评估生物毒素对斑马鱼免疫细胞功能的影响

摘要

本方案描述了流式细胞术检测方法，可用于评估毒素暴露对斑马鱼白细胞不同亚群内吞功能的影响。在检测中使用特异性功能抑制剂，可区分发生改变的内吞机制。

摘要

多种生物毒素可能以有害浓度存在于水生环境中。蓝藻是一类多样化的原核微生物，可在水生环境中产生蓝藻毒素。这些生物毒素可能是肝毒素、皮肤毒素或神经毒素，可影响鱼类和哺乳动物。在高浓度下，这些化合物具有致命性；在非致死浓度下，它们则隐匿地发挥作用，影响免疫细胞功能。藻类产生的生物毒素包括微囊藻毒素和鱼腥藻毒素A。水生动物还可能摄食被肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生的肉毒神经毒素E型（BoNT/E）污染的物质，从而导致死亡或免疫功能下降。斑马鱼可用于研究毒素如何影响免疫细胞功能。在这些研究中，毒素暴露可在体内（in vivo）或体外（in vitro）进行。in vivo 研究先将斑马鱼暴露于毒素，然后分离细胞，该方法可揭示组织微环境对白细胞功能的影响。in vitro 研究则先分离细胞，再将细胞置于培养孔中进行毒素暴露。白细胞通过肾脏髓质提取后，经密度梯度离心获得。白细胞如何内化病原体由内吞机制决定。流式细胞术吞噬功能检测可用于判断毒素暴露是否改变了内吞机制。目前尚缺乏利用分离白细胞研究毒素导致免疫功能障碍机制的研究。本文所述方法将使实验室能够利用斑马鱼研究环境毒素降低免疫细胞内吞功能时所影响的相关机制。

引言

环境中存在多种生物毒素和免疫抑制剂。含有细菌毒素的藻类水华可出现在内陆水域，也可形成生物膜¹。蓝藻（蓝绿藻）天然存在于所有淡水生态系统中，近年来在淡水系统中的水华现象显著增加²。在特定条件下，蓝藻可产生对水生和陆生动物有害的毒素。这些毒素可能影响肝脏、皮肤和黏膜，和/或神经系统。蓝藻产生的两种化合物是微囊藻毒素和鱼腥藻毒素A。微囊藻毒素是一种环状七肽³。鱼腥藻毒素A是一种生物碱⁴。肉毒神经毒素E（BoNT/E）是另一种存在于水生系统中的毒素，由Clostridium botulinum产生，可被水生动物摄入⁵。

暴露于环境毒素会影响鱼类，同时也可能影响动物健康并增加疾病发生率⁶。了解这些毒素如何影响免疫细胞，对于评估接触这些物质所带来风险至关重要。斑马鱼是研究环境毒素对免疫细胞影响的理想模型⁷。建立一种利用流式细胞术和斑马鱼白细胞的研究方法具有重要意义。斑马鱼在生理上与人类具有相关性，该方法可广泛应用于从基础毒理学和免疫学到药物发现及发育生物学等多个研究领域。由于斑马鱼是水生生物，因此特别适用于研究水传播环境毒素的影响⁷。与其他脊椎动物模型相比，斑马鱼的使用成本较低，且涉及的伦理问题更少。

白细胞，即白血球，是抵御致病生物的首要细胞防线。胞吞作用是指细胞摄取或内化细胞外液体或颗粒的过程，通过将物质包裹在囊泡中来实现⁸。白细胞利用这一过程作为杀灭病原体并启动抗病防御的第一步。吞噬作用是胞吞作用的一种类型，也是最早用于研究环境污染物对鱼类健康影响的方法之一⁹。Petrie-Hanson 实验室已建立利用斑马鱼白细胞筛选生物毒素的方法，以评估这些毒素干扰白细胞胞吞和吞噬功能、进而影响免疫防御的潜在能力。这些方法涵盖的胞吞类型包括胞饮作用、吞噬作用、钙依赖性受体介导的吞噬作用以及甘露糖受体介导的吞噬作用。在斑马鱼中应用流式细胞术的方法最早由 Petrie-Hanson 实验室描述⁹，现已被常规用于研究水生毒素和病原体。Rag1^-/- 突变型斑马鱼缺乏 T 细胞和 B 细胞¹⁰，可用于特异性研究先天免疫细胞机制。

流式细胞术基于激光技术，可用于测定细胞的物理特性。前向散射（FSC值）绘制在X轴上，代表细胞的大小；侧向散射（SSC）绘制在Y轴上，代表细胞胞质的颗粒度。所得散点图显示具有相似物理特性的细胞群体聚集在一起，不同类型的细胞在散点图上出现在不同的位置。当细胞的物理特性发生变化时，这些细胞群体在散点图上的位置也会随之改变⁹。将该技术应用于斑马鱼白细胞，可使研究人员评估细胞群体在各种刺激（包括环境毒素）作用下的变化情况。

流式细胞仪具有多维分析能力，可在检测中使用多种类型的荧光染料，以进一步表征细胞及其活性。在本方案所述的实验中，通过测定细胞内吞的荧光物质的量来评估内吞作用。通过流式细胞术比较暴露于毒素的细胞与未暴露于毒素的细胞摄取物质的能力，可以确定毒素暴露是否以及如何影响内吞机制。可通过此方法评估的内吞过程包括胞饮作用、受体介导的内吞作用和吞噬作用。

胞饮作用是指细胞摄取可溶性成分的过程，该过程不依赖细胞受体。摄取过程涉及微丝和微管介导的细胞质重排，从而形成小的液泡。荧光黄（Luciferase Yellow, LY）是一种荧光染料，可用于测量非选择性胞饮作用的液体摄入量¹¹。受体介导的内吞作用则涉及对大分子的选择性摄取。荧光素（FITC）标记的葡聚糖（DX）40可用于评估这一过程。吞噬作用是一种内吞作用形式，可摄取大于0.5微米的颗粒，通常通过使用FITC-DX70和FITC-Escherichia coli的实验方法进行研究。DX40和DX70的分子量分别为40,000和70,000。FITC-E. coli是标准实验室菌株E. coli与荧光染料结合的复合物，可通过流式细胞仪进行检测。多种受体介导的内吞作用需要钙离子作为信号分子，并参与细胞骨架的重排⁹。另一种类型的受体介导内吞作用是甘露糖受体（mannose receptor, MR）介导的内吞作用。甘露糖受体是一类跨膜蛋白，能够识别微生物细胞表面的甘露聚糖结构⁹。为了优化这些实验流程，应对每种毒素建立剂量-反应曲线，以确定合适的使用剂量。同时，应对LY、FITC-DX40、FITC-DX70和FITC-E. coli进行饱和曲线实验，以评估其最佳使用浓度。

白细胞内化不同颗粒所采用的机制可能各不相同。为了推断毒素暴露可能影响该过程中的哪些组分，可加入抑制剂以阻断吞噬机制。细胞松弛素D（CCD）可抑制微管运动，从而抑制胞饮作用。CCD不影响受体介导的内吞作用¹¹。EDTA可阻断依赖钙离子（Ca²⁺）的受体介导内吞作用。甘露聚糖是甘露糖受体（MR）的天然配体，常被用作甘露糖受体抑制剂，以评估吞噬作用或胞饮作用是否由甘露糖受体介导⁹。

本实验方案的目的是演示如何检测毒素暴露是否影响吞噬性白细胞摄取病原体的能力。这些方案还可用于判断特定的内吞机制是否受到影响。通过流式细胞仪进行这些检测，可进一步根据细胞大小和胞质颗粒度对白细胞群体进行设门，从而确定不同白细胞亚群是否受到差异性影响。该方法依赖于对细胞群体的电子设门技术。

方案

本方案已获得密西西比州立大学机构动物护理与使用委员会（MSU-IACUC）批准。本研究中使用的所有斑马鱼均来自一个纯合品系的种群。 rag1^-/- 密西西比州立大学（MSU）兽医学院无特定病原孵化场先前建立的突变型斑马鱼¹⁰野生型斑马鱼也在该孵化场中进行繁殖。在这些研究中，可进行毒素暴露实验。 体内 或 体外. 体内 研究中将斑马鱼暴露于毒素，随后分离白细胞，以揭示毒素与组织微环境之间的相互作用及其对白细胞功能的影响。 体外 研究将白细胞分离后，在培养孔中将细胞暴露于毒素。

1. 试剂与溶液的配制

1. 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：（不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）+ 0.05% 牛血清白蛋白（BSA））（见材料表）。在细胞分离前新鲜配制。
2. 组织培养基（TCM）：使用添加谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（见材料表）。
3. 细胞松弛素D（CCD）：将市售产品（见材料表）用1 mL无水乙醇（200 proof）重悬，配制储备液。取20 μL储备液加入980 μL FACS缓冲液中，配制工作液，终浓度为2.5 μg/mL。
4. EDTA：储备液浓度为1 mg/mL。取100 μL储备液加入900 μL FACS缓冲液中，配制工作液，终浓度为1 mM。
5. 甘露聚糖（Mannan）：配制1 mg/mL的储备液（见材料表）。取100 μL储备液加入900 μL FACS缓冲液中，配制工作液，终浓度为500 μg/mL。
6. 分别配制萤光黄（10 μg/mL）（LY，一种荧光染料）、40 kDa葡聚糖（DX-40，500 μg/mL）和70 kDa葡聚糖（DX-70，500 μg/mL）：将市售试剂（见材料表）用无菌水重悬，配制成1 mg/mL的溶液。
7. 荧光素（FITC）标记的细菌：在避光条件下，将Escherichia coli DH5α（见材料表）接种于100 mL添加50 µg/mL FITC的Luria Bertani（LB）培养基中，37 °C振荡培养过夜，使在540 nm处的光密度（OD）达到0.8。
   1. 将细菌以1000 × g离心10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，随后在60 °C加热20分钟。再洗涤一次，然后将细菌浓度调整至OD₅₄₀为0.8。此即为储备液。
   2. 取储备液按1:100稀释（1 mL储备液加入99 mL FACS缓冲液），配制工作液，并将终浓度调整为1.8 × 10⁸ 个细胞/mL。

2. 斑马鱼饲养

1. 将斑马鱼饲养在单通道流水系统中，使用脱氯的市政用水，并投喂高蛋白鱼粉和活体丰年虾至饱食状态。
2. 在6月龄时，从鱼缸中取出雌雄混合的斑马鱼，转移至研究实验室用于实验。此年龄段最适合从肾脏髓质中分离出数量最佳的白细胞⁹。

3. 细胞分离

1. 按照既定方法，使用三卡因（Tricaine）安乐死10条斑马鱼（约100 mL，含4 mg/mL磷酸盐缓冲的甲磺酸三卡因/升鱼用水）（参见材料表）⁹。
2. 将40 µm细胞筛置于50 mL锥形离心管中。
3. 取出肾脏髓质组织⁹，放入C管中，加入3 mL组织培养基，使用组织解离仪对组织进行匀浆。此为首选操作步骤。
4. 或者，可在细胞筛上用3 mL注射器的橡胶头端破坏组织。组织匀浆（或破碎）后，将悬液倒入置于50 mL锥形管上方的40 µm细胞筛中。
5. 将过滤后的悬液在16 °C下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于3 mL TCM中。重复此步骤两次。
6. 小心将细胞层加至3 mL经无菌过滤、密度梯度介质（1.077 g/mL）上，介质置于室温。
7. 随后在16 °C下以800 × g离心20分钟。确保离心机刹车调至最低档位，以防离心结束时细胞重新悬浮。
8. 从界面处小心吸取不透明的白膜层，转移至14 mL圆底管中。
9. 加入5 mL TCM，用巴斯德移液管混匀以洗涤细胞，在16 °C下以300 × g离心5分钟。
10. 重复该步骤，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于TCM中，终浓度约为1 × 10⁶ 细胞/mL。

4. 细胞活力检测

1. 为了监测细胞活力，使用碘化丙啶（PI）染色法评估细胞死亡。
   1. 向待分析的细胞中加入 PI（200 µg/mL），终浓度为每毫升细胞悬液加入 5 µL。在 PE/Texas Red 通道读取结果。
      注意：碘化丙啶可穿透死细胞膜上的孔洞，从而对死细胞进行染色。本研究中测得的细胞活力为 85%。

5. 毒素孵育

1. 从分离的细胞悬液中吸取200 μL细胞，分别加入6孔组织培养板的每孔中（3孔用于对照，3孔用于毒素暴露），以便设置三组重复实验。
2. 向每孔中加入2 mL TCM。
3. 向其中三个孔中加入毒素（约2.5 μg/mL）。
   注意：毒素浓度应在实验开始前进行优化，具体浓度取决于所用毒素的类型。
4. 将组织培养板在设定的暴露时间下孵育。暴露时间应在实验开始前进行优化，并取决于所用毒素的性质。本研究中，暴露时间约为1小时。
5. 暴露结束后，将组织培养板置于冰上10分钟。
6. 小心地用移液器将每孔中的细胞反复吹打，以使贴壁细胞完全脱离培养板表面。
7. 将细胞从培养板中转移至14 mL圆底离心管中。
8. 在16 °C下以300 × g 离心5分钟。用3 mL FACS缓冲液重悬细胞，重复该步骤两次。
9. 将细胞重悬于1.5 mL FACS缓冲液中。
   注意：对于体内实验，将斑马鱼暴露于毒素（浓度与上述相似），然后进行细胞分离。

6. 胞吞作用检测

1. 分装 100 μL 将细胞加入5 mL流式细胞术管中。每孔标记四个复管，分别如下：（1）LY，（2）DX40，（3）DX70，（4）FITC-E. coli
2. 按照步骤1.6和步骤1.7所述，将荧光染料加入相应的试管：向试管（1）加入50 μL LY，向试管（2）加入50 μL DX40，向试管（3）加入50 μL DX70，向试管（4）加入50 μL FITC-E. coli 至第4个离心管。
3. 孵育1小时。加入200 μL 每管加入 FACS 缓冲液。
4. 以 400 x g 离心细胞 g 在16 °C下孵育5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于200 μL FACS缓冲液中。重复此步骤三次。进行流式细胞术分析。

7. 流式细胞术

1. 通过流式细胞术观察细胞群体并收集数据。具体细节请参见 Hohn 等人⁹ 的研究。
2. 在第一步中识别目标细胞群体。利用侧向散射（SSC，通常为纵轴）去除位于图左侧最远端的碎片和固缩小细胞，利用前向散射（FSC，通常为横轴）去除位于图底部的相同碎片。
3. 排除双联体信号（即被重复计数的细胞）。此步骤通过脉冲几何门控（FSC-H × FSC-A）实现。
4. 确定背景信号。对每种使用的荧光染料，分别运行仅细胞的荧光对照和同型对照，以识别背景荧光水平。
   注意：每种荧光染料均有其独特的背景荧光水平，受细胞自发荧光和非特异性结合的影响。这有助于区分真实阳性信号与背景荧光。在根据荧光信号识别和设门细胞群体时，需从阳性事件数中减去这些对照值，所得数值即为用于分析的数据。
5. 运行样本并识别需设门的细胞群体。利用 FSC 和 SSC 对混合细胞中的不同细胞群体进行形态学表征与识别。
   注意：FSC 主要与细胞大小相关。较大的细胞在前向散射更多光，产生较高的 FSC 值；较小的细胞散射光较少，FSC 值较低。不同大小的细胞会形成不同的聚类。例如，体积较小的淋巴细胞可能表现为一个独立的聚类，其 FSC 值低于粒细胞。SSC 与细胞的颗粒度、复杂性及内部结构相关。胞质颗粒较多的细胞具有较高的 SSC 值。相似类型的细胞会聚集在一起。例如，中性粒细胞含有胞质颗粒，其 SSC 值高于淋巴细胞。
6. 运行所有样本，并根据 FSC/SSC 对目标细胞群体设置门控区域。门控区域的设定基于细胞密度及感兴趣的细胞群体。
7. 将门控区域绘制到直方图上，分析每个门控区域内 FITC 在蓝光激光激发下于 495 nm / 519 nm 处的平均荧光强度（MFI）。
8. 将软件测定的细胞计数导出至分析程序中的 Excel 文件。
9. 使用统计分析软件包进行数据分析（见 材料表）。
10. 比较对照组细胞各群体的 MFI 与毒素处理组细胞群体的 MFI。

8. 毒素对内吞机制的影响以及抑制剂CCD、EDTA和甘露聚糖对内吞机制的作用

注意：细胞摄取液体或颗粒时，细胞质会主动运动。这一运动需要多种结构元件和信号通路的参与。生物毒素可能影响其中任意元件或通路。通过比较特定已知抑制剂的作用效果，有助于阐明生物毒素可能的作用机制¹¹。

1. 按照步骤3所述进行细胞分离。
2. 将100 μL细胞分装至5 mL流式细胞术管中（每孔取四个重复管）。
   注意：按如下方式标记试管：(5) CCD + LY（CCD通过抑制微丝和微管重排来抑制胞饮作用；LY用于评估微胞饮介导的液体摄取）⁹；(6) EDTA + DX40（EDTA阻断Ca²⁺依赖性受体介导的吞噬作用和微胞饮作用，用于检测摄取是否涉及钙依赖性机制）；(7) EDTA + DX70；(8) EDTA + FITC-E. coli；(9) 甘露聚糖 + DX40（甘露聚糖抑制甘露糖受体介导的特异性摄取，用于检测MR依赖性内吞作用⁹）；(10) 甘露聚糖 + DX70；(11) 甘露聚糖 + FITC-E. coli。
3. 加入抑制剂：向试管(5)中加入1 μL CCD；向试管(6–8)中加入10 μL EDTA；向试管(9–11)中加入100 μL甘露聚糖。按照步骤1中所述浓度操作。孵育5分钟。
4. 向相应试管中加入荧光标记物：向试管(1)和(5)中各加入50 μL LY；向试管(2)、(6)和(9)中各加入50 μL DX40；向试管(3)、(7)和(10)中各加入50 μL DX70；向试管(4)、(8)和(11)中各加入50 μL FITC-E. coli。孵育30分钟。
5. 向每管中加入200 μL FACS缓冲液。在16 °C下以400 × g离心5分钟。
6. 倾去上清液，将细胞重悬于200 μL FACS缓冲液中。重复步骤8.5–8.6两次。
7. 按照步骤7在流式细胞仪上检测样品。

结果

内吞作用检测利用从密度梯度中分离的混合白细胞，并通过细胞大小和颗粒度对吞噬细胞和淋巴细胞进行圈选，以确定特定细胞机制是否因毒素暴露而发生改变。首先，根据细胞的大小和颗粒度对细胞进行圈选¹⁰。死亡、破碎或正在凋亡的细胞会显示在散点图的左下角，予以排除，不纳入吞噬作用分析。吞噬细胞圈选范围包括巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和粒细胞，而淋巴细胞圈选范围则包括淋巴细胞、具有吞噬功能的B细胞以及非特异性细胞毒细胞（NCCs）（图1）。

吞噬作用通过检测FITC标记颗粒的摄取来确定，使用蓝色激光在495 nm / 519 nm处读取荧光信号。通过扣除对照细胞和同型对照所发出的平均荧光强度（MFI），可消除背景自发荧光和非特异性结合荧光。每种抑制剂均应进行剂量-反应曲线实验，以确定其使用浓度。若经待测毒素处理的细胞在流式细胞术中的结果与经抑制剂处理的细胞结果相同，则表明该毒素产生类似效应，可能抑制了相同的内吞机制。若毒素与抑制剂的效应具有叠加性，则提示该毒素可能通过与抑制剂不同的机制抑制内吞作用。

比较未处理细胞与经待测毒素处理的细胞（图2）、经毒素或抑制剂处理的细胞（图3A）以及仅经抑制剂处理的细胞（图3B）。代表性结果表明，经微囊藻毒素处理的细胞受到抑制，与经CCD处理的细胞相似。这些结果证明微囊藻毒素抑制了胞饮作用介导的液体摄取。门控细胞采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析，结果应以FITC阳性细胞的平均数量表示。

图 1：基于前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）特征的野生型斑马鱼肾脏组织分离白细胞的代表性流式细胞术散点图。 吞噬细胞门控包括巨噬细胞/单核细胞和粒细胞（占门控细胞的23%）。淋巴细胞门控包括淋巴细胞、具有吞噬功能的B细胞以及非特异性细胞毒细胞（NCCs）（占门控细胞的26%）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：暴露于毒素后，在 图 1 中设门的吞噬细胞的平均荧光强度（MFI）。 试管（1）显示未染色细胞，而试管（2）中的细胞因摄取LY而发出荧光。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：在图1中设门的吞噬细胞的平均荧光强度（MFI）。 无细胞松弛素D（CCD）抑制剂存在时对荧光黄（LY）的摄取（A）；有CCD存在时对LY的摄取。试管（1）显示未染色细胞，而试管（2）中的细胞因摄取LY而发出荧光。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：本实验方案所涉及步骤的概览。 *斑马鱼暴露于生物毒素的时间和程度将根据所使用的特定生物毒素以及不同机构的动物护理和生物安全法规与规程而有所不同。**所用目标浓度和暴露时间应在实验前进行优化，并取决于所使用的毒素类型。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

利用流式细胞术对斑马鱼白细胞进行分析，为深入研究免疫系统、评估环境毒素的影响以及推动毒理学研究提供了一种强大且多用途的方法。该方法能够快速有效地评估毒素对免疫细胞及免疫应答的作用。实验结果揭示了参与其中的体液因子，并提示了鱼类生理学和代谢过程与环境生物毒素之间的相互作用。本方案的总体流程如图4所示。

然而，这些方法也存在一定的局限性。与其他模式生物相比，制备用于流式细胞术的斑马鱼白细胞过程可能更为复杂。斑马鱼体型较小，限制了可用于分析的血液量以及白细胞的数量^9,10。这些操作需要将组织解离以获得单细胞悬液，而细胞活力可能影响结果的准确性。与小鼠等模型相比，可用于斑马鱼的免疫学工具种类较为有限，例如针对斑马鱼细胞标志物的特异性抗体就相对稀少。这一限制可能影响对斑马鱼白细胞进行深入分析的能力。此外，流式细胞术数据的解读需要专业知识，尤其是在处理复杂的免疫反应时。数据的误读可能导致错误的结论，特别是在环境毒素影响的研究背景下。

可将未添加抑制剂的细胞样本结果与添加了抑制剂的细胞样本结果进行比较。应将添加了毒素的细胞样本结果与添加了抑制剂的细胞样本结果进行比较。如果细胞骨架重排受到影响，则LY的摄取将受到限制。如果毒素抑制了DX-40或DX-70的摄取，则不同粒径的颗粒将不会被吞噬。如果细胞未摄取FITC-E. coli，则表明毒素已抑制了吞噬作用。

综上所述，斑马鱼是研究环境毒素对免疫细胞影响的优良模型。本实验方案介绍了一种利用流式细胞术和斑马鱼白细胞筛选生物毒素的方法，特别关注内吞作用和吞噬作用过程¹¹。本研究的目的是确定毒素暴露是否会影响吞噬性白细胞摄取病原体的能力，并阐明其对特定内吞机制可能产生的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 胎牛血清	Gibco	A3160501
14 mL 圆底离心管	BD Biosciences	352059
40 µm 细胞滤筛	Corning	07-201-430
5 mL 流式细胞术管	BD Biosciences	352235
50 mL 锥形离心管	Corning	14-959-49A
无水乙醇	Fisher	BP2818-500
自动细胞计数仪	Life Technologies Countess II FL		用于细胞活力研究
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A3059
细胞松弛素 D（CCD）	Sigma	C8273-5MG
葡聚糖 40	Sigma	FD40-100MG
葡聚糖 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5α（或其他实验室常用细菌菌株）	New England Biolabs	C29871
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	ED4SS
流式分析软件	Novoacea 软件
流式细胞仪	Novocyte 3000
荧光素	Fluka BioChemica	46950
不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
荧光黄	Sigma	L0259-25MG
甘露聚糖	Sigma	M7504-250MG
磷酸盐缓冲液	Sigma	P3813
含 GlutaMax 的 RPMI-1640 培养基	Gibco	61870036
统计学软件	SPSS
毒素
三卡因	Western Chemical Inc	NC0342409