 5 × 10⁶ 个细胞/mL（V_max = 20 mL；最大总容量为 100 × 10⁶ 个细胞/mL）。
6. 将细胞接种至含有 RPMI 培养基的 75 mL 培养瓶中。
7. 将培养瓶垂直放入 37 °C 恒湿培养箱中培养 24 小时。
   警告：台盼蓝具有致突变性和致癌性^35,36。计数时务必佩戴手套，即使在生物安全柜外操作也应如此。移液枪头和液体废物应立即丢弃至指定容器，并清洁实验台面。
   ​注意：若收集的细胞数少于 50 × 10⁶，则使用 25 mL 培养瓶。不同个体之间的细胞数量差异通常不大。此步骤中活细胞比例一般高于 80%。

5. 脾细胞微囊泡的分离

1. 24 小时后，将烧瓶中的内容物倒入 50 mL 聚丙烯或聚苯乙烯管中。
2. 在室温下以 450 × g 离心 15 分钟，以去除细胞和碎片。
3. 离心后，保留 100 µL 第一次上清液（SN1），用于后续测定初始微囊泡（MV）浓度以计算分离得率。记录 SN1 的体积。
4. 将 SN1 在室温下以 450 × g 再次离心 15 分钟。
5. 弃去沉淀，再次在室温下以 450 × g 离心 15 分钟。迅速吸出并收集 SN2（记录体积）。
6. 将 SN2 转移至底部呈锥形的 1.8 mL 微量离心管中。保留 100 µL SN2，用于在 SN1 中碎片过多可能干扰 MV 测定的情况下，测定初始 MV 浓度以计算分离得率。
7. 向沉淀（细胞）中加入 5 mL RPMI 培养基，并计数脾细胞。
   注意：细胞悬液也可用 0.1% 多聚甲醛（终浓度）固定，用于流式细胞术表征³⁷。
8. 将 SN2 在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 1 小时，必要时可提前运行空转子在 4 °C 预冷转子。此步骤产生 SN3。
9. 立即通过将每根微量离心管倒置至一个无菌的 50 mL 管（在生物安全柜内）来吸出 SN3。记录 SN3 的体积。
10. 在生物安全柜内使用移液器轻轻混匀 SN3。保留部分等分试样用于后续测定悬液中的成分。
    注意：此时溶液中已基本不含微囊泡（MV），但含有可溶性介质和外泌体。
11. 将每根微量离心管（闭合状态）在带刺的架子上轻轻刮擦，以机械方式促进沉淀中 MV 的重悬。
12. 向第一根微量离心管中加入 200 µL 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）（见材料表）。
13. 使用 1 mL 微量移液器通过轻柔的吸液/回流循环（约 10 次）重悬第一根管中的 MV 沉淀。务必小心避免产生气泡，因为这会促进囊泡及其他组分在悬液中的氧化。
14. 收集第一根管中重悬的 200 µL MV 悬液，倒入第二根管的沉淀上。如上所述轻轻混匀，然后再次倒入第三根管并轻轻混匀。悬液从管到管逐渐变得越来越浑浊。关闭第三根管。
15. 按照上述方法（步骤 4.14）开始收集接下来的三根微量离心管中的内容物。
16. 将所有重悬的 MV 收集至一个（或两个）收集用微量离心管（2 mL，底部呈锥形）中。保留 50 µL 用于后续计算该步骤的得率。记录悬液总体积。
17. 将收集管在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 1 小时。此步骤产生 SN4。
18. 立即弃去 SN4（倒入上清液收集管中）。保留一份 SN4 等分试样用于计算纯化步骤的得率，并将沉淀轻轻重悬于 500 µL HBSS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）中。保留 50 µL 重悬后的沉淀等分试样用于计算纯化得率，并记录其体积。
19. 将重悬的沉淀在 4 °C 下保存最多一个月，用于无菌条件下的功能检测，或在 -20 °C 下保存用于结构分析。
20. 通过测定上清液和/或沉淀悬液中 MV 的浓度，计算各步骤或整个流程的纯化得率。
    注意：纯化得率（%）：([MV1] × SN1 体积) / ([MV4] × 最终悬液体积) × 100。
    该得率需结合从培养瓶中分离并计数的脾细胞数量（见步骤 4.4）进行综合评估。本实验中，起始细胞数为 111 × 10⁶ 个细胞，上清液体积为 60 mL，纯化得率约为 70%。
    1. 通过测定主要含有外泌体（SN2 和 SN4）且已去除 SMV 的上清液中残留的 SMV 含量，评估操作过程导致的 SMV 损失。
    2. 使用 TRPS 或凝血酶原酶法³⁸ 测定 MV 浓度，以获得高灵敏度和特异性。
       注意：离心后应通过快速倒置倾倒上清液的方式收集 MV。等待或使用 U 形微量离心管会导致 MV 在管壁上的损失。切勿使用微量移液器弃去上清液；如有必要，可直接吸除沉淀。离心停止后不得延误操作。超速离心会导致外泌体污染 MV 沉淀。
       注意：离心速度和时间已优化，以实现 MV 富集并最大限度减少外泌体污染。本方案不适用于研究脾脏单核/巨噬细胞来源的 MV，因为这些细胞可吞噬并迅速重新摄取自身释放的 MV³⁹。该流程不可暂停后再次启动，否则会因细胞活力下降而导致细胞损失。

结果

所提供的数据全面展示了整个实验过程，使用了两种主要的动物模型：未经处理的对照组年轻C57BL/6小鼠，以及其同窝小鼠在接受为期两周、每两天一次、共六次腹腔（IP）注射PG后的实验组。这些数据还显示了腹腔注射PG后两周对脾脏反应的远端作用。脾细胞微囊泡通过凝血酶原酶酶学检测法进行定量，或通过分光光度法测定其蛋白质和RNA浓度；脾细胞悬液中中性粒细胞的比例则通过流式细胞术^33,38确定（见补充文件1的第2-4节及补充图2）。

腹腔注射2周后，脾脏重量和细胞数量增加 P. gingivalis
在年轻成年小鼠中，注射PG后2周脾脏重量显著增加至2.6倍，这可能是由于免疫反应所致。事实上，脾细胞总数也增加了2.3倍（图2每组条件各5只小鼠 p

讨论

本研究证实，与小鼠血液等其他来源（体积有限）相比，脾脏是具有生理病理学意义的微囊泡（MVs）的主要且可靠的来源。只要采取适当预防措施，该方法易于建立，且无需昂贵设备。由于目前尚无其他替代方法 体内 评估可用的情况下，当前模型似乎是研究前药对微囊泡释放影响的一种有价值的方法。重要的是，本文所展示的小鼠脾脏微囊泡（SMVs）收获的标准化方案，应能满足该领域尚未满足的需求 体内 在注射或鼻腔滴注后，对经基因工程改造的小鼠中SMV介导效应的调控进行研究。

该方法还表明，SMVs 是研究局部感染远端效应的相关临床前工具，例如 P. gingivalis 腹腔感染。事实上，通过多种方法观察到，从SMV中释放出的显著差异 P. gingivalis-处理 与未处理动物的测量结果表明，局部腹腔注射已产生可远距离检测到的影响，且在2周后即可观察到。本实验室使用其他远距离指标获得的初步数据 P. gingivalis 感染部位已确认 P. gingivalis 可在感染后第7天...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL Eppendorf管	Dutscher	54816	锥形底部é微量离心管
Allegra 64 R 离心机	Beckman Coulter
自动细胞计数仪	伯乐（Biorad）
牛血清白蛋白	Euromedex	04-100-812-E	经准备后，用0.22 μm滤膜过滤 µm筛网过滤后，4℃保存 °在无菌条件下，使用以下配方：2 mM EDTA、0.5% BSA 和无菌 PBS
CD11（Mac-1）	e-Biosciences	45-00112-80	与 eFluor 450 偶联； λ最大 激发波长 405 nm λ最大 发射波长 445 nm
CD16/32	BD 生物科学	553142	未结合的
EDTA	Calbiochem	Calbiochem	S 6381-92-6
Falcon管	细胞饥饿	227261	50 mL
胎牛血清	Dutscher	S1810-500	批次号 = S14028S1810
Fortessa Aria	BD 生物科学		用于细胞分选
Fortessa 流式细胞仪	BD公司
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	不含酚红，不含钙+2 和 Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6（Gr-1）	BD 生物科学	566218	与BUV395偶联； λ最大 激发波长 348 nm， λ最大 发射波长 395 nm
红细胞裂解缓冲液（ACK）	Sigma		经0.22微米滤膜过滤 µm筛网过滤后，4℃保存°在无菌条件下，使用以下公式计算：NH4Cl，0.15 M（摩尔浓度），53.491（分子量）4 g KHCO3 1 mM（摩尔浓度）（分子量 100.115），50 mg EDTA  0.1 mM（摩尔浓度），292.24（分子量），14.6 g pH：7.2–7.4
NanoDrop 1000 分光光度计	赛默飞世尔科技
PBS	Lonza	17-516F	无钙条件下+2  和 Mg+2
塑料培养皿			100 mm
聚苯乙烯管	Falcon	352070
q-纳米金	iZON science
RPMI 1640 培养基：2 g/L 葡萄糖	PAN biotech	p04-18047	添加链霉素（100 U/mL）、青霉素（100 U/mL）、两性霉素B（250 mg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mM）和10%胎牛血清。
手术刀
尼龙筛网	Falcon USA	352360	100 µm
链霉素/青霉素	PAN biotech	P06-07100
注射器			2 mL
台盼蓝	伯乐（Biorad）	1450013
VCAM1	abcam	ab215380