使用多通道薄膜电极记录小鼠视觉诱发电位的地形脑电图

摘要

本方案描述了一种利用32通道薄膜电极在小鼠中获取和分析颅顶视觉诱发电位地形图的简单方法。

摘要

视觉诱发电位（VEP）可用于表征临床前小鼠模型中的视觉功能。目前存在多种用于测量小鼠VEP的方法，包括非侵入性脑电图（EEG）、皮下单电极、皮层脑电图（ECoG）以及完全侵入性的多通道皮层内视觉皮层记录。在急性实验条件下，进行局部皮层内微电极测量之前，获取视觉反应的全局性、地形图式的脑电图水平表征可能是有益的。例如，一种应用场景是 在研究耳聋模型对局部皮层内水平的影响之前，先评估VEP地形图中的全局跨模态变化。多通道颅外脑电图（EEG）是一种可靠的方法，可用于获取皮层视觉活动的总体测量结果。 多通道颅外EEG通过标准化且一致的方法提供可比结果，可用于识别皮层视觉功能中的跨模态、病理或与年龄相关的变化。本研究介绍了一种在麻醉小鼠中使用32通道薄膜EEG电极阵列获取闪光刺激诱发VEP地形分布的方法。结合时域和频域分析，该方法可快速表征和筛选小鼠皮层视觉功能的地形分布及基本视觉特性，并可与多种急性实验条件相结合。

引言

小鼠是研究视觉退行性过程及眼科疾病的临床前模型^1,2,3,4。视觉诱发电位（VEPs）常用于评估皮层视觉功能，例如用于评价病理模型中的视觉退化情况^5,6。视觉诱发电位的潜伏期、传导时间、振幅、多焦特征或皮层空间分辨力可提供有关视觉系统功能完整性的诊断信息^7,8,9。

在小鼠中，皮层视觉诱发电位可以通过不同复杂程度的方法在多种空间尺度上进行测量，这些方法包括非侵入性脑电图（EEG）、皮下针电极、颅骨植入螺钉，以及完全侵入性的颅内方法，如硬膜外皮层脑电图（ECoG）和皮层内电极记录^{10,11,12,13,14,15,16,17}。这些方法各有优缺点。例如，电极数量较少只能提供有限的皮层VEP分布信息，而皮下针电极通常难以保证记录位置的一致性。此外，植入螺钉或完全侵入性方法需要损伤、穿透或移除颅骨，且通常仅能提供局部信息。

在急性实验中，通常首先需要对皮层视觉功能进行初步的整体评估，随后再进行进一步的实验步骤，并与局部皮层内记录结果进行比较。 例如，一种可能的应用是首先研究耳聋或听力损失引起的视觉跨模态重组对视觉诱发电位（VEP）地形图及皮层视觉活动的脑电图（EEG）水平影响^18,19，然后再探讨其在局部皮层内的影响。

使用薄膜多电极阵列进行多通道脑电图记录，可从鼠颅骨获得系统化的视觉诱发电位（VEP）拓扑图^{20,21,22,23,24}。此类颅外记录相较于皮层脑电图（ECoG）记录具有优势，因其可保持颅骨完整性，避免对皮层表面进行直接操作。此外，薄膜多电极提供了标准化的电极配置，使得不同实验间视觉诱发电活动的时空脑活动比较成为可能，类似于人类中标准化的脑电图系统²⁵。标准化框架还有助于使用常见的脑电图分析工具箱（如 Fieldtrip、Chronux、EEGLAB 和 ERPLAB）对小鼠脑电图在时域、频域或功能连接方面进行分析^{26,27,28,29,30,31}。

本方案描述了使用32通道薄膜电极在小鼠中进行地形视觉诱发电位（VEP）记录的实验步骤。该方法可用于急性实验，并可进一步结合其他实验操作，例如对特定脑区进行皮层内微电极记录。本文演示了如何利用32通道薄膜电极从小鼠颅骨表面可靠地记录闪光诱发的视觉诱发电位（VEP）。此外， 还展示了在时域和频域中对地形视觉诱发电位记录数据进行分析的示例。 

方案

所有动物的饲养和管理均遵循德国（TierSchG, BGBl. I S. 1206, 1313）和欧洲联盟（ETS 123；指令 2010/63/EU）关于动物研究的指导原则。动物实验经德国州级主管部门（下萨克森州消费者保护与食品安全局，LAVES）批准，并由大学动物福利官员进行监督。本研究使用一只3月龄雄性C57BL/6J小鼠。

1. 动物详细信息

1. 根据特定的研究问题，在小鼠中进行适当的视觉诱发电位（VEP）测量。
2. 注意小鼠品系在生理学上的特殊性，这些特性可能因麻醉敏感性、癫痫易感性、年龄或遗传背景的差异而影响实验结果。
   ​注意：具有不同遗传背景的小鼠品系常会发展出其他感觉功能障碍（例如，C57BL/6 小鼠的进行性听力丧失），这些障碍可能不易被察觉，但会间接影响视觉处理（例如，跨模态影响¹⁹）。

2. 全身麻醉的诱导

1. 在记录部位准备手术区域。测定小鼠术前体重。
2. 腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪诱导麻醉，剂量为氯胺酮盐酸盐 100 mg/kg、赛拉嗪盐酸盐 4 mg/kg 和卡洛芬 5 mg/kg（参见 材料表）。
3. 注射后立即将小鼠放回笼中。
4. 将红外加热灯（参见 材料表）置于适当距离，并 等待全身麻醉完全诱导至少 5 分钟。
5. 观察自发运动停止及翻正反射消失情况。检查趾夹反射是否消失。

3. 全身麻醉期间的生理监测与维持

1. 将小鼠转移至记录位置，并放置在加热垫上。
2. 使用连接至温度控制系统中的直肠温度探针，维持小鼠核心体温在 37.6–37.8 °C。
3. 确保小鼠处于最佳体温状态。除使用加热垫外，必要时可通过提高室温以减少热量散失。
4. 将两根皮下银丝电极（直径 0.2 mm，参见材料表）分别置于右肩附近和左后肢，用于心电图（ECG）监测。
5. 将银丝心电图电极连接至心电放大器。
6. 实验过程中在示波器上监测心率和心电图波形（参见材料表）。
   注意：在适当的氯胺酮/赛拉嗪麻醉状态下，心率范围通常为 160–250 次/分钟^32,33。心率可能因小鼠品系、年龄及生理状态不同而有所变化。
7. 检查脚趾夹捏反射及生命体征。若无脚趾夹捏反射反应，则表明麻醉深度足够。
8. 在操作过程中密切观察眼睛的状态和状况，并使用眼科滴眼液或眼用凝胶。
9. 通过定期检查生理参数、心率、反射及脑电活动来评估麻醉深度是否充分。
10. 若全身麻醉深度过浅，可追加一次氯胺酮/赛拉嗪剂量（腹腔注射）。
11. 应尽快完成实验步骤，以尽量缩短全身麻醉持续时间，并减少为维持麻醉而需追加的氯胺酮/赛拉嗪使用次数。

4. 电极放置与记录装置设置

1. 在记录位点，通过检查足趾夹捏反射重新评估麻醉深度是否足够。
2. 使用电动剃须刀剃除头部顶部的毛发。
3. 为获得自由的视野，在实验过程中不要将小鼠固定在立体定位仪框架中。
4. 局部注射利多卡因（若根据您所在机构的动物护理指南有额外要求）。
5. 沿中线做一道长约1 cm的头皮切口。
6. 使用小血管钳将皮肤向两侧牵拉并固定，以暴露颅骨。
7. 用棉签蘸取生理盐水（0.9% NaCl）清洁颅骨表面。
8. 将银丝参考电极（直径0.2 mm）皮下植入鼻部上方（鼻部参考）或耳后（乳突参考），用于脑电图（EEG）记录。 
9. 通过探头连接器将鼻部参考电极连接至前置放大器（见材料表）的参考输出端。
10. 接下来，使用连接在前置放大器上的适配器（通过探头连接器连接）和电极夹持器，将脑电图电极连接至前置放大器（见材料表）。
11. 将多通道薄膜脑电图电极（见材料表）放置于颅骨上，以前囟（bregma）作为参考位置，以确保每次实验中电极位置标准化。
12. 滴加一滴生理盐水以调整电极位置。在颅骨表面仍湿润时，电极易于移动。随后，用棉签小心擦干颅骨表面。 
13. 等待生理盐水完全干燥，使电极牢固附着于颅骨。
14. 在电极上覆盖少量硅油，防止电极与上方皮肤粘连。此步骤有助于记录结束后轻松移除电极。
    注意：注意不要使用过多硅油，以免影响电极与颅骨之间的接触。
15. 将皮肤切口覆盖于电极上方，以提供保护并减少电噪声干扰。
16. 在皮肤上滴加少量组织粘合剂（见材料表），防止切口重新裂开。

5. 脑电图记录与视觉诱发电位测量

1. 在采集过程中使用1-9000 Hz范围的宽频滤波器对脑电图（EEG）信号进行滤波。采用宽频滤波设置以控制伪迹。在后续离线处理阶段再进行噪声去除和适当的滤波。
2. 通过检查高频电噪声、50/60 Hz干扰及心电图（ECG）伪迹来评估正在进行的EEG活动的信号质量。确保动物和设备具有适当的接地和参考电极连接，或采取适当的屏蔽措施。
3. 通过观察EEG活动来评估麻醉深度。应避免出现“过深”麻醉状态，该状态以爆发-抑制型EEG活动为特征。需考虑实验的时间进程，并确保记录期间麻醉深度不会过浅。
4. 使用LED频闪仪（或其他类型的视觉刺激）产生超短闪光（参见材料表）（图1）。
5. 将频闪仪置于小鼠眼前30 cm处，以实现双眼视觉刺激。
   注意：实验期间，小鼠和频闪仪均放置于黑暗且隔音的屏蔽室内。
6. 在刺激前让小鼠适应黑暗环境5分钟。
7. 通过TTL脉冲触发频闪仪以产生闪光刺激。
   注意：由于频闪仪电压较高，可能会产生刺激伪迹。可通过增加距离或对电极进行屏蔽来减弱该伪迹。
8. 使用由刺激计算机控制的多功能I/O设备（参见材料表）生成硬件TTL触发信号，以触发光源（即频闪仪）。
9. 将TTL信号同时发送至数据采集系统，以提供高精度的刺激起始时间戳。
10. 从LED频闪仪输出与闪光同步的TTL反馈信号，作为刺激起始时间戳的第二重校验，并与记录数据同步保存。
11. 设置刺激频率（例如，刺激间间隔 = 2 s），并设定刺激重复次数（例如，n = 150次重复）。
12. 手动调节频闪仪的强度参数（例如，闪光持续时间为512 µs，光通量固定为3000 lm）。
    注意：具体参数需根据实验设计的具体科学问题进行调整。
13. 启动刺激呈现，使用记录软件（参见材料表）采集EEG信号，并将数据保存至 记录用计算机中。

6. 实验结束、电极取出及电极清洁

1. 如果记录是更长实验方案的一部分，请继续进行后续实验步骤。
2. 实验结束后，根据机构指南对动物实施安乐死^23,34。
3. 小心移除脑电图电极（因为电极可重复使用）。
4. 缓慢施加液体，将电极从颅骨上取下。
   ​注意：电极可能会粘附在颅骨表面；移除过程中应避免损伤铂金接触点。
5. 实验后用等渗氯化钠溶液（0.9%）清洗电极，并将其浸入蛋白质清除剂和消毒液（见材料表）中30分钟。
6. 将电极阵列存放在干燥、受保护的环境中。

7. 视觉诱发电位信号的基本处理：时域与频域

1. 将原始数据文件导入分析软件（参见材料表）。
2. 使用1-100 Hz范围内的零相位巴特沃斯带通滤波器对脑电（EEG）信号进行滤波。
   注意：根据具体的研究问题选择合适的滤波器类型和参数^27,35,36。
3. 将信号下采样至1000 Hz。
4. 将脑电信号分段为多个试验，并对试验进行平均以获得视觉诱发电位，确定N1波峰潜伏期。
   注意：如有必要，可离线进行重参考（例如，公共平均参考、双极导联参考、局部平均"拉普拉斯"参考）²³。
5. 确定感兴趣特定时间点的电压值，并使用分析软件绘制电压分布图。
6. 通过计算所有电极通道的空间标准差来计算全局场功率³⁷。
7. 使用Chronux工具箱计算多锥体时频谱图^28,31。设置带宽积TW = 3，K = 5个锥体，时间窗大小为300 ms，步长为30 ms。

结果

使用多通道脑电图记录视觉诱发电位，可评估小鼠VEP振幅、潜伏期或频率成分的空间分布。图2A展示了使用颅外32通道脑电图从一只3月龄雄性C57BL/6J小鼠记录到的闪光刺激诱发的VEP分布图。最强的视觉诱发放电活动出现在视觉皮层上方的枕部区域。

图2B 显示了闪光刺激前后不同时间点颅骨表面的电压分布。视觉诱发电位（VEP）的N1波幅值在刺激后50 ms时于中央枕区达到最强。随后出现电位反转，并在刺激后300 ms时于枕区和额区出现正向波峰。图1B 中的蝶形图显示，VEP的N1成分峰潜伏期为46 ms，刺激后约300 ms出现正向波峰。

图2C展示了根据所有脑电图（EEG）通道计算得到的全局场功率^37,

讨论

本文介绍了一种使用薄膜电极记录小鼠颅外多通道脑电图（EEG）的方法，以及如何获得视觉诱发电位的一致性拓扑图。在此，我们以双眼前闪光刺激为例进行展示 ，但该方法也可结合其他类型的视觉刺激（例如单眼刺激、空间光栅、局部视野刺激）使用，例如配合更大的显示屏。

实验方案中的一个关键步骤是电极的放置。必须确保电极位置的精确性和一致性，以保证不同实验之间的可比性。重要的是，需要记录电极的位置以便后续比较（例如，手术显微镜图像）。尽管可以使用不同类型和构型的薄膜电极（来自其他供应商），但建议选定一种明确的电极构型，并在后续实验中保持一致，以确保结果的可回溯比较。第二个关键因素是电极与颅骨的良好接触。接触质量会影响电极的阻抗和信号质量⁴⁰。因此，各个电极位点与颅骨的接触情况应尽可能一致，尤其是在分析空间反应分布时尤为重要。如果某个电极通道出现噪声信号（例如，高频成分），必须确认其与颅骨的接触充分，并在实验过程中检测阻抗。然而，当前的视觉诱发电位（VEP）记录在整体信号质量方面具有较强的稳健性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bepanthen 5% Dexpantheol	Bayer		眼用凝胶
Cheetah 软件 5.11	Neuralynx	版本 5.11	用于神经生理信号记录的软件
Digital Lynx SX	Neuralynx	Digital Lynx 16SX	记录系统
ECG 差分放大器	Otoconsult	WDA2 V1.0
电动剃须刀	Aesculap	GT420
电极固定器	TSE Systems	430005-HE
检查灯	Heine	HL 5000	冷光源灯
加热垫 + 温度控制系统	CWE	TC-1000 小鼠型
Histoacryl 0.5 mL	B.Braun		组织粘合剂
红外加热灯	Sanitas	SIL 06
氯胺酮 10%	WDT		盐酸氯胺酮
LED 频闪仪	Monarch	Nova Strobe PBL	视觉刺激
Matlab 2021a	The Mathworks	2021a	刺激控制与数据分析
Moria 血管夹	Fine Science Tools	18320-11
小鼠 EEG 电极	NeuroNexus	H32（网状）	32通道 EEG 电极。厚度：20 μm；长度：8.6 mm；宽度：6.8 mm。铂电极位点：直径 500 μm
小鼠固定架	定制		信息可应要求提供
多功能 I/O 设备	National Instruments	PCIe-6353 配 BNC 2090A	模拟刺激生成、输出与触发
NaCl 0.9%	B.Braun		等渗、无菌、无热原
Neuralynx HS36	Neuralynx	HS-36	前置放大器
Neuronexus 探针连接器	Neuralynx	ADPT-HS36-N2T-32A	电极连接器
示波器	Tektronix	TDS 2014B
Progent 强效清洁剂	Menicon		用于硬性透气性镜片的蛋白质去除与消毒溶液
记录用计算机	HP	HP Z800	记录用计算机
Rimadyl（卡洛芬）	Zoetis		卡洛芬
硅油 M 1000	Carl Roth	4045.1
银丝	Science Products	AG-8W	直径 203 µm；用于 ECG 和参考电极
隔音室	IAC acoustics
立体定位微操作器	TSE Systems	430005-M/P	用于 EEG 电极定位
刺激用计算机	Dell	Dell Precision T5810	刺激用计算机
手术显微镜	Zeiss	Op-Mi Focus
手术胶带	3M	1527-0	1.25 cm × 9.1 m
Thilo-Tears 3 mg/g	Alcon Pharma GmbH		眼用凝胶
凡士林 Lichtenstein	Winthrop		白色凡士林软膏
赛拉嗪 2%	Bernburg		盐酸赛拉嗪
利多卡因喷雾（10 mg/喷）	Aspen		利多卡因