方法文章

开发与测试可抑制Src激酶活性的甲基化纳米结构二肽 体外 用于抗癌应用

DOI：

10.3791/64256

⸱

2022年11月30日

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

本文内容

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种设计和测试二肽抑制剂的方案，该二肽可利用无细胞和细胞实验检测其对Src激酶酶活性的抑制作用，以用于抗癌应用。本文所配制的肽（W-RCH3、WCH3-RCH3 和 W-R(CH3)2） 对Src激酶的抑制IC50值分别为510 nM、916 nM和1 µM。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究旨在开发一种新型抗癌治疗方法，设计并采用Fmoc固相肽合成法合成了七种含有甲基化色氨酸和/或甲基化精氨酸的二肽。Src酪氨酸激酶的过表达已被证实与多种癌症的发生发展相关。先前研究表明，含有非天然氨基酸（如甲基化精氨酸（RCH3）、二甲基化精氨酸（R(CH3)2）和/或甲基化色氨酸（WCH3）残基）的二肽能够抑制Src激酶活性。在本研究中，通过无细胞实验测试了其中三种二肽W-RCH3、WCH3-RCH3和W-R(CH3)2，其IC50值（抑制50%活性时的浓度）分别为510 nM、916 nM和1 µM。这些数值与先前研究中合成的环状五至九聚W-R肽（[W-R]5-[W-R]9）所获得的结果相当。然而，未甲基化的二肽则未表现出对Src激酶的任何抑制活性。所有这些二肽（50 µM）在与三种不同癌细胞系——白血病（CCRF-CEM）、乳腺腺癌（MDA-MB-231）和卵巢腺癌（SK-OV-3）细胞——共孵育长达72小时后，均未表现出细胞毒性，表明这些肽穿过细胞膜的通透性有限。因此，为进一步将其应用于抗癌治疗，尚需开展研究以提高这些肽的细胞通透性，例如通过使用肽载体或对肽进行额外的功能化修饰。总之，本研究提供了一套用于合成和测试可抑制Src激酶活性、因而具有潜在抗癌能力的肽的实验方案，并通过无细胞和细胞实验验证了其效果。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

癌症是由正常细胞异常增殖引起的疾病，是全球最致命的疾病之一。这些异常细胞通过一种称为转移的过程扩散到身体的不同器官。最常见的癌症类型是乳腺癌，2020年有226万人患病。此外，2020年约有180万人死于肺癌1。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有1000万人死于癌症2。癌细胞与正常细胞的不同之处在于其会过度表达某些酶，例如蛋白酪氨酸激酶（PTKs）。美国国家癌症研究所将激酶定义为能够磷酸化其他蛋白质或糖类的酶3。了解激酶的调控功能有助于设计有效的抗癌药物。例如，PTKs催化其他蛋白质或糖类的磷酸化反应，导致ATP因失去一个磷酸基团而转化为ADP。所有癌基因和原癌基因中，约有80%编码PTKs4。Src激酶是一类非受体酪氨酸激酶家族，包括Lck、Fyn、Hck、Blk、Yes和Yrk，在癌细胞中尤其是乳腺癌细胞中呈过表达状态5,6。Src酪氨酸激酶与有丝分裂原作用、细胞分化、T细胞活化以及细胞转化相关。由于Src能够降低癌细胞的黏附能力，因而促进癌细胞的侵袭和转移。Src激酶包含五个不同的结构域，从N端到C端依次为：脂肪酸结构域、Src同源3结构域（SH3）、Src同源2结构域（SH2）、酪氨酸激酶结构域（SH1）以及C端调控结构域7。

蛋白质结构域示意图，肽段与SH3、SH2、激酶结构域的相互作用；ATP、底物分析。
图1：Src激酶酶中的靶向结构域，包括SH3结构域、SH2结构域、激酶结构域（SH1）以及一段短的C端调控区段。 请点击此处查看该图的放大版本。

激酶结构域SH1在设计Src激酶抑制剂时最常作为靶点，因为它包含两个保守的ATP和底物结合位点（图1）。如果已知激酶结构域的氨基酸序列，也可将底物作为靶点，设计出模拟底物与Src激酶结合的小分子化合物8此外，其他位点如 SH3 和 SH2 结构域也可作为靶点。与其他化疗药物相比，激酶抑制剂具有更低的毒性和更高的疗效9截至2021年9月，已有73种作为激酶抑制剂的小分子药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准10伊马替尼是一种选择性抑制酪氨酸激酶活性的抗癌药物，但部分患者由于激酶结构域出现点突变而对该药物产生耐药性11阿斯利康发布了saracatinib，这是一种抑制Src家族酪氨酸激酶的药物，其IC50 半数抑制浓度（IC50）为2.7 nM，但在二期临床试验中被弃用12截至2020年初，美国FDA批准的52种蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂13，仅28种靶向受体酪氨酸激酶，11种阻断非受体酪氨酸激酶，11种抑制蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，2种阻断MEK1/213癌症研究领域的日益增长的兴趣将继续推动激酶抑制剂作为潜在抗癌药物的发现。然而，迄今为止，500种蛋白激酶中仅有50种被作为治疗靶点；因此，在不久的将来，预计会有更多激酶被用于药物开发研究。14此外，还需要发现激酶抑制剂，以探索尚未明确的、可导致癌症的激酶突变。

因此，本研究旨在开发可用于抑制Src家族激酶的多肽，并靶向ATP结合位点，因其在不同激酶之间具有保守性。为此，合成了一系列含有甲基化色氨酸和/或甲基化精氨酸的二肽，并检测其协同抑制Src激酶的能力。色氨酸的吲哚环可模拟ATP中的腺嘌呤，与ATP竞争结合ATP结合位点。此外，配体中的甲基化精氨酸可与Src的SH3结构域发生竞争性结合。研究人员发现，含有去甲基化精氨酸的多肽能够抑制SH3结构域，这可能归因于SH3结合基序上存在的特定保守序列（即PXXP），该序列对含有两个或三个N端精氨酸残基或一个至两个C端精氨酸残基的配体具有结合亲和力。15,16,17Arg的胍基与SH3结构域的保守Asp-99残基结合18,19，而精氨酸的其余部分与酶中保守的Trp-118结合，这一结果已通过核磁共振分析及多个SH3结构域的晶体结构得到证实19. 本文介绍了一种合成七种甲基化二肽的方案，并测试了这些二肽对Src激酶的抑制能力。此外，还进一步评估了这些肽对多种癌细胞系的杀伤能力 体外 进行了检测。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 肽的合成

注意：W-R 的合成被描述为一个代表性示例（图 2）。

  1. 根据Mandal等人的方法20，称取566 mg（0.3 mmol）H-Arg(Pbf)-2-氯三苯甲基树脂，并将其加入肽合成反应器中（见材料表）。采用成熟的固相肽合成（SPPS）策略进行肽的合成21。
    注意：含有非天然氨基酸的甲基化或二甲基化二肽在rink酰胺树脂（载样量为0.3 mmol/g）上组装，而含有天然氨基酸的二肽则在已连接第一个氨基酸的树脂上组装，例如H-Arg(Pbf)-2-氯三苯甲基树脂（载样量为0.3 mmol/g）。重要的是，rink酰胺树脂生成的肽在C端以NH2封端。
  2. 在连接至肽合成反应器的氮气压力下，用5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶胀干燥树脂1小时。
    注意：整个合成过程应在通风橱中进行。实验过程中必须佩戴护目镜、手套和实验服。计时器对于控制各试剂添加步骤之间的时间间隔也至关重要。
  3. 在整个合成过程中，使用连接至肽合成反应器的氮气压力去除多余的DMF。
  4. 称取473.9 mg Fmoc-Trp(Boc)-OH（0.9 mmol）和341 mg 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）（0.9 mmol）作为偶联试剂。将粉末加入试管中，并用5 mL无水DMF溶解。
  5. 向试管（步骤1.4）中加入313.4 µL（1.8 mmol）N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）作为活化剂，并通过振荡试管混合均匀。
  6. 将试管内容物加入树脂中，在室温下通入氮气反应1小时。随后用氮气压力排出多余的DMF，并用DMF洗涤树脂3次（每次5 mL）。
  7. 用5 mL含20%哌啶的DMF溶液（v/v）在氮气氛围下处理20分钟，以脱除N端Fmoc保护基。然后用DMF洗涤树脂3次（每次5 mL）。
  8. 加入5 mL二氯甲烷（DCM）使树脂干燥，并在氮气下保持5分钟，随后用氮气压力排出DCM。再在氮气氛围下加入5 mL甲醇处理5分钟，以进一步提高树脂干燥程度。
  9. 加入10 mL新配制的裂解混合液（TFA/硫代苯甲醚/二硫苏糖醇/苯甲醚，体积比/体积比/重量比/体积比为90:3:5:2），反应2.5小时，以完全脱除所有侧链保护基并将二肽从树脂上裂解下来。
    警告：裂解混合液应使用玻璃量筒加入，因TFA具有强酸性和危险性；操作时需格外小心。
  10. 2.5小时后，通过氮气压力将反应液从肽合成反应器排入圆底烧瓶中。向含有粗肽的圆底烧瓶中加入250 mL冷的乙醚（Et2O），使肽沉淀析出。
  11. 使用带侧臂的锥形漏斗（侧臂连接水源，利用水压进行抽滤）和滤纸过滤析出的肽，收集沉淀物（即肽），以彻底去除乙醚。粗肽通常在10分钟内完成沉淀。
  12. 使用梯度系统在反相高效液相色谱（HPLC）柱上纯化粗肽（见材料表）。采用含0.1% TFA的水溶液与含0.1% TFA的乙腈溶液进行梯度洗脱（0%-100%乙腈），流速为1 mL/min，时间为30-60分钟。

固相多肽合成示意图，显示Fmoc保护序列及化学反应装置。
图2：W-R的固相多肽合成。缩写：HBTU = 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐；DIPEA = N,N-二异丙基乙胺；TFA = 三氟乙酸；DMF = 二甲基甲酰胺。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 合成肽的细胞毒性测定

  1. 将 SK-OV-3 细胞以每孔 2,000 个细胞、MDA-MB-231 细胞以每孔 5,000 个细胞、或 CCRF-CEM 细胞以每孔 5 × 106 个细胞（总体积均为 100 µL/孔）接种至 96 孔微孔板中。将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 和 95% 空气的湿润环境中培养，直至细胞融合度达到 75%–80%。
    注意：CCRF-CEM 细胞使用 RPMI-1640 培养基，MDA-MB-231 和 SK-OV-3 细胞系均使用 Eagle 最小必需培养基（EMEM）。上述培养基均添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（含 10,000 单位/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素的 0.9% NaCl 溶液）。实验开始前，将所有培养基和添加剂置于 37 °C 水浴中预热 30 分钟。实验操作应在生物安全柜中进行，并佩戴手套和实验服。
  2. 用移液器吸除原有培养基，向 96 孔板中已接种的三种不同类型癌细胞孔中，每孔加入 100 µL 50 µM 肽溶液或作为阳性对照的 10 µM 多柔比星（Dox），每个处理设三个复孔。将微孔板放回培养箱，在与步骤 2.1 相同的条件下继续孵育 72 小时。
  3. 孵育 72 小时后，向每孔加入 20 µL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑（MTS）试剂。用铝箔纸包裹微孔板，于 37 °C 湿润环境中孵育 1–4 小时。
    注意：MTS 是一种用于检测活细胞（未经处理或经肽处理）的染料，因为只有活细胞才能将 MTS 四氮唑还原为可在 490 nm 处测定的有色甲臜染料。
  4. 使用酶标仪（参见材料表）在 490 nm 波长下测定甲臜产物的吸光度（A490）。以仅含培养基与 MTS 的混合液作为空白对照。以纯水（因肽类可溶于水）和 0.1 N HCl（因 WCH3 需用 HCl 溶解）作为空白对照。
  5. 使用电子表格软件（参见材料表）根据以下公式（公式 1）计算细胞存活率。该方法与 Mandal 等人20 所用方法相同。
    细胞存活率计算公式，A490 吸光度方程，实验结果分析。    公式 (1)

3. c-Src 激酶活性检测

注意：Src 激酶活性检测采用市售检测试剂盒（参见材料表），按照 Chhikara 等人22的方法进行三次重复实验。使用单独的 WCH3 和 RCH3 作为对照，以比较甲基化氨基酸单独存在时对激酶的影响，以及与其他甲基化或非甲基化氨基酸共同存在时的影响。

  1. 在384孔低体积黑色无结合表面圆底微孔板中，加入2.5 µL反应混合液，其中包含测定试剂盒提供的激酶缓冲液中的0.7 nM His6-Src激酶结构域，再加入2.5 µL溶于10% DMSO中的预稀释肽段（4倍目标浓度）。按照制造商说明书，在室温下使用微孔板摇床（5 rpm）孵育10分钟。
    注：反应混合液由激酶缓冲液（200 mM HEPES，pH 7.5）、MgCl2 （16 mM）、DMSO（4%）、EGTA（8 mM）、2-巯基乙醇（43 mM）和Brij-35（0.04%）组成。本实验中激酶反应的最佳底物序列为(AEEEIYGEFEAKKKK)。
  2. 向微孔板中加入5 µL ATP/底物混合液（40 µM/600 µM），在室温下置于微孔板摇床上孵育30分钟。
  3. 同时，将ADP检测试剂盒中的停止与检测缓冲液B（1x）配制为含8 nM ADP示踪剂和10 µg/mL染料标记的ADP2抗体的1x ADP检测混合液（参见材料表）。加入10 µL 1x ADP检测混合液以终止激酶反应（步骤3.2），并在室温下孵育1小时。
  4. 使用微孔板读数仪检测荧光强度，激发波长为580 nm，发射波长为630 nm，带宽为10 nm。从仪器获取相对荧光单位（RFU），并根据公式（2）计算酶抑制率。
    酶抑制率计算公式；数值分析，生化研究，RFU对照。    公式（2）
  5. 根据该公司网站列出的方法计算IC50值23。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

采用Fmoc固相肽合成法合成了W-RCH3、WCH3-RCH3、W-R(CH3)2、WCH3-R、WCH3-R(CH3)2以及对照肽W-R（图3），纯度分别为95%、98.7%、99%、100%、100%和99.5%。通过ESI-MS确认了这些二肽的化学结构。这些二肽的m/z值分别为374.1624、388.1949、388.1794、374.1815、402.2022和361.1457。

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讨论

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本文中用于抑制 Src 激酶并由此杀伤癌细胞的多肽含有甲基化色氨酸和/或甲基化精氨酸，这些属于非天然氨基酸。在合成这些多肽的过程中，加入乙醚后形成白色沉淀是一个关键步骤。然而，并非所有合成的多肽都能形成沉淀；因此，即使未观察到沉淀生成，仍可通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）检测目标分子量来确认多肽合成是否成功。所获得的多肽分子量还可用于预测其1H-NMR 谱图。已知非天然氨基酸相较于天然氨基酸对蛋白酶的蛋白水解降解具有更高的稳定性与抗性25，因而可能更有效地抑制 Src 激酶活性。此外，诸如甲基化丙氨酸（即 α-氨基异丁酸）等非天然甲基化氨基酸已被报道具有抗癌和抗菌活性26。精氨酸氨基酸的胍基含有五个氢键供体，通过添加甲基可消除其中的部分氢键供体。这种修饰将改变氨基酸的结构，进而影响其结合相互作用及生物学功能。

含色氨酸的二肽，例如 H-L-色氨酸-L-精氨酸-OH（W-R），具有多种应用。例如，WR 二肽作为过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（PPARγ）的拮抗...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢沙特阿拉伯吉达阿卜杜勒阿齐兹国王大学（KAU）科研事务副院长办公室（DSR）对本项目提供的资助，资助编号为（G: 031-130-1443）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫苏糖醇Sigma-Aldrich10708984001多肽合成
用于固相合成的 Aldrich 砂芯过滤漏斗Sigma-AldrichZ283304多肽合成反应器
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
茴香醚Sigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One 溶液 细胞增殖检测试剂 PromegaG3582细胞增殖检测（MTS 试剂）
二氯甲烷，99.9%，超干燥FishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)-OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 色谱柱 Shimadzu （RP-HPLC 系统）水/乙腈梯度洗脱
IRDye QC-1 淬灭剂Bell Brook Labs, Madison, WI3013
微孔板读板仪 SpectraMax M2eMolecular devices
Microsoft ExcelMicrosoft电子表格软件
N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）Sigma-Aldrich496219
N,N-二甲基甲酰胺，无水，99.8%FishersciAA43997M1
20% 哌啶Sigma-Aldrich80645
Rink 酰胺树脂（100–200 目）Sigma-Aldrich8550010025
硫代茴香醚Sigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI 检测试剂盒Bell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src 激酶活性检测试剂盒

参考文献

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