方法文章

使用微孔板读数仪提高细菌生长数据高通量定量的可重复性与精确性

DOI：

10.3791/63849

⸱

2022年7月27日

 ,  ,  , 
1Chemical and Biological Engineering Department, University of British Columbia, 2Process Engineering and Applied Science, Dalhousie University, 3Food Science and Technology, Dalhousie University, 4Center for Water Resources Studies, Civil and Resource Engineering, Dalhousie University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种高通量的实验方案，用于测量生长数据，包括生长曲线、生长速率和最大生长速率。该方案通过两种生物膜形成细菌进行了验证和确认。本研究中的结果和方法可拓展应用于其他基于微孔板读板仪的高通量实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究旨在建立一种可重复、可靠且高通量的实验方案，用于在96孔板中监测细菌生长并分析其最大生长速率。实验测定了两种细菌的生长曲线及其最大生长速率，并探讨了以下关键问题：（i）盖子冷凝、（ii）光程校正、（iii）接种量、（iv）采样时间间隔以及（v）孔板空间偏差。通过三次独立的技术重复实验评估了该方案的可重复性，各次运行之间的标准差为0.03。结果显示，Bacillus mycoides 和 Paenibacillus tundrae 的最大生长速率分别为 （均值 ± 标准差）0.99 h−1 ± 0.03 h−1 和 0.85 h−1 ± 0.025 h−1。由于这两种细菌易于聚集，因此在光学监测上更具挑战性。本研究证明了接种量、光程校正、加热盖板、采样时间间隔以及微孔板空间偏差对于在微孔板读数仪上获得可靠、准确且可重复数据的关键重要性。所建立的实验方案及其验证步骤可推广至其他基于微孔板读数仪和高通量技术的方法，有助于减少研究人员的操作误差和材料成本。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对包括细菌机制和代谢研究在内的多组学操控产生兴趣，凸显了高通量和自动化方法的重要性，例如记录生长数据1,2。包含动力学参数（如最大生长速率）的生长数据有助于表征细菌在不同物理、化学和抗菌条件下的响应。生长速率数据是揭示潜在基因型-表型关联1 或指示食品微生物安全性和保质期3,4 的标准响应变量。适应性实验室进化5,6,7、全基因组筛选、某些化学检测8 以及多种正向遗传筛选9 等技术均依赖生长速率来评估实验结果。

细菌培养物的光密度（OD）测定是监测细菌生长的标准微生物学方法。OD 测定通常在 600 nm 波长下进行，其原理基于光散射和细胞密度10,11。比尔-朗伯定律解释了 OD 值对浓度（即细胞密度、细胞数量）、光程长度和吸光系数的依赖性。分光光度计的几何结构和光学系统会影响 OD 读数11。传统的 OD 测定方法可能非常耗时且劳动强度大，且数据容易引入多种人为误差。在本实验方案中，采用微孔板读数仪以减少操作人员的工作时间12,13，并降低生物污染的风险。利用微孔板读数仪进行高通量分析已广泛应用于多个微生物学领域，例如筛选产生物膜的细菌14,15、细菌生长抑制实验16、酵母细胞生长分析17、抗真菌药物敏感性测定18，以及纳米材料的毒性筛选19。

已有少数研究人员发表了使用酶标仪测定细菌生长速率的实验方案12,20,21。然而，目前尚未建立一套系统评估所采集数据可靠性的完整实验流程。据报道，物种类型22,23,24以及封板膜等因子会影响96孔板中的氧气传递效率，从而影响实验的重复性25,26。Delaney 等人曾报告，在使用酶标仪时，Methylorubrum extorquens（野生型菌株）在培养基中形成大量菌体聚集体，导致生长数据噪声极大24。该问题通过敲除与生物膜生成相关的基因得以解决24。由于分泌胞外聚合物，能够形成生物膜的细菌更倾向于聚集并形成细胞团块。因此，使用光散射技术（如分光光度计和酶标仪）监测其生长情况更具挑战性。

本方案旨在建立使用酶标仪进行高通量实验以获得可重复数据的操作步骤。Bacillus mycoides 和 Paenibacillus tundrae 因其生长迅速且具有生物膜形成能力而被选用 ，这类菌株在传统的人工和自动化操作中通常较难处理。本研究考察了若干影响因素，包括（i）光程校正、（ii）盖子上的冷凝现象、（iii）接种量、（iv）取样时间间隔以及（v）空间偏差，以评估数据的可靠性和可重复性。本方案详细介绍了利用酶标仪准确监测细菌生长并测定比生长速率的具体步骤。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：本实验方案中的所有步骤都必须在无菌条件下进行（即在两处火焰之间或生物安全柜内操作）。所有材料和工具均需高压灭菌 20 分钟。有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。操作时需对戴手套的手进行消毒，并用手部消毒剂或 70% 酒精溶液保持湿润至少 1 分钟，之后不得将手移出安全柜。若手部离开安全柜，则在重新放入前必须重复消毒程序。警告：使用明火前，务必确保消毒剂已完全挥发。

注意：此前已报道，从饮用水生物滤池中分离出两种细菌27，因其具有形成生物膜的能力。通过全长16S rRNA测序鉴定，并提交至NCBI，分别为 Bacillus mycoides (SAMN10518261) 和 Paenibacillus tundrae (SAMN10452279)。

1. 在甘油中制备细菌保存液

  1. 称取 3 g 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）粉末，溶于 100 mL 蒸馏水中。将肉汤在高压灭菌器中灭菌 20 分钟，然后冷却至室温。向 50 mL 锥形瓶中加入 50 mL TSB。
  2. 将细菌转移至琼脂平板27,28。用接种环从琼脂平板上挑取一个单菌落，将接种环上的菌体轻轻旋转加入锥形瓶中。在 30 °C ± 1 °C 条件下，以 150 rpm 振荡培养过夜。
    注意：温度和振荡速度需根据菌株类型进行调整。
  3. 另准备一个 50 mL 锥形瓶，加入 47.5 mL TSB。将 2.5 mL 过夜培养物转移至该锥形瓶中。继续培养 5–6 小时，使菌液 OD600 达到 0.6 ± 0.05（进入对数生长期中期）。
  4. 将培养物转移至一个 50 mL 无菌离心管中，在 2,200 × g 条件下离心 10 分钟。小心倾去上清液，避免损失管底沉淀的细胞。
  5. 向同一离心管中加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），在 2,200 × g 条件下离心 10 分钟。重复此步骤 3 次。
  6. 使用移液器加入适量 PBS 溶液，将细胞悬液的 OD600 调整至 0.6 ± 0.05。准确记录所加入的 PBS 体积，以备后续使用。
  7. 向菌悬液中滴加甘油，使其终浓度达到 20% v/v。盖紧管盖，涡旋混匀 15 秒。
  8. 将 1.5 mL 菌悬液转移至 2 mL 冻存管中。将冻存管放入合适的冻存盒，于 −80 °C 冰箱中保存。

2. 准备过夜培养物。

  1. 将装有菌种的冻存管在室温下放置30分钟，或直至内容物完全融化。
    注意：不建议加速融化过程。
  2. 准备一支含有10 mL TSB的无菌试管。将50 µL菌种悬液转移至该试管中。在30 °C ± 1 °C条件下，以150 rpm振荡培养过夜（16–18 h）。

3. 准备接种物。

  1. 准备一个含有10 mL无菌TSB的试管。将500 µL过夜培养物转移至该试管中。在37°C下孵育6–8小时，使菌液OD600达到0.6 ± 0.05（即进入对数生长中期）。
  2. 将培养物转移至15 mL离心管中，在2,200 × g条件下离心10分钟，小心倾去上清液。
  3. 加入5 mL PBS，于2,200 × g离心10分钟。重复此步骤3次。
  4. 使用移液器滴加PBS溶液，将细胞悬液的OD600调整至0.6 ± 0.05。准确记录所加入的PBS体积，以供后续实验使用。

4. 将培养基转移至微孔板读数仪

  1. 选择一个透明、无菌、平底并带盖的多孔板（例如 96 孔板、6 孔板、12 孔板）。
  2. 在运行本方案前，使用去离子水测量微孔板的光程校正值，具体操作见步骤 1.10。
  3. 根据所选多孔板绘制参考表格，用于在加样前明确样品的位置。例如，为 96 孔板绘制一个 8 × 12 的表格。
    注意：参考表格可避免在孵育和结果采集过程中产生混淆。
  4. 将以下物品放入生物安全柜中：带盖的微孔板、1,000 µL 和 200 µL 移液器、1,000 µL 和 200 µL 吸头、若干冻存管、25 mL 烧杯、培养基以及接种物。
    注意：上述物品应以无菌操作方式转移至生物安全柜中。
  5. 向烧杯中加入 10 mL 培养基。将计算好的接种物体积转移至含有培养基的烧杯中。
    注意：本方案中的接种比例为 1% 和 5%。例如，为达到 5% 和 1% 的接种比例，分别向 9.5 mL 和 9.9 mL 培养基中加入 500 µL 和 100 µL 接种物。
  6. 加入接种物后，轻轻摇动烧杯以获得均匀分布。根据参考表格，使用移液器将 200 µL 接种后的培养基加入指定孔中。选择至少三个孔作为对照孔，每孔加入 200 µL 培养基（不含接种物）。
    注意：确保在参考表格中明确标记对照孔。若在这些孔中观察到任何生长（污染），则应重复实验。
  7. 向边缘孔中加入 200 µL 去离子水，因为这些位置的蒸发速率较高。在将 96 孔板移出安全柜前，轻轻盖上盖子。小心地将 96 孔板放入酶标仪中，避免突然移动。

5. 酶标仪设置

  1. 打开酶标仪，然后使用嵌入式软件创建自定义程序。在任务管理器中，打开程序，选择新建 | 标准程序。打开步骤，并按以下方式调整设置：
    1. 使用设置温度将温度设为30 °C（或目标值）。
    2. 点击孵育开启，然后将梯度设为1 °C。
      注：为避免盖子上冷凝导致数据不可靠，请确保将梯度设为1 °C。
    3. 选择预热选项，以确保微孔板受热均匀。
    4. 打开启动动力学，使用运行时间（例如 12:00:00 或 24:00:00 等）和读数之间的间隔（如 00:30:00 表示 30 分钟，或 01:00:00 表示 1 小时）设置所需的孵育时长。
      注：读取每块 96 孔板大约需要 1 分钟。
    5. 按以下方式设置振荡参数：打开振荡；将振荡模式设为线性；点击连续振荡；并将频率调整为 567 cpm（或任意所需值）。
    6. 按以下方式设置OD 读数参数：点击读取 | 吸光度；选择终点法/动力学法和单色器；将波长设为600 nm；点击验证 | 保存，以适当名称和日期保存为新程序。

6. 记录生长数据

  1. 打开 任务管理器 | 立即阅读。
  2. 选择已保存的实验方案，然后点击 确定 以开始执行该方案。
  3. 保存读数以用于数据分析。

7. 数据分析

  1. 将 OD600 结果（生长数据）导入电子表格格式。在结果部分，点击每个孔的图像选项，以查看最终的生长曲线。
  2. 打开电子表格文件，并根据参考表格重新整理记录的数据。从其他读数中减去空白对照组读数的平均值。
    注意：空白对照组是指零时间点的 OD 读数。在本方案中，计算时采用 OD600 值。如果具备 OD600 与细胞计数之间的校准曲线，则可使用细胞密度进行计算。

8. 生长速率测定

  1. 使用第1.6步中创建的电子表格中的已转移数据。采用以下所述方法及公式（1）来评估生长速率。
    微生物生长速率方程，μ 计算公式。 （1）
    其中 µ 为生长速率，ODi 表示每个时间点的 OD600，ODi-1 表示上一时间点的初始 OD600 值，ti 和 ti-1 表示上述两个时间点之间的时间差（例如，30分钟时间间隔为0.5，1小时时间间隔为1）。
  2. 使用所需的数据分析软件，计算连续五个生长速率的平均值和标准差。请注意，平均值最大且标准差最小的即为最大生长速率（μm）12。

9. 确定空间偏差

注意：酶标仪和微孔板会引入实验结果的偏差。为确保结果的可靠性和可重复性，必须评估在特定酶标仪中所用微孔板的空间偏差。为此，请执行以下步骤：

  1. 重复步骤 1.2–1.6。
  2. 记录数据，并根据步骤 1.7 和步骤 1.8 进行分析，以计算每个孔的生长速率。
  3. 绘制热图，以可视化 96 孔板中生长速率的变化。
  4. 进行统计分析（参见 补充表格），确保各孔之间无显著差异。
    注意：所有孔中必须使用相同类型的细菌和相同的接种量。

10. OD 读数验证与光程校正因子

注意：确定光程校正因子对于验证数据以及确保不同设备间数据的可靠性和有效性至关重要。

  1. 使用步骤 1.2 和步骤 1.3 准备 B. mycoides 的过夜接种物。
  2. 准备三个已灭菌的 50 mL 三角瓶，每个瓶中加入 49.5 mL 新鲜 TSB。在生物安全柜中无菌操作，向每个三角瓶中加入 500 µL 接种物。向一个已灭菌的三角瓶中加入 50 mL 未接种的 TSB，作为对照。
  3. 将三角瓶置于 30 °C、150 rpm 条件下培养。每隔 30 分钟，无菌操作从每个三角瓶中取样，并在分光光度计中测定并记录 OD600 值。
  4. 向一个 25 mL 烧杯中加入 9.9 mL TSB，再向烧杯中加入 100 µL 接种物，轻轻振荡混匀。
  5. 将烧杯中的混合液取 200 µL 加入 96 孔板中选定一列的六个孔中。向其中三个孔中各加入 200 µL 未接种的 TSB 作为对照。在边缘孔中各加入 200 µL 去离子水。
  6. 盖上盖板，轻柔地将 96 孔板转移至酶标仪中。按照步骤 1.5 和步骤 1.6 记录生长数据。
  7. 以酶标仪测得的 OD600 为纵坐标，分光光度计测得的 OD600 为横坐标作图。注意，所得斜率即为两组读数之间的偏移值，称为光程校正因子。
    注意：培养箱和酶标仪的培养步骤应于同一天同时进行。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OD读数验证与光程校正因子
在不同时间点采集B. mycoides培养物的分装样品，并使用微孔板读数仪和分光光度计进行测定（图1A）。此步骤用于验证不同设备间结果的一致性。OD600数据呈相关性但数值不完全一致（图1B）。两者之间呈线性相关，斜率为0.55（95%置信区间[CI]：0.53–0.58，R2 = 0.99），表明两台仪器之间存在恒定的偏移（斜率）。拟合优度检验得出均方根误差（RMSE）和估计标准误差（Sy.x）均为0.01，证实了高度的相关准确性。

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讨论

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酶标仪可获得一致且可重复的生长速率。该技术能最大限度地减少人为误差，并实现高通量取样。由于每个样品所需的培养物量较少，这种方法相较于使用锥形瓶或试管进行细胞计数，具有成本低、吸引力强的优势。酶标仪支持较大的样本量，在保持低成本和低劳动强度的同时，提高了统计效能，进而有助于可靠地计算生长速率。

本文介绍了一种测量和分析生长数据的详细实验方案。该方案已使用B. mycoides和P. tundrea进行验证。这些细菌分离自一个实际规模的饮用水生物滤池，因其具有形成生物膜的能力，使得生长数据的评估更具挑战性。

确定了影响可靠且准确测量的几个重要因素：光程校正、盖子冷凝、接种量、读数间隔和空间偏差（图6）。光程校正是获得准确结果的关键，可自动或事后进行测定和应用。通过与分光光度计交叉校准验证的数据表明，针对特定样品体积、盖子和微孔板类型进行光程校正至关重要。

数据采集过程中盖子产生冷凝...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由自然科学与工程研究理事会（NSERC）/哈利法克斯水务水质与水处理工业研究讲席（资助号：IRCPJ 349838-16）资助。作者团队还感谢Anita Taylor在审阅本文过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
离心机 Eppendorf5810 R
15 mL 离心管 ThermoFisher- Scientific 339650无菌
50 mL 离心管 ThermoFisher- Scientific 339652无菌
一次性接种环，10 µLCole-Parmer UZ-06231-08无菌
250 mL 锥形瓶 Cole-Parmer  UZ-34502-59玻璃 
异丙醇 ThermoFisher- Scientific 396982500≥99.0
磷酸盐缓冲液 Sigma-AldrichP4417
1,000 µL 移液器吸头ThermoFisher- Scientific  UZ-25001-76
10 mL 移液器吸头 ThermoFisher- Scientific UZ-25001-83
200 µL 移液器吸头ThermoFisher- Scientific UZ-25001-85
5 mL 移液器吸头 ThermoFisher- Scientific  UZ-25001-80
1,000 µL 移液器Cole-Parmer UZ-07909-11
10 mL 移液器Cole-Parmer UZ-07909-15
200 µL 移液器Cole-Parmer  UZ-07909-09
5 mL 移液器 Cole-Parmer UZ-07859-30
胰蛋白酶大豆肉汤 Millipore22091适用于微生物学

参考文献

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