单细胞分辨率下小胶质细胞 Ca2+ 活性的时空分析

摘要

在本文中，我们描述了一种实验方案 体内 小胶质细胞钙成像²⁺ 活性及其时空动态的后续分析。该方法能够全面表征小胶质细胞如何响应脑内环境变化，并准确捕捉此类事件发生的精细时空尺度。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统中唯一的常驻免疫细胞。其形态具有高度可塑性，会随着细胞活性的变化而改变。在稳态条件下，小胶质细胞具有高度分支的形态，通过其突起的持续伸展与回缩来监测周围环境。然而，在脑损伤和炎症过程中，小胶质细胞会被激活并发生显著的形态学变化，表现为分支突起回缩以及胞体肿胀。这些变化有助于小胶质细胞执行迁移和吞噬等功能，以帮助脑内环境恢复至更接近正常的病理状态。

小胶质细胞形态与其活性变化之间的这种密切关系，使得人们对小胶质细胞的多种功能获得了深入的认识。然而，这些形态和活性的变化本身可能是由多种细胞内信号通路所引发的现象。此外，刺激与反应之间存在的时间延迟，以及小胶质细胞高度区室化的形态结构，使得揭示其功能背后因果机制的工作变得困难。为解决这一问题，我们构建了一种转基因小鼠品系，使其小胶质细胞特异性表达一种高灵敏度的荧光Ca²⁺指示蛋白。

在描述了体内小胶质细胞Ca²⁺成像的方法之后，本文提出了一种结构化的分析方法，可将Ca²⁺活动分类至明确定义的亚细胞区域，从而确保所编码信息的空间和时间维度得以有意义地提取。我们相信，该方法将有助于深入理解调控小胶质细胞多种活动的细胞内信号传导规律，这些活动既涉及高级脑功能，也与病理状态相关。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在维持大脑内环境稳态以及调控脑发育过程中神经环路的形成中发挥重要作用^1,2。小胶质细胞在中枢神经系统中的一个独特特征是其形态具有高度可塑性；然而，不同的形态表型可能与特定功能相关。此外，形态表型之间的转换具有高度动态性，可在环境变化时快速发生^3,4。

在稳态生理条件下，小胶质细胞呈现高度分支的形态，具有多个向各个方向延伸的突起。这些分支状突起本身表现出高度的运动性，持续地伸展和回缩^3,4。这种活动主要指向周期性接触神经元突触、轴突和胞体，以监测神经元活动^5,6,7,8,9。然而，当脑组织受损时，小胶质细胞会迅速检测到这种异常，并作为其适应性反应的第一步，将其突起定向延伸至损伤部位^3,4。当小胶质细胞需要吞噬死亡细胞和代谢产物时，它们会转变为类似阿米巴样的形态，缩短突起并增大胞体体积，这是其向免疫激活表型转化的一部分^10,11。

然而，尽管小胶质细胞突起的显著形态学变化易于检测，但细胞胞体在更精细尺度上的变化则难以捕捉，尤其是在具有生理相关性的时间分辨率下。此外，形态学变化本身仅代表了众多细胞内信号通路整合后的最终结果。这对于追踪功能活动、并从机制上将刺激与其引发的最终反应进行关联的目标而言，构成了挑战。

鉴于钙离子作为第二信使的广泛作用，研究细胞内Ca²⁺ 动力学能更准确地捕捉与动态细胞过程相关的时空信息。由于小胶质细胞表达多种与下游细胞内钙信号通路相关的离子型和代谢型受体，该方法适用于小胶质细胞的研究。²⁺ 升高。事实上， 体内 Ca²⁺ 成像技术已被用于实时表征小胶质细胞活动的空间-时间特征，成功地将小胶质细胞Ca²⁺动态变化与功能改变相关联²⁺ 脑损伤、炎症以及神经元的过度活跃和活动不足的相关活动^{12,13,14,15,16}例如，Ca²⁺ 与小胶质细胞突起在神经元活动增强或减弱时发生延伸相关的升高现象，可能反映了其内在的 Ca²⁺依赖性肌动蛋白聚合过程¹⁶此外， 体内 Ca²⁺ 成像技术还可轻松地与药理学方法相结合。例如，小胶质细胞同时表达P2X（离子型）和P2Y（代谢型）受体，局部应用P2Y激动剂可模拟并随后使小胶质细胞的Ca²⁺反应脱敏。²⁺ 对受损邻近神经元的反应¹³因此表明P2Y信号在神经元损伤检测中具有更重要的意义。

迄今为止，已有先前的报道研究了小胶质细胞的Ca²⁺ 活动研究已采用基于感兴趣区域（ROI）的分析方法。这些方法的一个缺点是仍过于粗略，无法解析Ca²⁺的时空动态变化²⁺ 在单个小胶质细胞突起水平上的活性。因此，本方案描述了基于传统感兴趣区域（ROI）的微胶质细胞Ca分析方法²⁺ 活性及更新的基于事件的方法，这些方法能够提取单个Ca²⁺ 小胶质细胞突起中的事件。在此之前，我们提供一份通用指南 体内 双光子成像以适当地捕获小胶质细胞钙信号²⁺ 用于详细分析的活性

方案

所有动物实验均经生理科学研究所动物研究委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院的指导方针。所有实验均使用8至10周龄的雄性小鼠，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。 随意摄取 自由饮水和进食。为观察Ca²⁺ 小胶质细胞中的活性，离子化 Ca²⁺ Iba1-tTA 小鼠与 tetO-GCaMP6 小鼠杂交^17,18因此，在无四环素类似物补充的情况下，Iba1启动子驱动GCaMP6仅在小胶质细胞中表达。所有实验均在出生后6周停止多西环素饮食补充。所有实验结束后，小鼠通过过量异氟烷麻醉后行颈椎脱位处死。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、动物和试剂的详细信息。

1. 小鼠手术准备 在体 双光子成像；第1天

1. 所有手术操作均应在层流洁净工作台内进行，以维持无菌工作环境。手术开始前，使用紫外灯对工作台内部消毒5分钟。
2. 用70%乙醇擦拭所有工作台面、手术架和立体定位仪，进行消毒。
3. 将所有手术器械（剪刀、镊子、刀片、弯头镊）以及用于固定在小鼠颅骨上的定制头板浸入1%葡萄糖酸氯己定溶液中进行灭菌。
4. 用氯胺酮（7.4 mg/kg）麻醉小鼠⁻¹，腹腔内注射 [i.p.]）和赛拉嗪（10 mg/kg）⁻¹，腹腔注射）。将其放回饲养笼，直至麻醉生效。通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉完全诱导。
5. 用1%葡萄糖酸氯己定对头皮进行消毒。使用刀片剃除毛发。
6. 将小鼠固定在手术架上 通过 立体定位仪
7. 麻醉期间涂抹眼药膏以防止眼睛干涩。
8. 在头皮上涂抹2%利多卡因凝胶以进行疼痛管理，等待5分钟。
9. 用剪刀去除头皮并暴露颅骨。清除骨膜，并用棉签擦拭暴露的颅骨表面使其干燥。
   注意：暴露的颅骨区域必须完全干燥，以确保与定制头板牢固粘合。
10. 用牙科水泥将定制的头板固定在颅骨上。
11. 水泥凝固后，使用额外的牙科水泥填充颅骨表面与定制头板边缘之间的任何缝隙。
12. 使用丙烯酸基牙科粘接树脂水泥对水泥和颅骨表面进行防水处理。
13. 将小鼠放回其饲养笼，并置于加热垫上。监测小鼠直至其恢复足够的意识以维持胸卧位（2小时内）。
    ​注意：小鼠应在第二天完全恢复，之后可与其他动物合笼饲养。

2. 小鼠手术准备 体内 双光子成像；第2天

1. 所有手术操作均应在层流洁净工作台内进行，以维持无菌工作环境。手术开始前，使用紫外灯对工作台内部消毒5分钟。
2. 将两片不同尺寸的玻璃盖玻片（上层盖玻片：3 mm × 3 mm；下层盖玻片：2 mm × 2 mm）用紫外光固化光学级树脂粘合在一起。
   注意：双层盖玻片可在实现长期光学观测的同时，对颅窗暴露的脑区提供持久保护。因此，可根据需要成像的脑区调整其尺寸。
3. 使用70%乙醇擦拭所有工作表面和手术架以进行消毒。
4. 将所有手术器械（钢制钻头、镊子、手术针钩）浸入1%葡萄糖酸氯己定溶液中进行消毒。
5. 用异氟烷麻醉小鼠（4%诱导，1.2%–1.5%维持）。将小鼠固定于手术架中 通过 头板
6. 在颅骨上制作覆盖初级运动皮层的颅窗时，以颅骨标志点前囟（Bregma）前0.2 mm、外侧1 mm处为中心，标记一个边长为2 mm × 2 mm的正方形区域。
7. 使用钢钻沿标记方框的边界磨薄颅骨。
   注意：当接近理想厚度时，用生理盐水湿润后，颅骨变薄区域将呈现半透明状，并开始出现细小裂纹。
8. 在确认标记方框的整个边缘均已适当变薄后，将手术针钩小心地插入颅骨表面下方，针钩尖端朝向方框中心。用针钩轻轻抬起方框区域的颅骨碎片，并使用镊子将其从其余颅骨上剥离。若出现出血，需持续用生理盐水冲洗暴露的脑表面，直至出血完全停止。
9. 将双层盖玻片置于暴露的脑组织表面，使较小盖玻片的一侧朝向脑组织。确保较大盖玻片的边缘与颅窗边界紧密接触。
10. 使用安装在操纵器上的硅胶尖端玻璃棒，轻轻按压双层盖玻片，以确保其与脑表面良好接触。
11. 用紫外光固化树脂填充双层盖玻片、颅骨与脑表面之间的间隙，并用紫外光照射至固化（约20秒）。缓慢将硅胶尖端的玻璃棒从双层盖玻片处移开。
12. 让小鼠恢复，并将其置于加热垫上。监测小鼠，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位（30 分钟）。
13. 进入步骤3或将小鼠放回其饲养笼。
    ​注意：熟练的手术操作后，硬脑膜及所有下方血管应完全 intact，无出血。在此情况下，炎症反应极轻微，可立即进入步骤 3。若不确定，应等待 1–3 周，以确保任何炎症已完全消退。

3. 使用以下方法进行数据采集 在体 双光子成像

1. 提前开启成像装置，确保激光器有足够时间预热并稳定。将激光器调节至920 nm波长发射，该波长位于双光子光谱范围内，可最优激发GCaMP6荧光蛋白。
2. 将小鼠置于25倍显微镜物镜下，并适应环境30分钟。如有必要，成像期间可使用异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度4%，维持浓度1.2%–1.5%）。
   注意：异氟烷可能不适用于某些研究应用，因其会影响小胶质细胞突起的运动性及Ca²⁺活性^19,20,21。
3. 将放大倍数设为1x，然后在颅窗区域寻找表达GCaMP6的微胶质细胞。搜索深度应位于脑表面下方100 µm至300 µm之间。
4. 一旦找到合适的表达GCaMP6的微胶质细胞，应最大化放大倍数，以便以单细胞分辨率捕获Ca²⁺活动。
5. 通过视觉确认Ca²⁺活动是否被清晰捕获，必要时调整激光功率和成像增益。
   注意：应尽可能降低激光功率，以避免光漂白及对微胶质细胞造成损伤。
6. 按以下步骤进行四维（4D）图像采集（步骤3.6.1–3.6.3；图1B）：
   1. 设置图像尺寸为XY区域=512 × 512像素，0.25 µm/像素；Z区域=五个z平面，z步进3 µm（图1B）。
   2. 设置采集速率为2.5帧/秒。
      注意：此速度下的Z轴扫描由压电纳米定位系统实现。
   3. 持续采集数据，直至观察到至少10个独立的Ca²⁺事件（通常约10分钟）。

4. 分析前准备（运动校正、平均/最大Z投影）

1. 在分析小胶质细胞 Ca²⁺ 活性之前，使用 MATLAB 编程环境（R2020a）中的 ECC 图像配准算法²² 对 4D 图像进行运动相关伪影校正（图像配准）。代码下载地址： https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/27253-ecc-image-alignment-algorithm-image-registration。
2. 利用 MATLAB 中的 imregister 操作（标准图像处理工具箱），对第一个时间点内的所有图像进行配准，生成参考 3D 图像。
3. 使用 ecc 函数（ECC 图像配准算法库）将所有后续图像与参考 3D 图像中对应的 z 平面进行配准。
4. 利用 MATLAB 的 mean 操作对配准后的图像生成平均强度 z 投影。如果成像信号过弱，则改用 MATLAB 的 max 操作生成最大强度 z 投影。
   注意：使用最大强度 z 投影时，信噪比会更差。
5. 继续执行步骤 5 或步骤 6。将步骤 4 中生成的 z 投影作为分析目标，用于在步骤 5 和步骤 6 中绘制 Ca²⁺ 活性的时空动态图谱。

基于 ROI 的分析

1. 使用步骤4生成的z轴投影，识别在整个成像期间保持稳定面积轮廓（稳定面积）的小胶质细胞突起，用于后续的Ca分析²⁺ 活性操作步骤如下（步骤 5.3–5.6）：
   1. 使用注册后的4D图像，分别生成成像期开始和结束时采集的2分钟样本的最大强度t投影 最大值 MATLAB 操作
   2. 对t投影进行二值化处理，以生成对应成像期起始和结束时刻的小胶质细胞形态的多边形 二值化 MATLAB 操作。使用自动设置的默认阈值。
      注意：如果 Ca²⁺ 成像周期的开始和结束阶段信号较弱时，二值化可能会产生边界缺失的多边形。此时，应使用手动绘制缺失的边界 铅笔工具 在 ImageJ 中。
   3. 使用 t-投影多边形进行叠加 imadd MATLAB 操作。重叠区域表示稳定区域（图2B).
   4. 在已确定的稳定区域内，使用 绘制多边形 使用 MATLAB 手动定义并追踪每个小胶质细胞初级突起及任何明显的二级分支的 ROI。
2. 追踪单个 ROI 在所有时间帧中的平均绝对荧光强度（图2C，D).
3. 从绝对荧光强度的时间序列数据中，计算荧光强度的相对变化量（ΔF/F）时间序列，依据公式（1）。该时间序列代表了小胶质细胞钙信号的归一化结果²⁺ 单个感兴趣区域（ROI）水平的动力学。
   ΔF/F = (F(t) - F₀) / F₀ (1)
   其中 F(t) 是在给定时间记录的荧光强度，F0 是初始荧光强度。^th 所有时间帧中荧光强度的百分位数（图2E).
4. 鉴定候选 Ca²⁺ 在给定的单个感兴趣区域（ROI）中发生的放电事件，操作步骤如下（5.5.1–5.5.3）：
   1. 对信号应用I型有限冲激响应（FIR）低通滤波 ΔF/F 使用时间序列 fir1 MATLAB 操作。将截止频率设置为奈奎斯特值（采样率的一半）。
   2. 目视检查滤波后的信号轨迹，确认单个轨迹峰对应于 Ca²⁺ 爆发事件²⁺ 注册的4D图像中的活动（图2F).
   3. 鉴定候选 Ca²⁺ 将放电事件视为向下凹的拐点ΔF/F 时间序列轨迹。将基线阈值定义为中位数 ΔF/F 在所有时间帧中排除最大和最小10%振幅后的上下限范围内的值。将检测阈值定义为高于基线阈值三个标准差（SD）图2F，).
5. 鉴定真正的Ca²⁺ 按以下步骤从候选者中筛选放电事件（步骤 5.5.1-5.5.2）：
   1. 通过对应滤波后的信号微分计算每个候选事件的斜率 ΔF/F 使用时间序列帧 数值梯度 MATLAB 操作
   2. 随后鉴定真实的 Ca²⁺ 根据曲线的上升时间确定事件。将基线阈值定义为所有候选事件斜率值的平均值。将检测阈值定义为高于基线阈值三个标准差（SD）的水平。图 2G，H).
6. 表征真实的 Ca²⁺ 事件如下（步骤 5.6.1-5.6.3）：
   ​注意：以下并非用于表征小胶质细胞 Ca 的参数的详尽列表²⁺ 事件。感兴趣参数取决于研究目的。
   1. 推导真实钙信号的最大振幅²⁺ 放电事件作为 ΔF/F 相应值 ΔF/F 时间序列帧
   2. 计算真实 Ca 的平均振幅²⁺ 放电事件的平均值 ΔF/F 整个相应范围内的值 ΔF/F 时间序列帧子集
   3. 推导真实钙振荡的频率²⁺ 事件数除以成像时间。

6. 基于事件的分析

1. 使用 MATLAB 编程环境中的 AQuA 库对第 4 步得到的 z 投影进行基于事件的分析。代码下载地址： https://github.com/yu-lab-vt/AQuA。
   注意：AQuA 库的通用使用指南可从以下地址获取： https://drive.google.com/file/d/1a3lhe0dUth-5J1-S2fZlPOCZlPbeuvUr/view。AQuA 库的详细文档可从以下地址获取：https://drive.google.com/file/d/1CckDLbrkw16b7MPlOQdYpZciIz80Snm_/view。
2. 启动 MATLAB 后，使用 cd 命令将默认工作目录切换至 AQuA 指定的工作目录文件夹。
3. 将配准后的 4D 图像加载到 AQuA 分析流程中，操作如下（步骤 6.3.1–6.3.2）：
   1. 启动 AQuA 图形用户界面（GUI）。在 MATLAB 命令窗口中，于 AQuA 指定的工作目录文件夹内输入 aqua_gui 。
   2. 在 AQuA GUI 中，点击 new project，并选择待分析的 registered images 。设置 data type（GCaMPInVivo_cyto_Lck_）和 imaging parameters（时间分辨率，秒/帧 = 1.993；空间分辨率，µm/像素 = 0.25；排除距离边界小于该值的像素 = 5）。点击 open 以加载数据。
4. 通过勾画感兴趣区域来定义后续分析流程所需的标记点。通常，标记点基于细胞边界和胞体区域。
5. 随后，运行自动分析流程，检测候选 Ca²⁺ 事件，所涉及参数包括：active signal, super voxel, event detection, clean events 和 merge events。
   注意：AQuA 使用指南中对上述每个参数及其候选评分输出有详细说明。简而言之，这些参数调整 Ca²⁺ 事件检测阈值的方式如下：active signal = 荧光强度幅度，super voxel = 三维空间中的荧光聚类，event detection = 上升/衰减动力学，clean events = 信噪比，merge events = 事件间的时间间隔。
6. 目视检查检测到的 Ca²⁺ 事件（系统会自动叠加到原始配准图像上）。如有必要，根据上述参数所反映的图像质量调整分析流程的参数设置；若某参数对应的图像质量较好，可设置更高的阈值，反之亦然。
7. 当所有 Ca²⁺ 事件均被适当检测后，在主 MATLAB 环境中对这些事件进行表征，操作如下（步骤 6.8–6.14）：
8. 导出 AQuA 分析的输出文件。
   注意：AQuA 文档中详细说明了输出文件的内容、用于定义 Ca²⁺ 事件的提取特征及其底层参数。
9. （可选）将所有 Ca²⁺ 事件分为两类：1）起始于胞体的事件，2）起始于突起的事件。
10. 从 AQuA 分析输出文件（.mat 文件）的 res.dffMat MATLAB 结构中获取单个 Ca²⁺ 事件的幅度。
11. 使用 res.fts.loc.x3D MATLAB 操作（AQuA 库）计算单个 Ca²⁺ 事件的频率。
12. 使用 res.fts.curve.width11 MATLAB 操作（AQuA 库）计算单个 Ca²⁺ 事件的持续时间。
13. 使用 res.fts.basic.area MATLAB 操作（AQuA 库）计算单个 Ca²⁺ 事件的面积。
14. 将所有 Ca²⁺ 事件分类为：1）局部事件，2）向胞体传播的传播性事件，3）远离胞体传播的传播性事件。为此，使用 res.fts.region.landmarkDir.chgToward 和 res.fts.region.landmarkDir.chgAway MATLAB 操作（AQuA 库）（图 3C）。

结果

在仅于小胶质细胞中表达GCaMP6（一种Ca²⁺敏感的荧光蛋白）的转基因小鼠中，我们通常观察到小胶质细胞Ca²⁺活性的多种不同模式（图2A）。重要的是，即使在同一小胶质细胞内，不同突起之间的Ca²⁺活性模式也可能存在显著差异。

为了量化小胶质细胞Ca²⁺活动在时空动态上不同处理之间的差异，首先需要识别出稳定的区域，然后将其细分为多个精细划分的感兴趣区域（ROI）（图2B，C）。对于每个ROI，必须从小胶质细胞荧光强度的时间序列中提取局部振幅和轨迹斜率等特征，进而推导并量化Ca²⁺活动的相关参数，例如振幅和频率（图2D–G）。

接下来，必须通过应用精确的量化算法 AQuA 来分析单个 Ca²⁺ 事件（图 3A）。通过此类基于事件的分析，通常可观察到单个 Ca²⁺ 事件在起源、幅度、持续时间、位置和传播方向特征上存在显著差异（图 3B）。若重点关注小胶质细胞突起中的 Ca²⁺ 活动动态，则可采用将事件分类为局部事件、向胞体传播的事件以及远离胞体传播的事件的分类方案，该方案具有重要信息价值（图 3C）。

图1实验装置设置 体内 小胶质细胞 Ca²⁺ 成像 (A实验装置。一只 Iba1-tTA × tetO-GCaMP6 转基因小鼠，其小胶质细胞特异性表达 GCaMP6。通过在小鼠颅骨上植入颅窗，实现对小胶质细胞 Ca²⁺²⁺ 可以观察到活性 体内 使用双光子显微镜。 (B) 实验时间安排与分析流程。采集至少持续10分钟的4D图像，以每五帧为一组的z轴层扫图像形式获取。帧采集速率为2.5帧/秒。在分析小胶质细胞Ca²⁺ 将五帧z轴层析图像转换为二维z投影图，方法是取平均（或最大）强度值。z投影图像的播放速率为0.5帧/秒。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2基于 ROI 的小胶质细胞 Ca 分析²⁺ 活性 (A单个小胶质细胞在10分钟内的平均GCaMP6强度投影。B稳定区域（白色）由成像期开始（品红色）和结束时（绿色）采集的2分钟样本的二值化GCaMP6最大强度t投影叠加定义。C稳定区域进一步被划分为局部感兴趣区域（ROI）。不同颜色代表不同的ROI。D) ΔF/F 所有独立ROI的轨迹 C注意不同感兴趣区域（ROI）之间活动模式的差异。E原始轨迹 ΔF/F 由单个ROI的绝对强度值导出的时间序列。F相同的 ΔF/F 低通滤波后的时间序列。候选 Ca²⁺ 事件通过设定的振幅阈值（红线）进行检测，该阈值定义为基线值加三个标准差（SD）。基线（绿线）定义为整个记录期间信号的中位数值 ΔF/F 时间序列的上下限，排除最大值和最小值的前10% ΔF/F 值。G) 由滤波后得到的坡度迹线 ΔF/F 时间序列在 F. 真性钙²⁺ 事件按候选 Ca 进行排序²⁺ 基于斜率截断阈值（红线）的事件，该阈值定义为基线值加三个标准差（baseline + 3 SDs）。基线（绿线）定义为整个斜率时间序列的平均值，计算时排除斜率值中最高和最低各10%的数据点，以设定上下限范围。H) 候选Ca²⁺ 由振幅标准识别的事件 F 用橙色表示。真实 Ca²⁺ 按候选钙信号排序的事件²⁺ 根据斜率标准筛选事件 G 呈红色。请注意，某些候选 Ca²⁺ 根据斜率标准对事件进行了合并。相应的过滤后 ΔF/F 时间序列在下方叠加显示以供参考。黑线表示零振幅（ΔF/F). 真实钙信号的平均振幅和最大振幅²⁺ 事件由滤波后相应峰值的均值和最大值确定 ΔF/F 时间序列。频率（事件/分钟）由真实的Ca事件数量计算得出。²⁺ 放电事件数除以成像时长（10 分钟）。比例尺 = 20 µm（A，B），10 µm（C）。缩写：ROI = 感兴趣区域。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 3：基于事件的分析用于小胶质细胞 Ca²⁺ 活性。 (A) 使用 AQuA 算法检测到的事件的代表性图像。颜色表示在某一特定时间点检测到的各个事件区域。(B) 按发生顺序排列的单个事件中归一化的 Ca²⁺ 活性（ΔF/F）代表性曲线。右侧色条表示以颜色编码的 ΔF/F 值。(C) 事件向胞体传播、远离胞体或局部发生的活性足迹代表性图示。对于局部事件，事件形态以蓝色显示；对于传播性事件，事件起始时间由蓝-黄比例标尺表示。由于 AQuA 最初是单独检测 Ca²⁺ 事件，因此传播性事件需基于多个单独 Ca²⁺ 事件的空间位置重叠及其时间序列进行后续识别。请注意，此为与 图 2E-H 中 ROI 分析所用相同的树突分支。比例尺 = 20 µm (A)，10 µm (C)。缩写：ROI = 感兴趣区域；S = 胞体。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种以高时空分辨率成像小胶质细胞Ca²⁺活性的改进方法。该方法具有足够高的灵敏度，可检测单个分支突起水平上的不同类型小胶质细胞Ca²⁺活性，并能轻松区分局部性与传播性事件。

在进行小胶质细胞 Ca²⁺ 活性 体内 双光子成像的一般方法中，为最大限度提高成像质量，必须注意以下几点。首先，由于小胶质细胞对损伤极为敏感，因此在手术过程中应尽量避免手术器械直接接触脑表面。判断手术操作熟练的关键指标包括：血管和硬脑膜保持完整，术中出血极少。其次，将头固定板牢固地安装在小鼠颅骨上，并确保双层盖玻片与脑表面良好贴合，可显著减少成像过程中的运动相关伪影。这一点在进行高时空分辨率成像以及对完全清醒的小鼠进行成像时尤为重要。尽管分析流程能够可靠地校正由心跳、呼吸和总体漂移引起的运动伪影，但在处理因突然大幅运动导致的显著几何形变时，其鲁棒性较低。

本文所述的两种分析方法具有不同的优势，适用于不同的研究问题。在基于感兴趣区域（ROI）的分析中，用户预先定义ROI（例如单个突起），从而提取该ROI内Ca²⁺活动的总体动态特征。因此，该方法最适合用于预期现象局限于具有明确形态边界且相对面积较大（如突起分支）的亚细胞区域的情况。在基于事件的分析中，单个事件是根据小胶质细胞Ca²⁺活动本身的空间-时间动态来定义的，随后必须结合用户定义的小胶质细胞内部标志物来理解其功能意义。因此，该方法更适合于无法对现象定位做出先验假设，或感兴趣区域相对较小（如突起末端）的情况。因此，与以往方法相比，基于事件的分析在表征小胶质细胞Ca²⁺活动时具有更高的空间-时间分辨率。

在这些小鼠中，小胶质细胞表达的唯一荧光标记物是 Ca²⁺ 指示剂 GCaMP6。因此，在 Ca²⁺ 活性较低的区域，必须通过整合多个时间帧来提取小胶质细胞的形态，但这可能会降低时间分辨率。然而，可通过在小胶质细胞中表达一种独立的稳定红色荧光蛋白来克服这一局限。值得注意的是，近期已有研究报道了能够转染小胶质细胞的新型腺相关病毒^23,24,25。

小胶质细胞Ca²⁺活性如何受周围环境影响是一个新兴的研究热点。特别是，小胶质细胞的Ca²⁺活性似乎与神经元活动存在显著相关性，但其功能意义尚未被充分阐明。因此，将神经元活动调控与本文所介绍的小胶质细胞Ca²⁺活性成像及分析方法相结合，有望为揭示小胶质细胞的生理特性提供新的见解，并进一步加深我们对小胶质细胞在生理和病理状态下所起作用的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 利多卡因凝胶	阿斯利康，英国
B6(129S6)-Tg(Aif1-tTA)54Kftnk	日本理化学研究所生物资源中心	RBRC05769	Iba1-tTA 小鼠
B6;129-Actb(tm3.1(tetO-GCaMP6)Kftnk)	日本理化学研究所生物资源中心	RBRC09552	tetO-GCaMP6 小鼠
镊子	精细科学工具，美国	13008-12
G-CEM ONE	GC 公司，日本
玻璃毛细管	日本纳利斯格	GDC-1
ImageJ	美国国立卫生研究院，美国
异氟烷	辉瑞，美国
氯胺酮	第一三共，日本
Kwik-sil	美国 World Precision Instruments 公司	KWIK-SIL
MATLAB，2020a	MathWorks，美国
微型盖玻片  （2 × 2 毫米，3号）	日本松波	定制	颅骨底部玻璃  窗
盖玻片  （3 × 3 毫米，0号）	日本松波	定制	颅窗上层玻璃
N25X-APO-MP	日本尼康	N25X-APO-MP	物镜（25倍）
诺兰德光学胶	Edmund optics, 美国	6101
压电纳米定位系统，Nano-Drive	Mao City Labs，美国
剃刀刀片	日本	FA-10
剪刀	精细科学工具，美国	14060-11
钢钻	日本明尼托	BS1201
立体定位仪	日本纳利什格	SR-5M-HT
Super-bond（C&B试剂盒	日本Sun Medical公司	4560227797382
手术缝合针钩	精细科学工具，美国	10065-15
钛宝石激光器，MaiTai DeepSee	Spectra Physics，美国	Mai Tai eHP DS
镊子	精细科学工具，美国	11051-10
镊子	精细科学工具，美国	11255-20
双光子显微镜	日本尼康公司	A1R-MP
紫外光固化树脂	日本清原	紫外线辐射
赛拉嗪	德国拜耳公司