方法文章

一种诱导小鼠创伤后应激障碍（PTSD）样行为的实验方案

DOI：

10.3791/63803

⸱

2022年7月28日

 , 
1Department of Clinical Genomics, Mayo Clinic

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究通过两次不可逃避的足部电击在小鼠中诱导类似创伤后应激障碍（PTSD）的行为。利用多种针对PTSD特异性行为的检测方法，区分出表现出类似PTSD行为的小鼠和具有抗逆性的小鼠。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

创伤后应激障碍（PTSD）是一种致残性精神疾病，约有10%的个体在经历创伤性事件（TE）后会发展为该疾病。其症状包括反复且侵入性的思维、睡眠障碍、过度警觉、惊跳反应增强以及鲁莽或破坏性行为。鉴于该疾病的复杂性和异质性，模拟PTSD样症状的动物模型在PTSD研究领域日益受到关注。由于对PTSD样症状的抵抗能力（即韧性）是PTSD流行病学中的一个重要方面，因此能够区分易感个体与韧性个体的动物模型具有特别重要的价值。此外，由于PTSD表型本身复杂，且PTSD样行为可能与其他应激诱导的精神病理（如焦虑或抑郁）相关行为存在重叠，因此采用多种指标评估PTSD样行为的动物模型也愈发受到重视。我们采用Lebow等人于2012年建立的一种范式，用于在小鼠中诱导并识别PTSD样症状。该范式通过在连续两天内进行两次非情境化的不可逃避电足底刺激来实现。应激小鼠随后接受四项行为学测试：明暗穿梭、弹珠埋藏、声学惊跳以及家笼活动度检测，从而获得五项PTSD样行为的评估指标：风险探查百分比（%RA）、埋藏弹珠百分比（%MB）、前脉冲抑制百分比（%PPI）、惊跳反应峰值潜伏期（LPSA）以及光照期活动度百分比（%LPA）。PTSD样症状的特征表现为%RA降低、%MB升高、%PPI降低、LPSA缩短以及%LPA升高。在每项测试中，表现最显著的前20%具有PTSD样行为的动物根据测试项目获得相应分数，总分达到一定阈值的动物被定义为PTSD样个体，而得分为零的动物则被定义为PTSD韧性个体。该范式可在约15%的动物中识别出PTSD样行为，这一比例与人类中的观察结果相近。本方案代表了一种在小鼠中诱导PTSD样行为的稳健且可重复的实验范式。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

创伤后应激障碍（PTSD）是一种致残性的精神病理状态，可能发生在经历过创伤性事件（TE）的个体中1。根据《精神障碍诊断与统计手册（第五版）》（DSM-V），TE暴露可表现为多种形式，包括直接或反复间接地暴露于真实或感知到的死亡、身体伤害或性暴力威胁，无论该威胁针对自身或他人2。PTSD的症状特征包括侵入性的负面思维和回忆、过度警觉、警觉性增强、冒险行为增加以及睡眠周期紊乱3。全球范围内，一生中经历TE暴露的流行率相对较高，约为64%–70%3，然而PTSD的终生患病率则相对较低，约为1.3%–12%4。TE暴露与PTSD发病之间在流行率上的差异表明，个体对PTSD的易感性存在显著的基因与环境交互作用。鉴于目前尚缺乏可靠的脊椎动物PTSD样行为模型，研究领域主要依赖行为范式来诱导PTSD样症状5。

创伤后应激障碍（PTSD）是一种复杂且高度异质性的精神疾病，建立稳定可靠的PTSD样症状动物模型一直具有挑战性。常用的PTSD样行为检测指标（如僵直行为）也见于其他创伤诱导的精神病理状态，特别是焦虑和抑郁6。这种情况因PTSD与抑郁症之间较高的共病率而更加复杂2。最近的研究表明，目睹过创伤事件的大鼠表现出焦虑和抑郁行为的增加7,8,9，这进一步凸显了在啮齿类动物PTSD行为模型中评估PTSD特异性行为的重要性。此外，暴露于创伤事件后对PTSD样症状的抵抗能力（即韧性）是PTSD重要的流行病学特征，因为全球范围内一生中经历创伤事件的发生率远高于PTSD的终生患病率。传统上用于诱导PTSD样行为的行为模型（例如研究恐惧记忆的模型）10,11，未能区分出表现出PTSD样症状的动物与暴露于创伤但具有韧性的对照动物（即PTSD韧性动物），通常将所有经历创伤的动物均视为PTSD样动物，且普遍仅使用少数行为检测指标（如僵直行为），而这些指标并非PTSD特有，或同样见于焦虑、抑郁等其他创伤诱导的精神病理状态12。尽管这些范式在研究恐惧记忆相关的神经环路方面是有效的，但缺乏对PTSD样行为的可靠且特异性的评估，可能会影响这些研究数据的转化应用。因此，当前该领域的研究重点转向采用多种PTSD特异性行为检测指标的范式，以同时识别出PTSD样动物和具有韧性的动物12。

我们采用一种近期开发的范式，在小鼠中诱导类似创伤后应激障碍（PTSD）的行为，该范式通过一系列四项行为学测试，评估五种类似PTSD的行为指标，从而识别出具有类似PTSD行为和具有抗逆能力的动物13,14。类似PTSD的行为通过两次分离情境的足部电击来诱导。动物首先在第一天经历一次严重的创伤（Trauma）刺激，随后在第二天接受一次相对较轻的触发（Trigger）刺激（图1）。研究表明，这种组合能显著促进类似PTSD行为的出现。该范式采用急性应激模型诱导PTSD，而非慢性应激（后者可能诱发更倾向于抑郁的表型15）或创伤性脑损伤（可能产生一种不同的类似PTSD表型14）。同样，该范式中用于识别类似PTSD行为的行为学指标——风险寻求行为减少、弹珠埋藏行为增加、前脉冲抑制降低、惊吓反应峰值潜伏期缩短以及光照期活动量增加（图1）——特异性地反映类似PTSD的行为，而非其他创伤诱发的精神病理状态，如焦虑或抑郁。此外，通过多个行为学指标进行综合评估，并要求动物表现出多种类似PTSD的行为才能被归类为类似PTSD个体，这一标准提高了被分类为类似PTSD的动物确实具有类似PTSD表型的可能性。综上所述，该实验方案的这些特点确保了该范式是一种在小鼠中诱导类似PTSD症状的稳健且可靠的方法。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述所有操作程序均经梅奥诊所机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 动物与饲养

  1. 将10周龄雄性C57BL/6J小鼠每笼4只饲养于标准饲养条件下（标准独立通气笼具，室温70 °F，自由摄食饮水） 随意摄取，12小时光照/12小时黑暗循环）。

2. 诱导创伤后应激障碍（PTSD）

  1. 创伤实验
    1. 准备恐惧条件反射实验设备和实验箱。
      1. 在恐惧条件反射软件中设置创伤方案。总时长设为 5100 秒（85 分钟）。从 0 秒至 5100 秒添加白光。在随机的试次间间隔（ITI）内添加十四个持续 1 秒的电流刺激。将电流强度调整为 1.0 mA。
      2. 用1%乙酸溶液擦拭每个恐惧条件化实验箱的所有内表面。
      3. 关闭手术室的照明灯，打开配备红光灯泡的台灯以照亮房间。
      4. 将待检测的动物在不透明遮盖物下直接运送至操作室。
      5. 让动物在黑暗环境中适应实验操作间30分钟，同时给予65 db(A)的白噪声。
      6. 将每只动物放入恐惧条件反射实验箱中，确保实验箱已锁紧，然后使用恐惧条件反射软件启动实验程序。
      7. 当程序结束后，将动物从恐惧条件化装置中移出并放回其笼中。如果当天还需对其他笼子的动物进行检测，应将经创伤暴露的动物转运至与饲养笼室分离的恢复室，以防止受创伤动物向未受创伤动物传递相关信息。
    2. 用70%乙醇清洁恐惧条件化实验箱的内部。如果需要检测更多动物，则用1%乙酸清洁实验箱内部，并重复实验流程，直至所有动物均完成检测。
    3. 触发会话
      1. 设置触发程序。将总时间设为 300 s（5 min）。在 60 s、120 s、180 s、240 s 和 300 s 时分别添加持续 1 s 的电流刺激。调节电流至 0.7 mA。
      2. 在恐惧条件反射实验箱内安装A型框架有机玻璃插件，并用10%乙醇擦拭所有内表面。将白噪声发生器放入每个隔音箱内，并将声音输出调节至70 dB(A)。
      3. 将动物不加遮盖地转运至恐惧条件反射实验房间 通过 一条间接路径，耗时比创伤治疗会话所采用的直接路径更长。
      4. 让动物在恐惧条件反射实验室内适应30分钟。
      5. 将每只动物放入恐惧条件反射实验箱中，打开白噪声发生器，并启动实验程序。
      6. 当程序结束后，将动物从恐惧条件反射箱中取出并放回其笼子中。
      7. 用70%乙醇清洁恐惧条件化实验箱内部。如果还需检测其他动物，则用10%乙醇清洁实验箱内部；如果不再检测其他动物，则用70%乙醇清洁实验箱内部。

3. 行为学评估

  1. 明暗转移
    1. 将明暗转移箱放置在天花板安装的摄像机下方。调整摄像机焦距，使明暗箱充满视野，并调节焦点以确保图像清晰。在连接明区与暗区的门道处覆盖一块不透明塑料板。
      1. 在运动追踪软件中定义明区以及风险评估区（明区门道外正前方1英寸×3英寸的区域）。
      2. 调节明亮区域的光照强度至1,000–1,100 lux。
      3. 将动物转运至实验操作室，并让其适应环境30分钟。
      4. 将每只动物放入暗区，盖上盖子。移除分隔明区与暗区的门板，记录动物5分钟内的运动情况。
      5. 取出动物，并用70%乙醇彻底清洁所有表面。
      6. 通过将动物在风险评估区停留的时间除以在明区停留的总时间，计算每只动物的风险评估百分比（%风险评估）。
      7. 将所有动物放回其饲养笼中。用70%乙醇彻底清洁明暗箱。
  2. 弹珠埋藏实验
    1. 在标准大鼠微隔离笼或类似容器中进行弹珠埋藏实验。每个笼子铺入5 cm厚的新垫料。将笼子放置在实验操作台面上，并将光照强度调节至<10 lux。
    2. 在每个笼子底部均匀排列20颗清洁的黑色玻璃弹珠，形成5×4的网格。
    3. 将动物转运至弹珠埋藏实验操作室，使其适应环境30分钟。
    4. 将每只动物放入弹珠埋藏实验笼中，持续25分钟。25分钟后，将每只小鼠从实验笼中取出并放回其饲养笼。
    5. 通过将埋藏的弹珠数量除以20，计算弹珠埋藏百分比（%）。
  3. 听觉惊跳反应
    1. 在惊跳反应软件中定义惊跳试验、无刺激试验和预脉冲惊跳试验。
      1. 定义120 dB(A)惊跳刺激：发出持续40 ms、强度为120 dB(A)的音调，同时测量惊跳反应幅度。
      2. 定义75 dB(A)、80 dB(A)和85 dB(A)预脉冲刺激：分别发出持续40 ms、强度为75 dB(A)、80 dB(A)或85 dB(A)的音调，随后发出持续40 ms、强度为120 dB(A)的音调，同时测量惊跳反应幅度。
      3. 定义无惊跳刺激：发出持续40 ms、强度为65 dB(A)（背景音）的音调，同时测量惊跳反应幅度。
    2. 定义听觉惊跳反应实验流程。
      1. 将背景音设定为对应65 dB(A)的模拟信号水平。
      2. 在实验开始时设置7次120 dB(A)惊跳试验，随后随机穿插10次120 dB(A)惊跳试验、12次无刺激试验、12次75 dB(A)预脉冲试验、12次80 dB(A)预脉冲试验和12次85 dB(A)预脉冲试验，最后再进行7次120 dB(A)惊跳刺激。
    3. 将动物转移至听觉惊跳反应操作室旁边的房间，使其适应环境30分钟。
    4. 30分钟适应期结束后，在黑暗条件下将待测动物转移至操作室。
    5. 将每只动物放入听觉惊跳装置的限制器中，安装固定插件以限制动物活动，并关闭隔音箱门。确保插件位置适当，使动物位于振动传感器正上方，但仍可自由转身。 
    6. 使用惊跳反应软件启动实验程序。
    7. 程序结束后，将所有动物从听觉惊跳装置中取出，转移至转运笼中。
    8. 用70%乙醇彻底擦拭动物限制器的内表面，进行清洁。
    9. 通过计算每只动物对所有120 dB(A)惊跳刺激的最大速度到达时间的平均值，计算惊跳反应峰值潜伏期。
    10. 计算预脉冲抑制百分比（%PPI）。分别计算120 dB(A)惊跳刺激、无刺激、75 dB(A)预脉冲刺激、80 dB(A)预脉冲刺激和85 dB(A)预脉冲刺激的平均Vmax值。通过从120 dB(A)惊跳刺激的平均Vmax中减去无刺激条件下的平均Vmax，得到净平均惊跳幅度。对于75 dB(A)、80 dB(A)和85 dB(A)预脉冲条件，分别将各预脉冲条件下的平均Vmax除以120 dB(A)条件下的平均Vmax，用1减去该比值后乘以100，得到各条件下的%PPI。最后，通过取75 dB(A)、80 dB(A)和85 dB(A)三种条件下的%PPI的平均值，计算平均%预脉冲抑制。
  4. 家笼活动度
    1. 在家笼活动度实验中，使用配备被动红外传感器（可检测动物运动）的改良微隔离笼盖。将标准水瓶替换为装有塞式饮水头的50 mL锥形管，以减少运动传感器视野中笼底被遮挡的区域。在金属笼架中放置有限量的食物（50–75 g），以减少对运动传感器的遮挡。
    2. 在完成听觉惊跳反应测试后，将动物转运至家笼活动度实验房间。
    3. 将每只动物放入改良的微隔离笼中，并确认红外传感器能够检测到运动。重新安装金属笼顶和笼盖。
    4. 在实验期间每日检查动物，确保每只动物均能充分获取食物和饮水。
    5. 将动物饲养在家笼活动度笼中，持续3个光暗周期（72小时）。
    6. 72小时结束后，停止记录，并将所有动物从其家笼中移出。
    7. 通过将第二和第三光相期间的总活动次数除以最后48小时监测期间的总活动次数，计算光相活动百分比（%光相活动）。
  5. 评分与纳入标准
    1. 对每只动物的%风险评估、%埋藏弹珠数、平均%预脉冲抑制、惊跳反应峰值潜伏期和%光相活动等行为指标，通过减去该队列中该行为测试的均值，再除以该队列中该行为测试的标准差，计算其Z值。
    2. 对每项行为指标中表现最接近PTSD特征的前20%动物进行赋分。在%风险评估最低、%埋藏弹珠数最高、平均%预脉冲抑制最低、惊跳反应峰值潜伏期最短和%光相活动最高的前20%动物中，分别赋予3、1、2、3和1分（表1）。
    3. 将每只动物在各项行为测试中获得的分数相加。总分达到5分或以上的动物被定义为PTSD样动物，得分为0分的动物被定义为抗逆型动物。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们预期在每项行为学测试中，表现出类似创伤后应激障碍（PTSD）行为的动物在各队列中均匀分布。若某一队列中出现类似 PTSD 行为的动物集中现象，可能提示在 PTSD 诱导或行为学测试过程中引入了人为干扰因素。在所有接受测试的队列中，各项行为学指标得分的动物分布均较为均衡（图 2）。在接受 PTSD 诱导范式处理的 48 只动物中，有 7 只（14.6%）得分达到 5 分或以上，被定义为类似 PTSD 动物（图 3）。相比之下，被定义为心理韧性（resilient）的动物数量显著更多。对类似 PTSD 动物与心理韧性动物的回顾性评估显示，类似 PTSD 动物在弹珠埋藏实验（Marble Burying）、前脉冲抑制（Prepulse Inhibition）、惊吓反应峰值潜伏期（Latency to Peak Startle Amplitude）以及家笼活动度（Home Cage Activity）中表现出显著更多的 PTSD 样行为。此外，与心理韧性对照组相比，类似 PTSD 动物在各项行为学测试中的平均行为 Z 值（...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

创伤后应激障碍（PTSD）是一种复杂且具有异质性的精神疾病。遗憾的是，目前尚无可靠的 PTSD 样行为动物模型，而用于诱导 PTSD 样行为的行为学范式是产生具有 PTSD 样行为表型动物的最可靠方法。本文所述范式通过采用急性创伤诱导 PTSD 样行为，并结合多种针对 PTSD 的特异性行为检测指标来识别 PTSD 样动物，从而提供了一种稳定且可靠的方法。该范式所采用的 PTSD 特异性行为指标具有高度的临床相关性。在声学惊跳反应测试中可获得五个评分点（其中惊跳反应峰值潜伏期缩短占三分，前脉冲抑制率降低占两分），而过度警觉是 PTSD 患者自我报告中与生活质量下降最密切相关的核心症状16。最终，动物必须在至少两个行为检测指标中处于所有动物评分的前 20% 以上，才能获得足够分数被定义为 PTSD 样动物，从而降低因单一测试中出现假性 PTSD 样行为而导致错误分类的可能性。

行为学测试应在小鼠的活跃阶段，即黑暗期进行，且不得早于黑暗期开始后4小时，以确保所有动物均处于皮质酮循环的稳定阶段。因此，强烈建议将动物饲养在颠倒的光/暗循环条件...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者均无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的完成得益于Hayward基金会和Marriot家族的慷慨支持。我们还要感谢杜兰大学和梅奥诊所的IACUC委员会及比较医学部门，以及梅奥诊所啮齿类动物行为研究设施的工作人员所付出的辛勤努力与专业贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
冰醋酸Sigma AldrichAX0073
台式天平Fisher Scientific01-913-925
Clocklab 数据采集套件Actimetrics-家庭笼活动监测笼
分贝计
Ethovision XT14 软件Noldus-运动轨迹追踪软件
乙醇Sigma Aldrich443611
明暗箱Noldus-明暗穿梭箱
照度计
单色GigE相机Noldus-需使用Noldus提供的天花板安装硬件
小鼠用NIR视频恐惧条件化系统［标准型，USB］Med AssociatesMED-VFC2-USB-M恐惧条件化设备及实验舱。该套装包含每次检测1只动物所需全部设备。
喷雾瓶Thermo ScientificBirA500
SR LAB 软件San Diego Instruments-惊跳反应分析软件
SR LAB 惊跳反应测试仪San Diego Instruments-声学惊跳反应装置
视频恐惧条件化 "Video Freeze " 软件Med AssociatesSOF-843恐惧条件化软件
白噪声发生器Med AssociatesENV-230

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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