斑马鱼心脏淋巴功能研究中的心肌内注射

摘要

本方案可实现将荧光微球（MS）和量子点（QD）高效且稳定地递送至活体鱼类心肌组织，并可在一段时间内对其进行追踪观察。

摘要

斑马鱼已被证明是研究胚胎后发育和再生过程中心血管形成与功能的重要模型。本实验方案描述了一种将荧光示踪剂注入斑马鱼心肌以研究间质液和碎片被心脏淋巴管摄取的方法。具体操作为注射微球（直径200 nm）和量子点（<10 nm 直径）被引入活体斑马鱼的心肌中，可通过以下方法进行追踪： 离体 共聚焦显微镜。随后在数小时内间歇性追踪这些示踪剂，以观察其从心肌清除并进入心脏淋巴管的过程。量子点 通过心脏淋巴管从心脏运输出去，而较大的微球 在注射部位保留超过三周。该心肌内注射方法可拓展至其他应用，包括注射包封的间充质干细胞（MS）或水凝胶，以向心脏特定区域局部释放细胞、蛋白质或目标化合物。

引言

淋巴系统对于维持组织液平衡、损伤后免疫反应的调节以及肠道内脂质的吸收至关重要¹。越来越多的证据表明，淋巴系统在多种疾病和发育过程中具有广泛作用。然而，由于淋巴管难以观察且其功能常不明确，相关机制研究受到限制。早期的成像技术依赖于淋巴系统自然吸收注射示踪剂的能力，即示踪剂首先进入组织间隙，随后被运输通过淋巴管网络，从而实现检测与可视化¹。该方法不仅可用于观察淋巴管结构，还可用于量化其从组织中摄取液体和大分子物质的能力。

庞大的淋巴网络还包括心脏淋巴系统，研究表明其在斑马鱼的再生过程中发挥着关键作用^2,3,4。了解不同物种间淋巴功能的差异与相似之处，对于将这些知识应用于临床至关重要。因此，有必要探索能够在不同模式生物中测量和可视化淋巴功能的技术^5,6。淋巴管为盲端血管，负责将液体单向运离组织⁷。要观察心脏组织的淋巴引流，需注射荧光染料至心肌内。心肌内注射在临床上以及哺乳动物的临床前模型中也已被用于移植干细胞和祖细胞，或外源性化合物（如水凝胶），以评估心肌梗死后心脏功能的改善情况^8,9,10。然而，斑马鱼的心肌内注射技术尚未被详细描述，这限制了此类实验方法在斑马鱼心脏研究中的应用。

先前已有文献详细描述了向斑马鱼心包腔以及心脏管腔内的系统性血流进行注射的方法^11,12，并且已有成功在成年斑马鱼中心肌内注射荧光示踪剂的报道²。本文提供了一种在成年斑马鱼中进行心肌内注射的详细实验方案。目前已有多种转基因斑马鱼品系可用于识别淋巴管；然而，仍需探索在缺乏转基因标记的情况下研究淋巴引流或可视化淋巴系统的策略。本方法采用荧光示踪剂、微球（MS）和量子点（QD）来观察注射部位以及液体向心脏淋巴系统的流动情况。QD 是直径小于<10 nm 的荧光纳米晶体，其光学特性可调节并适用于多种生物医学应用^13,14。当间质注射时，QD 可被淋巴管迅速摄取，但不会进入血管系统^15,16。MS 是直径约为 200 nm 的荧光包被聚苯乙烯微珠¹⁵。因此，MS 显著大于 QD，并且在注射入心肌后具有更强的持久性，有助于持续识别注射位点。该方法可用于研究心脏再生过程中的淋巴系统功能，也可通过稳定地局部引入包被微珠、水凝胶或细胞制剂，拓展应用于心脏生物学多个方面的研究。

方案

所有动物实验均经威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 2020-0027），并遵循适当的指导原则。以下实验使用受精后 14 至 20 个月的成年雄性和雌性 AB 野生型斑马鱼，以及受精后 35 天的幼年斑马鱼进行。

1. 玻璃毛细管拉制与试剂准备

1. 使用拉针仪（见图1A、B）（参见材料表），将外径为1.2 mm的标准硼硅酸盐玻璃毛细管在最佳参数下拉制成两根针。本实验中参数设置为：加热值525；拉力65；速度60；时间250。
2. 涡旋混匀市售的MS（水中含1%固体）和QD（2 µM，参见材料表）储备胶体溶液。
   注：MS胶体溶液呈白色，注射时易于观察。
3. 将500 µL MS储备胶体溶液通过0.45 µm针头滤器（参见材料表）过滤，以减少针头堵塞。
4. 制备仅含MS的工作胶体溶液时，取100 µL过滤后的MS胶体溶液与100 µL 1× PBS（磷酸盐缓冲液）混合稀释。
5. 制备含MS和QD的工作胶体溶液时，将100 µL过滤后的MS胶体溶液与100 µL QD胶体溶液混合。
   注：根据实验需求，MS和QD可混合后注射，也可分别单独注射。
6. 准备并摆放所需试剂与设备：体视显微镜、湿润海绵、显微操作仪、注射仪、20 µL移液器、三卡因溶液、直式虹膜剪、镊子、拉制好的针头、微载样毛细吸头（microloader femtotips）、恢复用培养缸及捞鱼网，如图1D所示（参见材料表）。
7. 打开注射仪的气源，设置为门控注射脉冲模式，而非定时注射脉冲模式。
   ​注：仪器具体操作细节请参见材料表。某些仪器需将脚踏开关插入仪器背面的门控输入端口。

2. 注射工作站准备与斑马鱼准备

1. 打开体视显微镜并调节焦距。
2. 使用微量移液器吸头，加入对照溶液（例如，含0.05%酚红的1×PBS）。
3. 将注射针插入显微注射仪的针夹中。
4. 在体视显微镜下，用镊子从针尖起1 mm处剪断拉制好的注射针。
   注意：尽可能剪出较细的针尖有利于穿刺心肌组织。然而，若针尖过细，在穿透心脏组织时可能发生弯曲。
5. 将注射压力设定为约0.50 kPa/7.3 psi，平衡压力设为约0 psi，以防止液体回流进入针内（图1C）。
6. 达到所需压力后，测试注射装置，并记录将体积小于1 mm直径（<0.5 µL）的溶液注入矿物油所需的时间。
   注意：理想情况下，注射应以约50 nL/s的速度释放液体，使得在5秒内形成的液滴直径约为0.8 mm。根据针尖直径的不同，可通过调整注射时间和压力，使单条鱼在5秒内接受0.25–0.3 µL的注射量。相较于延长注射时间，较高的注射压力更有利于克服组织间较高的静水压力。
7. 用选定体积的注射溶液（例如，10–15 µL，图1B）装填注射针，并重复步骤2.5–2.6。
   注意：门控注射模式允许脚踏开关按下期间持续注射，从而可在找到合适的组织内注射位点前，灵活调整针尖位置。
8. 将装有注射溶液的针插入显微注射仪的针夹中。

3. 注射

1. 通过在海绵中央雕刻出类似鱼的轮廓来制备带凹槽的海绵。
2. 通过将4.2 mL的储存液（4 mg/mL）加入100 mL鱼类养殖用水中，配制工作浓度的三卡因（见 材料表在结晶皿中。
3. 将斑马鱼置于三卡因溶液中麻醉，直至其鳃部运动减缓且停止游动。
   注意：捏尾以确认麻醉后斑马鱼反应消失。
4. 将斑马鱼腹侧朝向物镜，置于解剖显微镜下湿润的带槽海绵中图2A 和 图3A).
5. 使用虹膜剪在胸鳍水平处做一个小的横向切口，并打开胸腔补充视频 1).
6. 用镊子轻轻剥离心包膜，以暴露心脏心尖图3B).
7. 用手持已装针的持针器，将针尖以锐角指向心室的顶端 <与身体轴线成30°角。
8. 将一根0.1–0.2 mm的针插入心脏，注意不要过深刺入心室（图2B 和 图3B).
   注意：若针尖端充满血液，应将针头略微回撤，以避免将 MS 和 QD 注入心室腔内。
9. 将针插入心尖后，通过减小针头与身体长轴之间的角度，同时将针尖朝向心脏基底部移动，轻轻抬起心室使其稍离体壁图 2C 和 图3C).
   注意：针头可能在心肌壁中隐约可见。
10. 将针头进一步向头部推进，使针尖朝向心肌表面移动。
11. 通过踩下显微注射装置的脚踏板进行注射，持续约1-5秒，或直至心肌组织内出现可见的白色斑点图2C 和 图 3C，D).
12. 如果在注射过程中胸腔开始充满注射液，表明针尖已完全穿透心肌图2D缓慢撤出针头，直至在组织内可见微珠聚集。
13. 如果液体被注入心室腔并在随后的心跳中被清除，则需重新调整针尖位置（图2E此时，抬起针尖并向头部方向推动针头，直至注射压力使组织出现白色斑点。
14. 若未见白色液体或斑点，则表明注射针头堵塞。此时应完全回撤针头。为继续实验，可轻微折断针头尖端或更换针头。无论采用哪种方式，在重新注射心肌前均需检查注射液流情况。
15. 注射成功后，轻柔地将针头从心肌中撤出（图3F并将斑马鱼立即转移至含有养殖设施用水的恢复缸中。
16. 监测鱼类直至其完全从三卡因麻醉中恢复。
17. 将回收的鱼转移至2.8 L的水族箱中，并置于鱼类养殖设施内，直至达到心脏提取所需的时间点。

4. 心脏提取与成像

1. 在培养皿中，将4.2 mL储存液（4 mg/mL）加入100 mL鱼类养殖用水中，配制工作浓度的三卡因溶液。
2. 将斑马鱼置于三卡因溶液中进行终末麻醉，直至鳃部运动停止且无反应。
3. 将斑马鱼转移至解剖显微镜下湿润的带槽海绵上，腹部朝向物镜。
4. 使用虹膜剪在胸鳍水平处切开胸部腹壁。
5. 打开心包膜，找到心脏的流出道。用镊子夹住动脉球（BA）前方的主动脉，并小心将其连同心室基部一起提起。
6. 当心脏前极被抬起后，剪断腹主动脉/静脉窦，取出心脏并置于含有PBS的35 mm培养皿中。
7. 使用镊子去除任何血凝块，并将心脏在4% PFA（wt/vol）中固定15分钟。
8. 使用能够检测所用荧光波长的显微镜对心脏成像。
   注：在示例数据中，使用了配备405、488、567和647激光线的共聚焦显微镜。
9. 使用ImageJ/Fiji软件（见材料表）进行图像分析。
   注：量子点（QD）或微球（MS）富集度的计算，首先利用“高/低阈值设定”（thresholding）和“创建选区”（create selection）功能，基于淋巴管通道选择淋巴管区域以及无血管信号的区域；随后使用“测量”（Measure ）功能，分别测量QD或MS通道的像素强度，并计算两个选区之间的比值。

结果

注射后应立即可见心肌壁上出现一个小的白色区域（图3F）。该区域会显示出注射的微球（MS）和量子点（QD）明亮的荧光标记（图4B、E）。此外，操作后心脏外表面可能出现微弱且零星分布的荧光点状信号，来源于心包腔内的QD和MS（图4B、E）。可随时间追踪注射的示踪剂。为此，需将斑马鱼处死，取出心脏，并如前所述置于共聚焦显微镜下观察¹⁶。

注射后1天，注射部位仍可观察到微球（MS），部分微球滞留在心房和动脉球（BA）的外表面（图4B）。微球在心肌中可稳定存在超过3周（图4C、D），表明其可用于递送外源性化合物或细胞（补充图1

讨论

本文介绍了一种将外源性物质导入斑马鱼心肌的方法。该技术最初是为了将量子点（QD）和微球（MS）导入心肌，以研究稳态和再生过程中的淋巴功能而开发的^2,18。类似的方法也已被用于将量子点导入小鼠心肌，以探究心肌梗死后淋巴系统的存在及其功能^19,20。

针尖在心肌中的穿刺与定位是该操作的关键步骤。玻璃毛细管必须足够锋利，以穿透致密的心肌组织，同时具备足够的刚性，避免在抬举心脏以定位注射位点时因受力而弯曲。通过调节用镊子缩小尖端尺寸的程度，可在这两种尖端特性之间达到最佳平衡。采用较小的注射角度最有利于将针尖刺入心肌壁。由于心脏持续搏动，对选定部位进行注射具有挑战性。因此，必须以受控方式实施注射：首先将针尖轻置于搏动的心脏表面，并轻微移动以调整注射位点。当针尖接触搏动的心脏时，还需进一步调整注射角度，以确保在最终施加足够力量穿刺心肌时，针尖与心肌表面保持垂直&...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
结晶皿	VWR	89000-288
解剖显微镜	Zeiss	495010-0007-000
鱼类养殖系统用水	N/A	N/A	添加海盐和碳酸氢钠的反渗透水，电导率为 226 µS，pH 为 7.35
镊子	Dumont	11252-20
玻璃毛细管	WPI	1B120-3	无丝
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
虹膜剪	精细科学工具公司	15000-00
微量注射仪	Warner Instruments	64-1735
微量移液吸头（Microloader femtotips）	Eppendorf	5242 956.003
微电极拉制仪	Sutter Instrument	P-97	带脚踏开关控制
微球	赛默飞世尔科技	B200	蓝色
PBS	Corning	46-013-CM
量子点（QD）	赛默飞世尔科技	Q21061MP	Qtracker705 血管标记物
海绵	任意	任意	尺寸为 (1.5 × 5 × 3 cm)，带凹槽 (0.5 × 2.5 cm)
注射器滤器	Corning	431220
三卡因（Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040	浓度：4 mg/mL