方法文章

用于转录组和表观基因组分析的小鼠白色脂肪细胞的分离与处理

DOI：

10.3791/64128

⸱

2022年6月16日

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1Van Andel Institute, 2Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, 3Department of General and Visceral Surgery, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案总结了一种通用方法，用于分离、纯化小鼠白色脂肪细胞并进行上游处理，适用于后续的总RNA测序、通过超声处理进行细胞核提取（NEXSON）以及ChIP-seq分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥胖是一种受遗传、表观遗传、环境及其相互作用影响的复杂疾病。成熟的脂肪细胞是白色脂肪组织中的主要细胞类型。了解脂肪细胞如何发挥功能以及如何响应（表观）遗传和环境信号，对于揭示肥胖的病因至关重要。以往已通过酶消化法从脂肪细胞中分离出RNA和染色质。此外，已有研究开发了细胞核分离方案，通过荧光激活细胞分选技术（FACS）对脂肪细胞特异性转基因报告系统进行纯化。在这些方案中，实现高产量和高质量的最大挑战之一在于脂肪组织中含有大量脂质。本方案描述了一种优化的成熟脂肪细胞分离流程，利用庚烷将脂质与目标物质（RNA/染色质）分离。所获得的RNA具有高完整性，并能产生高质量的RNA测序结果。同样，该方法提高了细胞核的得率，并在不同样本间产生可重复的ChIP-seq结果。因此，本研究提供了一种可靠且通用的小鼠脂肪细胞分离方案，适用于全基因组转录组和表观基因组研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肥胖通常被认为是一种因脂肪过度积聚而导致的疾病，会增加患2型糖尿病、心脑代谢性疾病以及多种癌症的风险1,2,3。尽管目前对肥胖的理解在很大程度上基于遗传因素（来自人类和啮齿类动物研究），但约30%–70%的代谢性疾病易感性并非源于遗传4,5,6,7,8，且其机制仍不明确。

脂肪组织在肥胖症及其他代谢性疾病中发挥着关键作用9,10。脂肪组织由成熟脂肪细胞以及包括前脂肪细胞、内皮细胞和免疫细胞在内的基质血管组分构成。目前尚不清楚每种细胞类型如何参与肥胖的发生，也不清楚脂肪细胞功能失调如何导致肥胖。因此，建立可重复且高效的成熟脂肪细胞表观基因组研究用分离与纯化方案，是本领域关注的重点。

成熟的脂肪细胞长期以来一直被分离用于基因表达分析11 和表观基因组学研究12,13分离脂肪细胞主要有两种策略。第一种是利用酶消化法将成熟脂肪细胞从基质血管组分中的其他细胞类型中分离出来。11,14第二种方法是通过Dounce匀浆器处理脂肪组织以释放完整的细胞核，随后利用荧光报告基因标记，通过荧光激活细胞分选技术（FACS）回收细胞核。12,13，这需要特殊的转基因报告基因模型。每种情况下的技术难点在于，成熟的脂肪细胞含有高浓度的脂质（图1），这会降低总RNA的质量和/或得率15,16 以及细胞核17在此描述了一种优化的酶消化法，用于分离成熟脂肪细胞，其中庚烷的优势在于能够快速高效地溶解并去除脂质18 在进行RNA提取或通过声波破碎法核提取（NEXSON）进行细胞核分离步骤之前19该方案可确保获得高质量的总RNA，适用于全基因组研究，并显著提高完整细胞核的得率，从而实现可重复的ChIP-seq实验。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，方案编号：18-10-028。对12周龄雄性C57BL/6J小鼠采用CO2安乐死，解剖后收集附睾白色脂肪组织（eWAT）中的脂肪垫。

1. 脂肪细胞的分离

  1. 配制消化缓冲液（表1），并在水浴中预热至 37 °C。
  2. 将附睾白色脂肪组织（eWAT）的脂肪垫置于培养皿中，用镊子和解剖刀在 5 mL DMEM 中将组织切成小块（5 mm × 5 mm）。
    注意：建议使用不含细胞黏附涂层的培养皿。操作时应轻柔夹持脂肪垫，避免损伤细胞。组织处理越频繁，细胞得率越低。与仅使用剪刀或镊子相比，使用解剖刀配合镊子切割脂肪垫更佳，因为后者更容易损伤脂肪细胞。
  3. 倾去多余的 DMEM，注意不要扰动组织碎片。
    注意：不要从培养皿表面挑除组织碎片。
  4. 向培养皿中加入 5 mL 消化缓冲液，轻轻晃动以使组织碎片脱离皿壁，然后将全部内容物倒入一个 50 mL 离心管中。重复此步骤，直至所有组织碎片均转移至离心管。
  5. 向离心管中加入剩余的消化缓冲液，使最终体积约为 20 mL。
  6. 将组织碎片在 37 °C 摇床水浴中以 100 rpm 振荡孵育 20–30 分钟，或直至组织碎片小于 1 mm × 1 mm。
  7. 向离心管中加入 0.4 mL 0.5 M EDTA 和 0.2 mL 0.5 M EGTA，继续在 37 °C 下振荡 10 分钟。
  8. 用 10 mL 移液器将细胞悬液通过细网过滤器（420 µm，见材料表）转移至另一个 50 mL 离心管，以去除未消化的组织。
  9. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，使纯化的脂肪细胞（浮于上层）与基质血管组分（沉淀于底部）分离（图2A）。
  10. 小心将上层漂浮的脂肪细胞层倒入新的 50 mL 管中，注意不要扰动沉淀。
    注意：避免使用移液器吸头转移漂浮的脂肪细胞，因为细胞可能黏附在吸头内壁，从而降低得率。部分消化缓冲液会随脂肪细胞一同转移至新管中；可使用注射器和针头从脂肪细胞层下方吸除残留的消化缓冲液。
  11. 立即使用纯化的脂肪细胞进行总 RNA 提取（步骤 2.）和/或 ChIP-seq（步骤 3. 和步骤 4.）。
    ​注意：用户可根据研究目的决定将全部脂肪细胞提取物用于步骤 2. 或步骤 3.。用户也可将全部脂肪细胞提取物分为两份，平行进行步骤 2. 和步骤 3.，从而获得生物学重复样本的分析结果。

2. 总RNA提取

注意：此步骤需在化学通风橱中进行。

  1. 向50 mL离心管中的纯化脂肪细胞（步骤1.11）加入1 mL RNA提取试剂（见材料表）。
  2. 使用1 mL移液器吸头反复吹打，充分溶解脂肪细胞，并将溶液转移至2 mL微量离心管中。
  3. 室温孵育15分钟。
  4. 向离心管中加入0.5 mL庚烷，涡旋振荡30秒至最大速度。
    注意：脂质将溶解于庚烷中（图2B）。
  5. 在4 °C条件下，以1,000 × g离心10分钟。
  6. 使用注射器和30 G针头吸取下层RNA提取试剂，转移至新的1.5 mL离心管中。
  7. 向RNA提取试剂提取物中加入0.1 mL 1-溴-3-氯丙烷（见材料表），最大速度涡旋振荡30秒，室温孵育15分钟。
  8. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心15分钟。使用移液器收集上层水相，转移至新管中。
  9. 加入0.5 mL异丙醇，在4 °C孵育10分钟。在4 °C条件下，以12,000 × g离心10分钟。
    注意：RNA将作为沉淀物聚集在管底。
  10. 使用移液器小心去除上清液，注意避免触碰沉淀物。
  11. 加入1 mL 75%乙醇，短暂最大速度涡旋振荡。
  12. 在4 °C条件下，以7,500 × g离心5分钟。用移液器吸头小心吸除上清液，切勿扰动沉淀物。
  13. 室温下空气干燥沉淀物10分钟，或直至沉淀物变得透明。
  14. 将沉淀物溶解于50 µL无核酸酶水中。

3. 脂肪细胞的 ChIP-seq 固定

注意：步骤 3. 需在化学通风橱中进行。

  1. 在含有分离脂肪细胞的50 mL离心管（步骤1.11）中加入0.3 mL 0.5 M EDTA、0.2 mL 0.5 M EGTA、14.8 mL DMEM和10 mL 庚烷。
  2. 加入0.7 mL 16%甲醛（终浓度0.7%），在管式旋转仪（见材料表）上以10 rpm速度室温旋转5分钟。
    注意：设置计时器并准确计时5分钟。若处理多个样品，应每隔30秒依次加入甲醛，以确保所有样品的固定时间精确且可比。
  3. 加入1.78 mL 1.25 M甘氨酸（终浓度0.125 M），在旋转仪上以10 rpm速度室温混合不超过5分钟。
    注意：即使加入甘氨酸后，甲醛仍保持活性。因此，在5分钟孵育后必须立即进行离心分离（步骤3.4），以尽快终止反应。若处理多个样品，应每隔30秒依次向各样品中加入甘氨酸，以顺序终止反应。
  4. 随后在室温下以200 × g离心5分钟。
    注意：此时应出现三个明显且分离的液体层（图2C）。中间的白色层含有固定的脂肪细胞。
  5. 使用1 mL移液枪头将脂肪细胞（白色）层转移至新的15 mL离心管中，尽量减少固定液和庚烷带入新管中的量。
  6. 向管中加入10 mL（室温）DMEM，并添加蛋白酶抑制剂混合物（PIC，见材料表）片剂。通过反复倒置充分混匀。
  7. 在室温下以≤200 × g离心5分钟。保持离心力在100 × g，以尽量减少细胞破裂。
  8. 在进入步骤3.9之前，重复步骤3.5–3.7一次。
  9. 使用1 mL移液枪头将脂肪细胞（白色）层转移至1.5 mL或2 mL微量离心管中。
  10. 在室温下以100–200 × g离心5分钟，然后使用1 mL移液枪头去除上层庚烷和下层DMEM。
  11. 将固定的脂肪细胞在−80 °C保存，最长可保存6个月，直至使用。

4. 细胞核提取与染色质剪切

注意：本方案改编自 Arrigoni 等人的研究19。

  1. 开启超声破碎仪（见材料表），将峰值功率设为 75 W，占空比设为 2%，每脉冲周期数设为 200，水浴冷却器温度设为 20 °C。
  2. 向 Farnham 实验室缓冲液和剪切缓冲液中加入蛋白酶抑制剂混合物（PIC）（表 1）。
    注意：更多推荐的超声破碎仪及参数请参见 Arrigoni 等人的研究19。
  3. 用 750–800 µL 冰冷的 Farnham 实验室缓冲液将固定的脂肪细胞（来自步骤 3）重悬于 1 mL 超声破碎管中（见材料表）。
    注意：建议不要将管子完全装满，否则脂肪细胞会浮至管子最上部，从而降低超声破碎效率。
  4. 对样品进行 2.5 分钟的超声破碎。
    注意：在相差显微镜下检查细胞核提取情况，以判断是否需要进一步超声破碎。细胞核应呈圆形且完整，如图 2D所示。
  5. 在继续下一步之前，将超声破碎仪的峰值功率调整为 140 W，占空比调整为 5%，每脉冲周期数为 200，水浴冷却器温度设为 4 °C。
  6. 使用移液器将上清液转移至 1.5 mL 微离心管中，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。
  7. 小心移除上清液，保留沉淀（细胞核）。
  8. 用 1 mL 冰上预冷的 Farnham 实验室缓冲液洗涤沉淀。
  9. 在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，用移液器吸走上清液，保留沉淀。
  10. 在进入步骤 4.11 前，重复步骤 4.8–4.9 一次。
    注意：分离并洗涤后的细胞核可在 −80 °C 保存 3 个月，以备后续使用。
  11. 将分离的细胞核重悬于 1 mL 剪切缓冲液中，并转移至新的 1 mL 超声破碎管中。确保管内无气泡。
  12. 在 4 °C 条件下，使用峰值功率 140 W、占空比 5%、每脉冲周期数 200 的参数对细胞核进行 12 分钟超声破碎，以剪切染色质。
  13. 将裂解液转移至 1.5 mL 微离心管中。
    注意：剪切后的染色质已从细胞核中释放，存在于缓冲液（裂解液）中。
  14. 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟，使不溶性碎片沉淀。将上清液（染色质）转移至新的 1.5 mL 微离心管中。
  15. 剪切后的染色质可在 4 °C 保存 10 天，或在 −80 °C 保存 3 个月，以备后续使用。
    注意： 额外质量检测： 取 25 μL 剪切染色质样品，按照先前发表的方法19进行解交联，并用无 DNase 的 RNase 去除 RNA。在本研究中，所得 DNA 使用 DNA 纯化试剂盒按照制造商说明书进行纯化，使用 DNA 定量试剂盒在 DNA 定量仪器上测定 DNA 浓度，并通过自动电泳仪（见材料表）评估片段大小。剪切染色质的片段大小应在 100–800 bp 范围内。其余剪切染色质可直接用于后续 ChIP-Seq 实验。 

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从六个脂肪垫中分离出脂肪细胞，进行基于庚烷的RNA提取（步骤2），并使用自动化电泳仪器分析所得RNA。所有样本的计算RNA完整性数值（RIN）均>8（图3A），表明RNA制备质量高且具有可重复性。随后使用总RNA制备试剂盒构建RNA文库，并在下一代测序仪上对每个样本进行测序，测序深度达到≥4000万条读长。所有样本的Phred评分（图3B）以及每条序列的Phred评分（图3C）均≥30，表明DNA序列质量高20。因此，去除庚烷有助于获得高产量、高质量的RNA，适用于RNA测序。

在甲醛固定步骤中，同时进行了三个含正庚烷的细胞核分离制备样品和一个不含正庚烷的对照样品。随后使用自动化电泳仪器分析剪切后的染色质。在两种情况下，染色质均被剪切至100–800 bp的片段大小范围（图4A），非常适合后续的ChIP-seq实验19。重要的是，与未处理样品（2.2 ng/µL）相比，经正庚烷处理的样品获得了约5倍更多的染色质（分别为11.5 ng/µL、9.42 ng/µL和9.6 ng/µL）。H3K4me3和H3K27me3的ChIP-seq实验参照Arrigoni等人的方法进行19。如图4B所示，对于这两种组蛋白修饰标记，三个独立的正庚烷处理样品的信号轨迹与未使用正庚烷样品的信号轨迹相当。正庚烷处理不会影响ChIP-seq数据的质量，但显著提高了细胞核（以及剪切后染色质）的得率。

脂肪细胞显微镜图像，细胞核（DAPI），脂质（BODIPY），荧光成像分析，细胞研究。
图 1：分离的脂肪细胞。 分离的脂肪细胞使用 DAPI（蓝色）染色细胞核，BODIPY（绿色）染色脂质。细胞质中的脂滴可占脂肪细胞体积的 95%，这在 RNA 和染色质提取过程中对获得高得率构成了技术挑战。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于RNA提取、固定、染色质剪切和ChIP-seq分析的脂肪细胞分离流程图。
图2：用于转录组和表观基因组分析的脂肪细胞分离示意图。 该图展示了从脂肪细胞分离到转录组或表观基因组应用的完整工作流程。关键步骤和代表性结果均已标出。(A) 分离的脂肪细胞漂浮在上层，而基质血管组分则沉淀于管底形成沉淀物。(B) 在使用RNA提取试剂进行RNA提取前，利用庚烷去除脂质。(C) 脂肪细胞固定过程中使用庚烷去除脂质。(D) 分离的脂肪细胞细胞核应保持完整且呈圆形。比例尺 = 20 µm。该示意图使用BioRender.com绘制。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示RNA完整性及测序质量的电泳图谱结果和质量评分图表。
图3：RNA测序后RNA完整性及质量评分的代表性电泳图谱。（A）样品1-6代表六重复的正庚烷处理脂肪细胞，其RNA完整性分析在自动化电泳仪上进行。RNA完整性数值（RIN）基于18S和28S核糖体RNA的比值，反映RNA质量，评分范围为1（严重降解）至10（最低降解）。（B,C）测序读段的质量评分由multiQC分析确定，（B）显示碱基的平均质量评分，（C）显示每条序列的质量评分。请点击此处查看该图的放大版本。

色谱实验结果；DNA分离图谱；H3K4me3、H3K27me3组蛋白修饰分析。
图4：染色质剪切产物及ChIP-seq富集峰的代表性电泳图谱。（A）来自自动电泳仪的代表性图谱，显示对照组（样本1，左上）和庚烷处理的脂肪细胞染色质样品（样本2、5和8，右上及下方两个）的染色质片段大小分布。最终样品中的染色质浓度标注于各图像的左上方。（B）使用整合基因组浏览器（IGV）生成的浏览器截图。图上半部分显示三个经庚烷处理的样本（红色）和一个对照样本（蓝色）的H3K4me3 ChIP-seq信号谱。下半部分显示H3K27me3 ChIP-seq的相应结果。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液成分
消化缓冲液（用于 3000 mg 或更少脂肪垫 / 20 mL）20 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）
0.3 g 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）
0.1 g 胶原酶 2 型
Farnham 实验室缓冲液5 mM PIPES（pH 8）
85 mM KCl
0.5% IGEPAL
剪切缓冲液10 mM Tris-HCl pH 8
0.1% SDS
1 mM EDTA

表1：本研究中所用不同缓冲液的组成。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所介绍的脂肪细胞分离方案基于广泛认可的酶消化方法11,14 ，用于将成熟脂肪细胞（漂浮部分）与白色脂肪组织中剩余的基质血管组分分离开来。该方法为在任何小鼠模型中纯化成熟脂肪细胞提供了一种简便且通用的途径。如上所述，该方案适用于后续的全转录组和ChIP-seq分析，并能提供足够的产量，从同一个体的单个脂肪垫中生成多个表观基因组谱图（例如，多种组蛋白修饰以及RNA-seq）。

为了获得足以制备此类匹配表观基因组数据的高产量，一个关键步骤是使用庚烷溶解完整脂肪细胞以及在操作过程中裂解的脂肪细胞中的脂质。根据我们的经验，该步骤通过防止RNA和细胞核丢失至脂质层，显著提高了实验的可重复性和产量。对含有正在固定脂肪细胞的离心管进行持续旋转同样至关重要，因为它有助于更均匀地去除脂肪细胞中的脂质。与多数ChIP-seq文献中报道的1%甲醛固定缓冲液21,22不同，我们发现将甲醛浓度降低至0.7%是必要的，以避免过度固定。此外，染色质剪切时间也优化为12分钟，以获得适用于ChIP-seq的理想的染色质片段大小范围（100–800 bp）。

该方案已针对批量转录组和表观基因组研究进行了优化。目前的方案在单细胞转录组和表观基因组应用方面仍存在一定的局限性。鉴于脂肪组织领域已报道的细胞异质性23,24，该分离方法有望进一步改进以适用于单细胞检测。在此类应用中，脂肪细胞特异性标记物，如硼-二吡咯甲川（boron-dipyrromethene, BODIPY）25、perilipin-1（PLIN1）26、ASC-127，或脂肪细胞特异性细胞核标记物，可能有助于定量分析其他具有功能意义的相关细胞参数28。除了基因组学研究外，该方案还可能促进脂肪细胞蛋白质组学研究，后者因脂肪细胞中脂质含量较高而面临额外的技术挑战29。

该方案也可用于成功提取人类脂肪细胞核（数据未显示），从而将其应用扩展到人类肥胖症研究领域。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所（MPI-IE）光学成像、测序和生物信息学核心设施及其工作人员的支持。本工作获得了马克斯·普朗克学会（MPG）、范安德尔研究所、欧盟“地平线2020”研究计划、美国国立卫生研究院（NIH，项目号R01HG012444和R21HG011964）、玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议No 675610，以及德国联邦教育与研究部项目编号01KU1216（德国表观基因组计划，DEEP）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 甲醛溶液（w/v），无甲醇ThermoFisher SCIENTIFIC28908
1-溴-3-氯丙烷 SIGMAB9673
5 M NaClinvitrogenAM9759
自动化电泳仪（2100 Bioanalyzer 仪器）Agilent TechnologiesG2939BA
BODIPY ThermoFisher SCIENTIFICD3922
胶原酶 II 型Worthington Biochemical Corp.43D14184B
完全型无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物（PIC） Roche4693159001无 EDTA
DAPI ThermoFisher SCIENTIFICD1306
DMEM（含 GlutaMAX） life technologies61965-026
DNA 纯化试剂盒（PCR 纯化试剂盒）Qiagen28104
DNA 定量仪器（Qubit 4 荧光计）Fisher SCIENTIFICQ33238
DNA 定量试剂盒（DNA 高灵敏度检测试剂盒）Agilent Technologies5067-4626
EDTAFisher chimicalE478-500
EGTAFisher chimicalO2783-100
EtOHPHARMCO111000200
无脂肪酸 BSA SERVA11932.01牛血清白蛋白 V 组分，无脂肪酸冻干粉
甘氨酸SIGMAG7126-100G
庚烷SIGMAH2198-1L
高灵敏度 RNA 分析试剂Agilent Technologies5067-1513
IgepalSIGMA18896-50ML
KClSIGMAP3911-25G
筛网滤器（420 µm）Tisch ScientificME17238
下一代测序仪（HiSeq 3000 测序仪） Illumina
无核酸酶水 Invitrogen4387936
PIPESACROS organics5625-37-6
蛋白酶 K ThermoFisher SCIENTIFICEO0491
RNA 提取试剂（Trizol）ThermoFisher SCIENTIFIC15596026
无 DNase 的 RNase A ThermoFisher SCIENTIFICEN0531
旋转混合仪（Thermo Scientific Tube Revolver 旋转仪）ThermoFisher SCIENTIFIC88881001
SDS，十二烷基硫酸钠SIGMA8170341000
超声破碎管（1 mL milliTUBE，含 AFA 纤维）Covaris520135
超声破碎仪（Evolution 聚焦超声破碎仪（S220 或 E220））Covaris500217 或 500239
总 RNA 制备试剂盒（Illumina 链特异性总 RNA 制备试剂盒）Illumina20040525
Tris-HCl Fisher bioreagentsBP153-500

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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