利用唾液样本和转座子样本池化技术进行大规模 SARS-CoV-2 检测

摘要

本方案旨在为各高校及其他组织在考虑开展大规模 SARS-CoV-2 检测或制定未来病毒暴发应对准备计划时提供蓝图参考。

摘要

识别并隔离具有传染性的个体，同时对密切接触者进行检疫，对于减缓 COVID-19 的传播至关重要。对无症状携带者开展大规模的监测或筛查检测，不仅能够提供病毒传播的数据，还能在疑似暴发时迅速跟进并检测相关人员。密歇根州立大学的 COVID-19 早期检测项目自 2020 年秋季以来，一直采用大规模的监测或筛查检测方式。本方法充分利用了唾液样本可靠性高、可采集样本量大以及可自行采集的优势，并结合了一种成本效益高、节省试剂的二维混合检测策略。该流程设计灵活，可应对物资短缺情况，检测套件和检测流程中的多个组分均可方便替换。文中所述的 SARS-CoV-2 样本采集与处理流程，也可调整用于可靠检测未来在唾液中表达的其他病毒病原体。通过向高校或其他机构提供这一技术蓝图，可为未来病毒暴发的应急准备计划奠定基础。

引言

由SARS-CoV-2病毒引发的COVID-19大流行至今已导致超过620万人死亡，且每日死亡人数仍在持续上升¹。目前检测SARS-CoV-2的金标准是定量实时逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR），该方法使用特异性引物靶向病毒基因组，如核衣壳蛋白（nucleocapsid）、包膜蛋白（envelope）、刺突蛋白（spike）以及RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）基因²。在大流行初期，SARS-CoV-2检测能力严重不足，原因在于缺乏经过验证的检测试剂、检测组件、临床专业人员，以及无法迅速扩展以满足大流行级别大规模检测需求的基础设施。由于资源短缺，检测机构通常要求提供医生转诊证明方可接受检测。这些限制导致检测审批延迟、鼻咽拭子采样过程不适且排队时间长，以及检测结果等待周期延长。此外，受这些因素制约，检测工作难以覆盖无症状前阶段、症状轻微或无症状的SARS-CoV-2携带者，而这些人群可能在不知情的情况下传播病毒。检测手段难以广泛获取和普及，很可能是导致COVID-19疫情失控传播的重要因素之一。

大规模间隔检测可作为监测或筛查两种形式进行。两者均可用于监控高密度或高风险传播区域的局部阳性率，并可用于支持公共卫生决策。监测检测旨在监控人群中疾病的发病率和流行率，不用于个体诊断³。监测结果通常为去标识化数据，不反馈给参与者；开展监测检测的实验室无需具备临床认证资质，也无需使用经美国食品药品监督管理局（FDA）授权的检测试剂。筛查则允许将结果反馈给个体参与者，但美国的筛查实验室必须持有临床实验室改进修正案（CLIA）证书，并满足所有适用的CLIA要求。

密歇根州立大学（MSU）早期检测项目始于2020年9月，已处理超过350,000份样本。该项目源于一个研究团队致力于设计一种高灵敏度SARS-CoV-2检测方法的努力，该方法无需依赖高需求的检测耗材^4,5,6,7,8。项目目标是帮助临床实验室提升检测能力，开发灵活流程以应对物资短缺，同时制定筛查策略，为密歇根州立大学人类医学学院恢复工作提供支持。初期工作重点在于探索SARS-CoV-2的替代采样、提取和定量方法。由于鼻咽拭子需求量大且随后出现短缺，研究评估了使用口腔拭子采集前鼻孔样本的方法；试剂短缺则促使研究人员开发了一种基于中国武汉早期报告改良的样本提取方法⁹。为了提高在前鼻孔样本中检测SARS-CoV-2的灵敏度，采用微滴数字PCR替代了RT-qPCR^6,7。尽管微滴数字PCR灵敏度高，并可通过终点读数提供绝对定量结果，但由于缺乏可靠的高通量仪器支持，该技术被认定不适用于大规模检测。此外，基于人源RNase P水平评估的前鼻孔样本自采样结果变异极大，表明其在大规模检测中可靠性不足。

唾液采集是鼻咽拭子和前鼻孔拭子之外的一种替代方法。历史上，SARS-CoV、H1N1 和 MERS 等呼吸道病毒均已在唾液中被检测到^10,11,12,13。随后的研究也证实 SARS-CoV-2 同样可在唾液中检出^14,15,16,17。唾液样本与鼻咽样本的直接比较显示，在配对样本中，唾液中的病毒滴度高于鼻咽拭子，且重复采样时唾液样本的变异程度更小¹⁴。此外，有报道指出，与 Delta 变体相比，唾液检测对某些变异株（如 Omicron）具有更高的敏感性¹⁶。唾液采集的额外优势包括：可在非现场由受试者自行采集，操作简便且无需大量高需求耗材；在需要时可对样本进行多次重复检测；无需配备现场采样人员；避免受试者排队聚集，从而降低病毒传播风险。该实验室组装的唾液采集套件由实验室检测方法开发者、包装学专家、高校品牌专家、安全官员以及负责生产包装盒和标签系统的外部制造合作伙伴共同协作开发完成。

尽管唾液样本提供了充足的遗传起始材料，且RT-qPCR技术具有高灵敏度和可靠的结果，但试剂（引物/探针和预混液）的成本使得对单个样本进行大规模检测在单样本基础上变得十分昂贵。由于引物/探针和预混液是该过程中最昂贵的组成部分，因此目标是寻找能够延长其使用次数的解决方案，从而降低每个样本的检测成本。已有研究提出，可根据社区中的感染率和检测方法的灵敏度，系统性地优化样本池的大小，用于SARS-CoV-2检测¹⁸。然而，当任意大小的样本池检测出SARS-CoV-2存在时，池中所有个体都必须重新单独检测，这将导致时间浪费，并增加病毒传播的风险。为克服这些局限性，本研究采用了一种二维样本池方法，类似于Zilinskas等人¹⁹提出的策略，在监测检测的严格限制下进行初步筛查。该方法将96个独立样本置于一个包含12列和8行的96孔板中。每个样本分别被纳入两个不同的反应板中的一个8样本池和一个12样本池。这样，每个样本都由两个唯一的池组合唯一标识。通过分析池的坐标信息进行去卷积，可识别出潜在阳性的样本。对于检测未发现SARS-CoV-2的样本池中的样本，无需从监测检测转入筛查流程。而监测过程中检测结果为阳性的个体样本，则需通过经CLIA认证的筛查流程重新提取核酸。若确认为阳性，将向个体通报结果，转诊至校医院医生办公室，启动接触者追踪，并通知卫生部门。总体而言，一个个体的样本在被判定为阳性前需经历三次独立检测：两次在监测池中，一次作为单独的确证性筛查，从而显著降低假阳性的可能性。与单独检测每个样本相比，样本池技术可节省约80%的试剂，使每份样本的检测成本降至约12美元。

除了唾液采样套件、样本混合策略和检测方法的开发流程外，该团队还制定了关于套件分发、样本收集和结果报告的物流计划。项目参与者领取采样套件后，需注册采样管上的唯一字母数字编码，完成采样并将其投入众多指定回收箱之一；这些样本每天由专人收集并运送至实验室。实验室对样本进行处理，技术主管审核并上传检测结果，随后通知参与者登录结果查询平台查看。该流程从样本投递到出具结果的周转时间为24至48小时。机构各个部门的通力协作，是成功大规模实施这一结合监测与筛查的混合策略的关键。下述检测项目及相关基础设施的操作流程与说明，旨在为未来扩大检测规模以满足监测和/或筛查需求提供可借鉴的实施蓝图。

方案

为优化早期检测项目方法而开展的研究已获得密歇根州立大学机构审查委员会的批准。所有图示均使用模拟样本重现，代表所观察到的人类实验结果。本文稿中展示的任何数据、信息或结果均不来自密歇根州立大学早期检测项目的参与者。

1. 试剂盒生产

注意：在组装试剂盒期间，必须始终佩戴口罩、手套、护目镜和实验服，以防止试剂盒组分受到污染。

1. 试剂盒组件的准备
   1. 使用永久性记号笔，在25 mL锥形管上标记出1 mL刻度线。使用永久性记号笔，在移液管上也标记出1 mL刻度线。
   2. 向5 mL样品管中加入四颗陶瓷珠。用移液器吸取1 mL RNA稳定液加入样品管中，并盖紧管盖。将含有唯一识别码的哑铃形标签贴在样品管上，标签顶部为数据矩阵条形码，侧面以字母数字形式重复标注识别码。
      注：陶瓷珠为RNase/DNase-free，无需进一步灭菌。
2. 将一个25 mL锥形管、一个5 mL样品管、一根移液管和一个小的生物危害袋放入试剂盒中（补充图1）。
   ​注：锥形管无需为DNase/RNase-free，样品的完整性由RNA稳定液来维持。

2. 自采样套件的使用方法

1. 根据试剂盒说明书，要求参与者在采集样本前 30 分钟内不要进食或饮水。请参与者向 25 mL 锥形管中吐唾液，直至收集到 1 mL 唾液（至标记线处）。
2. 使用移液器将 1 mL 唾液（至标记线）转移至含有 RNA 稳定溶液和陶瓷珠的 5 mL 样本管中。盖紧管盖并振荡 15 秒。
3. 请参与者在指定网站上注册分配给样本的字母数字编码。完成后，请他们将样本管放入小型生物危害袋中，并投入收集箱内。

3. RNA 提取的样品采集与制备

注意：所有步骤均须在生物安全柜或带有生物密闭盖的离心机桶内进行。

1. 仍在生物危害袋中时，对样本进行消毒并目视检查以进行质量控制。
2. 如果出现以下情况，则拒收样本（图1）：样本颜色非自然（例如绿色、蓝色）或含有食物残渣或血液；样本泄漏或珠子缺失；样本预期体积不正确（<1.5 mL 或 >3 mL）；样本未附条形码或字母数字编码。
   1. 若样本被拒收，需扫描并记录该样本至拒收文件中，并注明拒收原因。若因无标识符而拒收，则在拒收文件中将该样本登记为“无条形码”。
3. 若样本未被拒收，使用剪刀剪开生物危害袋，取出样本管。将样本管涡旋振荡15秒，然后放入摆动桶式离心机的试管适配器中。
4. 当试管适配器装满后，将生物密闭盖固定在离心桶上，并转移至离心机。以4,100 × g 离心2分钟，随后将样本返回至生物安全柜。
   注：离心用于沉淀碎片，并使唾液中较黏稠的物质沉降至管底。此步骤可省去蛋白酶K的使用。一次完整的运行包含768个样本（RNA提取后填满八个96孔板）。
5. 在不扰动沉淀物的前提下，将样本管转移至已预先标记运行编号（Run ID）的96孔管架中，运行编号包括架号（1–8）、日期以及样本将被合并/检测的对应组别（用于标识组别的代码，例如A组为当天第一个运行批次）。
6. 当96孔管架装满或无剩余样本时，使用手持式条形码扫描仪将各管扫描录入板图文件（补充文件1用于全量合并样本；补充文件2用于半量合并样本）。若条形码无法识别，可使用管上的字母数字编码进行手动记录。
   注：扫描时需使用遮挡板以防止误扫相邻条形码。遮挡板可通过在不透明纸上打孔后覆膜制成。录入板图文件中的条形码顺序应与96孔管架中的排列方向一致。
7. 用70%乙醇喷洒管架中的样本管，并用纸巾轻拍干燥。
   注：擦拭而非轻拍可能损坏条形码。
8. 使用运行编号标记一个容量为2 mL的96深孔板。从每个样本管中转移200 µL唾液样本至96深孔板的对应孔中。若样本过于黏稠难以转移，可再次涡旋振荡并离心。若问题仍存在，则拒收该样本。
   注：若操作人员不够谨慎，唾液样本可能呈丝状，在转移过程中于板面留下类似蜗牛爬行的痕迹。这可能导致初筛假阳性结果，从而在后续确认步骤中需要重新检测更多样本（见第6节）。
9. 所有样本转移完成后，用硅胶垫密封96深孔板，并在室温下保存。将剩余样本所在的96孔管架保存备用，用于潜在阳性样本的确认。
   ​注：本方案可在此处暂停。

4. RNA 提取

1. 用运行编号标记一个96孔RNA提取柱，并将其放置在一个空的收集板上方。
   注意：此时含有样本的板可以从生物安全柜中取出。
2. 从96深孔板上移除硅胶垫。向96深孔板的每个孔中加入400 µL病毒上样缓冲液。
3. 通过轻柔地吹打2至4次混匀每个样本，并将全部样本转移至96孔RNA提取柱中对应的孔位。
   注意：大体积混匀可能产生气泡，若操作不当可能导致邻近孔之间的交叉污染。有目的地进行混匀可降低此类风险，保护下游处理过程的完整性。
4. 将RNA提取柱置于收集板上方，在4,100 × g 条件下离心10分钟，使样本加载到提取柱上。随后将RNA提取柱转移至一个新的洁净收集板上。
5. 向RNA提取柱的每个孔中加入500 µL洗涤缓冲液，在4,100 × g 条件下离心5分钟。将RNA提取柱转移至一个新的洁净收集板上。
6. 向RNA提取柱的每个孔中再次加入500 µL洗涤缓冲液，在4,100 × g 条件下离心5分钟。将RNA提取柱转移至一个新的洁净收集板上。
7. 向RNA提取柱的每个孔中加入500 µL 100%乙醇，在4,100 × g 条件下离心5分钟。将RNA提取柱转移至一个新的洁净收集板上。
   注意：如果此时样本尚未完全通过提取柱，则样本可能过于黏稠，或样本中存在微小碎片堵塞了柱子。必须将该样本彻底从提取柱中移除，以避免污染后续的样本合并过程，并将该样本编号添加至拒收文件中。
8. 将RNA提取柱置于收集板上方，在4,100 × g 条件下离心5分钟以干燥柱子。将RNA提取柱转移至一个已标记运行编号和“行”字样的预冷洗脱板上，然后将两者一同放置于一个新的洁净收集板上方。
9. 向RNA提取柱的每个孔中加入25 µL无DNase/RNase的分子生物学级水。在4,100 × g 条件下离心10分钟以洗脱RNA。如果样本未完全洗脱，可再离心5分钟。
10. 将洗脱板转移至预冷的低温板上并盖好。立即进行样本合并及RT-qPCR分析。

5. 样本混合与逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

注意：该流程采用双板系统（如图2所示）。洗脱RNA板的板号对应于生成的列板板号以及行板的行字母（A = 1，B = 2，C = 3，依此类推）。出于解卷积目的，列板的行字母将对应RNA洗脱板的行字母，而行板的列编号将对应RNA洗脱板的列编号。例如，RNA板第6号中位置为C4的样本，将在行反应板中的F4位置以及列反应板中的C6位置找到。

1. 用运行编号（Run ID）和“行”字标记一个新的洗脱板，并将其置于预冷的冷板上。将行洗脱板中每个孔的 10 µL RNA 转移至列洗脱板的对应行中，从而制备原始洗脱板的一个复本（图2).
   注意：标记为“列”（column）的洗脱板将按列方向合并，标记为“行”（row）的洗脱板将按行方向合并。
2. 对于列合并板，将每孔中的全部液体转移至与运行编号（Run ID）板编号相对应的列编号中。对于行合并板，将每孔中的全部液体沿板的纵向向上或向下转移至与运行编号（Run ID）板编号相对应的行编号中（1 = A，2 = B，依此类推； 图2).
3. 将每份混合样品各13 µL转移至96孔反应板中对应的列或行图2).
4. 本方案中，使用针对核衣壳（N）、ORF1ab 和刺突（S）基因的三种探针检测 SARS-CoV-2，并使用第四种引物探针靶向 MS2 噬菌体作为内参对照。在混合样本中，将 MS2 噬菌体阳性对照加入主反应混合液中；在单独检测的样本中，将 MS2 噬菌体加入 RNA 分离柱中的样本内，作为提取对照。
   注意：主混合液、引物探针、荧光染料和淬灭剂会因检测方法的不同而有所差异。各实验室应自行确定合适的比例和荧光通道。
5. 制备 通过向反应板上的阳性对照孔中加入 2 µL 阳性对照溶液和 11 µL 无 DNase/RNase 的分子生物学级水，设置阳性对照图2).
6. 在反应板的阴性对照孔中加入13 µL无DNase/RNase的分子生物学级水，制备无模板对照。
7. 根据制造商说明书配制主混合液，并加入MS2噬菌体阳性对照。将7 µL主混合液加入含有样本或对照的96孔反应板的每个孔中。避免暴露于荧光光源。
8. 用光学膜覆盖反应板，涡旋振荡2分钟以充分混匀样品。将反应板在650 x g条件下离心 g 5 分钟。
9. 将培养板转移至RT-PCR系统中，并根据所用预混液的推荐循环参数运行。本实验所用预混液的循环条件如下：25 °C 2 min，53 °C 10 min，95 °C 2 min，随后进行40个循环：95 °C 3 s，60 °C 30 s。
10. 样品运行完毕后，通过人工对混合样本进行去卷积分析，以鉴定潜在的阳性样本图3）和 通过 一个 R 脚本 Shiny 应用程序。
    1. 将列和行反应板的实验结果导出为电子表格文件。打开池解卷积 R 脚本 Shiny 应用程序（源代码可从以下网址获取：https://github.com/kochman1/JoVE-MSU-COVID-EDP）。
    2. 将平板图谱、列和行文件拖放到应用程序中并运行。保存应用程序生成的列表。
       ​注意：应用程序生成的列表包含输入到板图中的所有条形码，以及根据池去卷积脚本判断其可能为阳性或阴性的情况。被标记为潜在阳性的样本将进行单独重新处理。

6. 阳性样本的验证

1. 为每个待检测样本标记两个1.5 mL微量离心管和一个RNA提取柱。其中一个微量离心管用于混合样本、MS2噬菌体和病毒上样缓冲液，另一个微量离心管用于RNA洗脱步骤。
2. 向1.5 mL微量离心管中加入5 µL MS2噬菌体RNA。转移200 µL潜在阳性样本至该管中，并加入400 µL病毒上样缓冲液，用移液器吹打混匀。
3. 将全部混合物转移至已预先标记的RNA提取柱中（置于洁净的收集管内），在10,000 × g 条件下离心2分钟。吸除收集管中的穿流液。
4. 向RNA提取柱中加入500 µL洗涤缓冲液，在10,000 × g 条件下离心2分钟。吸除收集管中的穿流液。
5. 再次向RNA提取柱中加入500 µL洗涤缓冲液，在10,000 × g 条件下离心2分钟。吸除收集管中的穿流液。
6. 向RNA提取柱中加入500 µL 100%乙醇，在10,000 × g 条件下离心1分钟。将RNA提取柱转移至新的洁净收集管中，在10,000 × g 条件下再离心1分钟以干燥柱膜。
7. 将RNA提取柱转移至预先标记的1.5 mL微量离心管（用于洗脱）。向RNA提取柱中加入25 µL无DNase/RNase的分子生物学级水，在10,000 × g 条件下离心2分钟以收集RNA，并将收集管立即置于湿冰上。
8. 根据试剂盒说明书配制主混合液。将7 µL主混合液加入96孔反应板的每个待测样本孔中。向各反应孔中加入13 µL已提取的RNA。
   注：此处使用的主混合液与混合样本方案中所用相同，但不包含MS2噬菌体RNA加标物。
9. 在反应板的阳性对照孔中加入2 µL阳性对照溶液和11 µL无DNase/RNase的分子生物学级水，以制备阳性对照。在阴性对照孔中加入13 µL无DNase/RNase的分子生物学级水，以制备无模板对照。
10. 用光学封膜覆盖反应板，涡旋振荡2分钟以充分混匀样本。在650 × g 条件下离心5分钟。将反应板放入RT-PCR仪中，并根据主混合液的要求设置相应的扩增循环参数。
    1. 对于本方案所述主混合液，采用以下程序：25 °C孵育2分钟，53 °C孵育10分钟，95 °C预变性2分钟，随后进行40个循环（95 °C变性3秒，60 °C退火延伸30秒）。

结果

迄今为止，实验室接收的绝大多数样本均已通过初步的视觉质量控制并被接受。仅在可能对样本处理和/或整体检测结果产生负面影响的情况下，才需要拒收样本。具体拒收原因包括：试管中样本体积不正确、样本性状或颜色不符合唾液的自然特征、缺少用于辅助样本均质化的陶瓷珠，以及条形码缺失（图1）。

还考察了样本在收集箱中暴露于户外环境因素下的情况。所选用的RNA稳定溶液经受了长时间高温和反复冻融循环的测试。在无RNase条件下，人工制备的SARS-CoV-2 RNA样本暴露于不同温度后进行RT-qPCR处理。在RNA稳定溶液中，37 °C保存1周的样本相较于室温、4 °C或-20 °C保存的样本，Ct值高出1–3个单位，具体差异取决于所检测的探针（补充图2）。相比之下，在无DNase/RNase的水中的人工RNA样本，其Ct值可比在室温、4 °C或-20 °C水中保存的样本高出多达5个单位，且比RNA稳定溶液中的样本高出近8个Ct值。为评估冻融对样本的影响，将人工SARS-CoV-2 RNA样本立即处理，或经历...

讨论

在样本处理过程中，有一些步骤需要特别注意。初始质量控制步骤至关重要，该步骤需检查样本体积、性状、颜色以及是否存在添加的珠子，这对整个流程的成功具有决定性作用。若样本管中唾液量不足，可能导致假阴性结果，因为唾液过少会导致遗传物质不足；相反，唾液过多则会与RNA缓冲液的比例失衡，可能导致RNA降解。在极少数情况下，个体生物危害袋中可能出现液体，表明样本管未正确封闭，样本发生泄漏。此类样本需进入拒收流程，以避免因管体操作而引发潜在的交叉污染。样本异常的性状和颜色也可能预示存在问题。食物残渣或颜色非自然的样本提示受试者可能在采集前摄入了食物或饮料。这可能导致假阴性结果，原因可能是口腔冲洗后唾液中信号过低，或引入了可能降解RNA或干扰RNA提取的物质。黏稠样本可能无法顺利通过RNA提取所用的柱子，从而可能导致假阴性。血液、组织或痰液样本中的黏液等物质也可能影响RNA提取，阻碍样本通过层析柱。与黏稠样本相关的另一个问题出现在样本转移过程中。在向深孔板转移时，黏稠样本可能部分黏附在移液枪头表面，并在板上拖曳，形成类似蜗牛爬行的痕迹，导致板上其他孔被污染。为防止此情况，需对全部唾液样本进行离心，以沉淀可能堵塞层析柱的微小碎片，并使较黏稠的成分沉降至管底...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一步法 MM，无 ROX	Thermo Fisher	A28523
1.2 ml 深孔板	Fisher	AB0564
100 mL 试剂储液槽	Corning	4872
2.8 mm 陶瓷珠	OMNI	19-646
25 ml 带螺帽锥形管	VWR	76338-496
50 mL V 底储液槽	Costar	4870
5430 高速离心机	Eppendorf	22620601
5 ml Eppendorf 管	Fisher	14282300
QuantStudio 用 8 联管	life technologies	4316567
β-巯基乙醇	Fisher	AC125472500
200 证明级乙醇，分子生物学级别	Fisher	BP28184
带条形码的 Microamp Endura 光学 96 孔快速透明反应板	life technologies	4483485
Microamp 快速光学 96 孔板	Fisher	4346906
微型微量离心机	Corning Medical	6770
联管用光学盖帽	life technologies	AB-1820
光学膜	Thermo Fisher	4311971
PCR 板封膜，非光学	Fisher	AB-0558
半裙边 PCR 板	Fisher	14230244
QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统，96 孔，0.1 mL	Thermo Fisher	A28136
Quick RNA 病毒检测试剂盒验证	Zymo	R1035
100 ml 试剂储液槽	DOT	229298
RNA 保护剂	Zymo	R1200-1L
小型生物危害袋	Fisher	180000
Taqpath RTPCR 新冠病毒检测试剂盒	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus 离心机	Thermo Fisher	75009525
移液吸头	Fisher	22170404
病毒 96 检测试剂盒	Zymo	R1041
涡旋混合器	Fisher	2215414