基于肿胀组织振动成像与分析的无标记超分辨率成像

摘要

通过将样本扩增水凝胶化学与无标记化学特异性受激拉曼散射显微技术相结合，本实验方案描述了如何在生物样本中实现无标记的超分辨率三维成像。结合额外的机器学习图像分割算法，获得了无需抗体标记的组织中蛋白质特异性的多组分图像。

摘要

荧光显微镜，尤其是超分辨率显微镜的广泛应用，极大地推动了现代生物学知识的发展。然而，荧光技术中对荧光染料标记的需求带来了诸多挑战，例如光漂白、荧光探针标记不均以及样本处理时间过长等问题。本实验方案详细介绍了膨胀组织振动成像与分析（VISTA）的工作流程。VISTA 克服了与荧光染料相关的障碍，实现了对生物样本无需标记的超分辨率三维成像，空间分辨率可达 78 nm。该方法通过将细胞和组织包埋于水凝胶中，对水凝胶样本杂合物进行各向同性扩增，并利用受激拉曼散射显微镜通过振动成像可视化内源性蛋白质分布。该方法已在细胞和小鼠脑组织上得到验证。观察到高度相关的 VISTA 与免疫荧光图像，证实了成像特异性的蛋白质来源。利用这种相关性，训练了一种基于机器学习的图像分割算法，可从小鼠脑组织无标记图像中预测细胞核、血管、神经元细胞和树突等多种组分。该方法进一步被改进用于高通量研究细胞中的聚谷氨酰胺（polyQ）病理聚集体以及脑组织中的淀粉样蛋白-beta（Aβ）斑块，证明了其在大规模临床样本分析中的应用潜力。

引言

光学成像技术的发展彻底改变了现代生物学的研究，因为这些方法能够提供前所未有的空间和时间信息，涵盖从亚细胞蛋白质到完整器官的不同尺度¹。其中，荧光显微镜技术最为成熟，拥有大量具有高消光系数和高量子产率的有机染料²，易于使用的基因编码荧光蛋白³，以及用于纳米级结构成像的超分辨率技术，如STED、PALM和STORM^4,5。此外，近年来在样本工程和保存化学方面的进展，通过将样本包埋于可膨胀的聚合物水凝胶中并实现膨胀^6,7,8，使得在常规荧光显微镜上即可实现突破衍射极限的分辨率。例如，典型的扩展显微镜技术（ExM）通过四倍各向同性样本膨胀，可将图像分辨率有效提高四倍⁷。

尽管具有诸多优势，超分辨率荧光显微技术仍存在源于荧光标记的局限性。首先，荧光染料的光漂白和失活会损害重复性和定量荧光检测的能力。当持续光照将电子泵入电子激发态时，光漂白是不可避免的现象⁹。其次，将荧光染料标记到目标分子上并不总是一个简单直接的过程。例如，免疫染色需要漫长且繁琐的样品制备流程，限制了成像通量¹⁰。此外，由于抗体标记不均一，尤其是在组织深层，可能引入假象¹¹。同时，针对特定蛋白设计合适的荧光标记策略可能尚不完善。例如，为Aβ斑块筛选有效的抗体曾需要大量广泛的筛选工作¹²。较小的有机染料（如刚果红）通常特异性有限，仅能染色Aβ斑块的核心区域。因此，开发一种无需标记的超分辨率成像方法显得尤为迫切，该方法可规避荧光标记的缺陷，提供从细胞到组织乃至大规模人体样本的互补性高分辨率成像。

拉曼显微技术通过检测激发的振动跃迁，为化学特异性结构提供无需标记的对比度，并绘制出原本不可见的化学键分布图¹³。特别是，针对无标记或极低标记样品的受激拉曼散射（SRS）成像已被证明具有与荧光显微技术相当的速度和分辨率^14,15。例如，在人和小鼠组织中，健康脑区可被清晰地区分于肿瘤浸润区域^16,17。在未经任何标记的新鲜冷冻脑切片上，通过靶向蛋白质的CH₃振动峰（2940 cm⁻¹）和酰胺I带（1660 cm⁻¹），Aβ斑块也实现了清晰成像¹⁸。因此，拉曼散射提供了强大且无需标记的对比机制，克服了荧光染料的局限性。接下来的问题是，如何利用拉曼散射实现超分辨率成像，从而揭示生物样品中的纳米级结构细节及其功能意义。

尽管已有大量研究通过精密的光学仪器实现了拉曼显微镜的超分辨率成像，但在生物样品上的分辨率提升仍然十分有限^19,20,21。在此基础上，结合近期的研究工作^22,23，我们提出了一种将样品膨胀策略与受激拉曼散射相结合的超分辨率无标记振动成像方案，命名为“膨胀组织振动成像与分析”（Vibrational Imaging of Swelled Tissues and Analysis, VISTA）。首先，通过优化的蛋白质-水凝胶杂交方案将细胞和组织嵌入水凝胶基质中。随后，将水凝胶-组织杂合体在富含去垢剂的溶液中孵育以实现脱脂，再在水中进行膨胀处理。膨胀后的样品通过常规的受激拉曼散射（SRS）显微镜成像，靶向检测内源性蛋白质中保留的CH₃振动信号。由于VISTA具有无标记成像的特点，避免了荧光标记引起的光漂白和标记不均一性问题，显著提高了样品处理通量。这也是目前首个实现亚100 nm（低至78 nm）分辨率的无标记成像技术。该方法无需在标准SRS系统之外添加额外的光学装置^22,24，因而易于推广应用。通过联合使用VISTA与免疫荧光成像，我们训练了一种成熟的机器学习图像分割算法^25,26，可从单通道图像生成蛋白质特异性的多重化图像。该方法进一步被应用于小鼠脑组织中Aβ斑块的研究，提供了涵盖斑块核心及周围由细胞核和血管环绕的细丝结构的全景图像，适用于基于精细结构特征的亚型分类分析。

方案

本研究中所有动物实验程序均经加州理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，且实验方案符合所有相关伦理规定。

1. 固定和样本扩增用储备溶液的配制

1. 首先将12 g丙烯酰胺（30% w/v）固体溶解于26 mL无核酸酶水中，配制40 mL固定液。然后向混合液中加入10 mL 16%多聚甲醛（PFA）储备液。最后加入4 mL 10×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。配制好的溶液可在4 °C保存最多2周。
   注意：丙烯酰胺具有危害性，溶解丙烯酰胺固体的操作应在通风橱中进行。
2. 通过将70 mg丙烯酸钠（7% w/v）、200 mg丙烯酰胺（20% w/v）和50 µL N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（0.1% w/v）溶解于420 µL超纯水中，配制胶化溶液（储备液X）。最后加入57 µL经无菌滤膜过滤的10× PBS（pH 7.4），并将该溶液在−20 °C保存最多1周。
   注意：避免使用结块的丙烯酸钠固体；确保所用丙烯酸钠为分散性粉末。所制得的储备液X应为无色液体；若液体呈淡黄色，则需更换新的丙烯酸钠。
3. 通过将1 g过硫酸铵（APS，10% w/w）溶解于9 mL无核酸酶水中，配制聚合引发剂溶液。同样地，通过将1 g四甲基乙二胺（TEMED，10% w/w）溶解于9 mL无核酸酶水中，配制聚合加速剂溶液。将所得溶液分装后于−20 °C保存。
4. 将2.88 g十二烷基硫酸钠（SDS，200 mM）、0.584 g氯化钠（200 mM）和2.5 mL 1 M Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8）溶解于无核酸酶水中，配制50 mL变性缓冲液。
   ​注意：SDS浓度接近其饱和状态，缓冲液中出现少量结晶属正常现象。轻微加热至37 °C可使溶液变澄清并可使用。

2. 哺乳动物细胞样品的制备

1. 将3.5 × 10⁴个HeLa细胞接种到24孔板中的12 mm硼硅酸盐盖玻片（#1.5）上，然后在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素抗生素的400 µL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（完全DMEM）中，于37 °C、5% CO₂的湿化环境中培养细胞。
2. 为获得处于不同有丝分裂阶段的细胞，先在完全DMEM中培养细胞至60%汇合度。随后，用不含胎牛血清的DMEM处理细胞20小时，以同步细胞周期阶段。同步完成后，更换为完全DMEM继续孵育2–6小时，以获取不同有丝分裂阶段的细胞。
3. 用无菌PBS洗涤盖玻片上的HeLa细胞，随后加入固定液（含4%多聚甲醛和30%丙烯酰胺[AA]的PBS），于37 °C孵育7–8小时，再进行后续处理。
   注意：较高的固定温度结合高浓度丙烯酰胺有助于在固定过程中抑制蛋白质间的分子间交联，据报道可更好地保存蛋白质的精细超微结构⁸。
4. 对于含有polyQ聚集体的细胞，将细胞在完全DMEM中培养至70%–90%汇合度。更换新鲜完全DMEM后，使用转染试剂（详见材料表）将1 µg编码mHtt97Q-GFP的质粒转染入细胞。转染操作请遵循试剂生产商的说明书。
5. 转染后24–48小时，移除培养基，并向含细胞的盖玻片中加入800 µL固定液（4%多聚甲醛，30%丙烯酰胺）。于37 °C孵育6–8小时。用PBS洗涤盖玻片3次，所得细胞样品即可用于后续处理。

3. 小鼠脑组织样本的制备

1. 从商业来源购买C57BL/6J小鼠（6至8周龄，雄性和雌性，共六只）和阿尔茨海默病小鼠（9月龄，雌性，三只）（详见材料表）。根据标准方案²⁷通过二氧化碳麻醉实施安乐死。简言之，将小鼠放入密闭舱内，以每分钟30%-70%舱体体积的流速通入100% CO₂，并在临床死亡后继续维持气流至少1分钟。
2. 确认人道安乐死后，立即使用剪刀将小鼠断头。沿中线皮肤做大切口暴露颅骨，将皮肤向动物鼻部方向拉开，充分暴露颅骨。
3. 用精细剪刀沿中线剪开颅骨，并将颅骨两侧半片剥离。用镊子将脑组织取出，置于含PBS的冰上培养皿中。用预冷的PBS清洗新鲜小鼠脑组织，随后将其转移至10 mL固定液（4%多聚甲醛，30%乙醇）中。
4. 将小鼠脑组织在固定液中4 °C孵育24-48小时，然后转移至37 °C过夜。用无菌PBS洗涤后，使用振动切片机将脑组织切成150 µm厚的切片，并保存于4 °C的PBS中。

4. 细胞和组织样本的水凝胶包埋、变性及扩增

1. 确保样品在固定缓冲液中孵育的时间符合上述要求。将储备液 X、自由基引发剂和加速剂储备液解冻，并在整个操作过程中置于冰上。
   注意：孵育时间不足可能导致水凝胶杂交体上保留的蛋白质数量减少，从而导致信号减弱。
2. 用镊子夹取带有细胞的盖玻片，将其放置在载玻片上。用软毛画笔小心挑取脑切片（厚度为 150 µm），将其放置在另一张载玻片上，确保切片平整。去除随样品带出的多余液体。
3. 在载玻片上的样品两侧，通过滴加水滴将两张盖玻片（#1.5）叠放在一起，形成凝胶反应室。将载有样品的载玻片正面朝上放置于预冷的金属加热块上，冷却至 4 °C，持续 1 分钟。
4. 向储备液 X 中加入 10% (w/w) 的 TEMED，随后加入 10% 的 APS 溶液。迅速涡旋混匀，并在混合后 1 分钟内将所得溶液缓慢滴加至凝胶反应室中，覆盖样品表面，避免产生气泡。在加入样品前，将溶液和样品始终保持在冰上（或冰冻金属块上），以防止提前形成凝胶（聚合度过高）。
5. 当样品完全浸入溶液后，在其上方覆盖一张平整、透明、带薄膜的盖玻片作为反应室的盖子。将反应室继续置于冰上或冰冻金属块上 1 分钟，随后转移至 37 °C 恒温湿化培养箱中孵育 30 分钟。
6. 从 37 °C 培养箱中取出载玻片上的凝胶反应室。移除盖玻片后应可见不透明的凝胶。可用刀片切割取出凝胶；或者，将载玻片放入室温变性缓冲液中孵育 15 分钟，凝胶会自动从载玻片上脱离。
7. 将分离后的凝胶在加热条件下置于变性缓冲液中孵育，以实现进一步的变性和脱脂。对于细胞样品，在 95 °C 下变性 1 小时；对于 150 µm 厚的脑切片，先在 70 °C 下变性 3 小时，再在 95 °C 下变性 1 小时。
   注意：凝胶在室温变性缓冲液中初始孵育时可能出现卷曲现象，此为正常情况，高温变性后将恢复平整。处理较厚组织样品时，需延长变性时间。
8. 热处理完成后，用 PBS 洗涤变性后的样品 3 次，每次 10 分钟。此时凝胶体积应已膨胀至原始大小的约 1.5 倍。将洗涤后的凝胶置于大量超纯水中（容器体积至少为凝胶体积的 20 倍）继续孵育，以获得更高的膨胀倍数。每隔 1 小时更换一次水，共更换 3 次，并将样品在避光条件下静置过夜。最终所得凝胶即可用于成像。
   ​注意：膨胀倍数在很大程度上取决于原始样品的机械特性。实验中细胞样品实现了 4.2 倍的膨胀，脑组织样品实现了 3.4 倍的膨胀。

5. 扩展后细胞和组织样本中内源性蛋白质分布的无标记成像

1. 成像过程中将膨胀后的凝胶样品保存在水中。凝胶膨胀后较为脆弱，应小心操作。将承载膨胀样品的凝胶置于带有适当开口尺寸和深度的显微镜隔片（spacer）的载玻片（1 mm 厚）上，并用水填充隔片区域。用盖玻片（#1.5）覆盖隔片，并确保密封良好，以避免样品移动。
2. 将带有膨胀细胞或组织的样品放置于电动载物台上，盖玻片朝向物镜。在软件中点击 目镜 以切换光路至明场模式，并使用手动旋钮调节 z 轴位置。
3. 在样品顶部添加浸油，并在25倍物镜下观察明场图像的同时，调节聚光镜至科勒照明的正确位置。在激光控制面板的OPO波长窗口中输入791.3 nm，以靶向蛋白质CH₃在2940 cm⁻¹处的振动峰。
4. 通过点击 LSM 按钮将显微镜光源从明场（目镜）切换至激光扫描模式，并在激光控制面板上点击 快门 按钮打开SRS激光快门。在显微镜软件中按下 实时 按钮以开始实时图像采集。
5. 在短像素驻留时间（12.5 µs/像素）和低图像分辨率（256像素 × 256像素）下观察SRS图像，同时调节z轴以找到最佳焦平面。一旦确定理想的z轴位置，通过拖动显微镜软件中的相应滑块来调整扫描尺寸和像素驻留时间。
6. 在超采样条件下（1024像素 × 1024像素）并采用较长的像素驻留时间（80 µs/像素，与锁相放大器的时间常数匹配），点击 LSM 按钮进行图像采集。通过以1 µm步长在z方向采集z堆栈图像来获取三维图像。使用ImageJ对软件保存的OIR文件进行处理和分析。
   注：详细的SRS系统设置最近已在Mutlu等人的研究中报道²⁴。本实验中，将重复频率为80 MHz、带宽为2 ps的可调谐皮秒激光器（泵浦光：770–990 nm；斯托克斯光：1031.2 nm）导入激光扫描共聚焦显微镜（详见材料表）。使用纯D₂O优化两束光在时间和空间上的重叠。由于凝胶内部折射率高度均一，在明场下为膨胀样品寻找合适的z轴位置需要一定努力。
7. 通过分别使用25倍和60倍物镜对聚苯乙烯微球（100 nm）进行SRS成像，以确定VISTA的分辨率。将泵浦激光波长设为784.5 nm，对应于聚苯乙烯芳香族C-H伸缩振动特征拉曼位移3050 cm⁻¹。
   注：此处使用的泵浦激光波长与VISTA中用于蛋白质成像的波长相近。
8. 使用60倍物镜时，微球图像的实验半高全宽（FWHM，即信号幅度一半处的线型宽度）为276.17 nm。将微球物体建模为半圆形。
   ​注：当点扩散函数（PSF）的高斯函数参数c（σ）为269 nm/2.35时，卷积后的微球图像测得的FWHM为276.17 nm。因此，根据瑞利判据，SRS系统的分辨率为269 nm × 1.22 = 328 nm。由于VISTA对细胞样品的平均膨胀倍数为4.2倍，其有效分辨率可达328 nm/4.2 = 78 nm。

6. 免疫标记并扩增组织样本的VISTA相关荧光成像

1. 变性后，将包埋在水凝胶中的样品（如150 µm脑冠状切片）在1%（v/v）Triton X-100（PBST）中预孵育15分钟。随后更换为含一抗（1:100稀释）的PBST缓冲液进行孵育。若需进行多重成像以检测多个蛋白靶标，可将针对不同靶标的一抗按适当浓度混合于同一抗体混合液中，与样品同时孵育。
2. 在37 °C、80 rpm轻柔振荡条件下，将凝胶与稀释的一抗共同孵育16–18小时，随后用PBST在37 °C充分洗涤3次，每次1–2小时。在孵育过程中翻转凝胶，以防止此处及后续所有孵育步骤中出现抗体标记不均。
3. 将样品与相应物种来源的二抗按1:100比例溶于PBST中，37 °C避光孵育12–16小时。用PBST在37 °C轻摇洗涤标记好的水凝胶样品3次，每次1–2小时。
4. 将DAPI用PBS稀释至终浓度为3 µM。加入足量DAPI溶液至样本水凝胶中，确保凝胶完全浸没于溶液中。室温下避光孵育1–2小时，同时以80 rpm轻微振荡。用PBS洗涤样本3次。
5. 通过将免疫标记的凝胶样品与大量双去离子 H₂O 孵育，使其充分膨胀₂O. 每隔1小时换水一次，共换3次，并将样品置于H中孵育₂O 过夜，避光。标记期间，凝胶相较于 PBS 缓冲液应膨胀 1.5 倍。
6. 按照步骤5.1所述制备成像样品。将成像样品置于激光扫描共聚焦显微镜上，使用25倍、1.05 NA、水浸物镜进行荧光成像。
7. 根据目标抗体，在显微镜软件的下拉菜单中选择相应的激发激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm）与PMT配对的正确通道。按下LIVE按钮以进行实时图像采集。
8. 通过手动旋钮根据实时荧光信号调整焦平面位置。在显微镜软件中根据实时荧光信号优化激光功率、像素驻留时间和光电倍增管（PMT）增益，以避免信号过暗或过度饱和。
   注意：根据已报道的不同抗体的结构评估其外观和特性，以消除潜在的抗体交叉反应，并避免不同荧光通道之间的串扰。
9. 击中 激光扫描显微镜 单击按钮以开始采集关联的SRS和荧光图像。首先，在免疫标记的样本上采集三维荧光图像。荧光成像完成后，将显微镜光路切换至红外（IR）透射状态。
10. 将显微镜软件中的检测通道从荧光PMT切换至SRS。打开SRS激光的快门，对同一视野范围内的样品在相同的z轴范围内进行SRS三维成像。常规成像范围为100–200 µm，最大可扩展至700 µm。
    ​注意：由于激发激光的波长不同，荧光图像与SRS图像之间存在轻微的色差，导致z轴位置发生偏移。需要对SRS图像与荧光z轴层扫图像进行手动并列比较。应寻找SRS通道与荧光通道中完全匹配的特征结构，以精确对齐z轴位置。

7. U-Net 架构的构建、训练与验证

注意：建议在 Linux 系统上进行安装。需要配备显存大于>10 GB 的显卡。

1. 设置环境
   1. 在 3-5.3.0-linux-x86_64 系统上安装 Anaconda 或 Miniconda。克隆或下载以下文件：https://github.com/Li-En-Good/VISTA。使用以下命令行为该平台创建 Conda 环境:
      ​conda env create -f environment.yml
2. 训练预测模型
   1. 将对应的SRS图像目录与真实标签图像目录配对，并保存为csv文件。SRS图像的目录路径置于path_signal列，真实标签图像的目录路径置于path_target列。
   2. 将 csv 文件放入 data/csvs 文件夹中。如有需要，修改 scripts/train_model_2d.sh 中的配置。使用命令行激活环境：
      ​conda activate fnet
   3. 使用命令行启动模型训练：
      ./scripts/train_model_2d.sh <csv 文件的文件名> 0
      训练将随即开始。每次迭代的损失值将在命令行中显示，并与模型一同保存在 save_models/ 文件夹中。<csv 文件的文件名>.
3. 使用命令行验证训练集和测试集中的图像：
   ./scripts/train_model_2d.sh <csv 文件的文件名> 0
   预测结果将保存在 results/ 文件夹中<csv 文件的文件名>.

8. 在无标记图像中结合 VISTA 与 U-Net 预测实现蛋白质特异性多重检测

1. 修改 data/csvs/<csv 文件名>/test.csv 文件。将 path_signal 和 path_target 的目录均替换为新的 SRS 图像所在目录。
2. 删除训练生成的预测结果文件夹 results/<csv 文件名>。使用以下命令行运行预测：
   ./scripts/train_model_2d.sh <csv 文件名> 0
   预测结果将保存在 results/<csv 文件名>/test 文件夹中。

结果

在确定成像与分析方法的工作原理后，通过图像配准来评估扩增倍数，并确保样品处理过程中的各向同性扩增（图1A，B）。对未经处理和经过VISTA处理的样品均在2940 cm⁻¹的化学键振动信号处进行成像，该信号来源于内源性蛋白质中的CH₃基团。在未经处理的样品中，由于周围组织中脂质含量较高，富含蛋白质的结构（如细胞核）呈现暗色²²（图1A）。在经过包括脱脂处理在内的样品处理后，所得图像显示出相同结构但对比度相反的特征（图1B）。细胞核和血管的形态及相对位置完全保持不变（图1A，B；编号结构），证实该处理过程为各向同性过程。通过比较相应细胞核的尺寸，得出该方法可使脑组织样品较未处理样品实现3.4倍的扩增²²

讨论

综上所述，我们介绍了VISTA技术的实验方案，这是一种无需标记即可对细胞和组织中富含蛋白质的细胞及亚细胞结构进行成像的无标记成像方法。该方法通过靶向水凝胶包埋的细胞和组织中蛋白质内源性的CH₃基团，可在生物样本中实现低至78 nm的有效成像分辨率，并能够分辨亨廷顿蛋白聚集体以及Aβ斑块中纤维的微小突起。该技术是首个实现无标记成像模态下亚100 nm分辨率的报道²²。与现有的扩增方法^{6,7,8,28,33,34}相比，该技术继承了无标记受激拉曼散射（SRS）成像的优点，因此不受激光照射引起的光漂白、失活或淬灭的影响。此外，作为一种无标记方法，它避免了诸如DISCO

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% 多聚甲醛	Electron microscopy science	15710	用 PBS 稀释至 4%
25x 水浸物镜	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD 小鼠	突变小鼠资源与研究中心及杰克逊实验室	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	阿尔茨海默病脑组织
60x 水浸物镜	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A9099
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678
抗 MAP2 抗体	Cell Signaling Technology	8707
抗 NeuN 抗体	Cell Signaling Technology	24307
硼硅酸盐盖玻片 #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室 (JAX)	664	正常小鼠
D2O	Sigma-Aldrich	151882	用于受激拉曼散射（SRS）校准
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
载玻片 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
驴抗鸡 IgY，Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
驴抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
驴抗兔 IgG，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
驴抗大鼠 IgG，Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal 硅胶隔离器	Sigma-Aldrich	GBL664108	显微镜间隔垫片
Htt-97Q-GFP 质粒	由 Prof. R. Kopito 和 Prof. F.-U. Hartl 惠赠
激光扫描显微镜	Olympus	FV3000	激光共聚焦显微镜
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	转染试剂
番茄凝集素 DyLight®594（凝集素）	Vector Laboratories	DL-1177-1
显微镜间隔垫片	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）	Sigma-Aldrich	M1533	购自 2% 水溶液
无核酸酶水	Thermo Fisher	10977-015
青霉素-链霉素	GIBCO	15140-122
聚苯乙烯微珠	Sigma-Aldrich	43302	用于分辨率表征
丙烯酸钠	Sigma-Aldrich	408220
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	71725
软毛画笔 #3	TANIS	000333
SRS 激光器	A.P.E	picoEmerald	2 ps 脉冲宽度
四甲基乙二胺	Sigma-Aldrich	T9281
细胞培养瓶 25 cm²	Corning	430639
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	T8787
吐温-20	Sigma-Aldrich	P9416
镊子	精细科学工具	11295-51
振动切片机	Leica	VT1200S	振动切片装置