方法文章

利用统计学方法对重组几丁质脱乙酰酶在 E. coli Rosetta pLysS 细胞中表达的过程评价与动力学研究

DOI：

10.3791/64590

⸱

2023年3月10日

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

本文内容

摘要

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在本实验方案中，采用了一种统计学技术——中心复合设计（central composite design, CCD），以优化重组细菌壳聚糖脱乙酰酶（chitin deacetylase）表达的工艺条件。钡CDA）在 E. coli Rosetta pLysS 细胞。使用 CCD 导致表达量和活性增加了约 2.39 倍 BaCDA

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，利用壳多糖脱乙酰酶（chitin deacetylase）将壳多糖脱乙酰化为壳聚糖的绿色制备途径日益受到重视。通过酶法转化获得的、具有类似天然特性的壳聚糖在生物医学领域具有广泛的应用前景。已有多种来源于不同环境的重组壳多糖脱乙酰酶被报道，但尚无针对这些重组酶生产过程优化的研究。本研究采用响应面法中的中心复合设计，以最大化重组细菌壳多糖脱乙酰酶（BaCDA）的生成在 E. coli Rosetta pLysS。优化后的工艺条件为：0.061% 葡萄糖浓度、1% 乳糖浓度、培养温度22 °C、振荡速度128 rpm，发酵时间30 h。在优化条件下，乳糖诱导的表达在发酵16 h后开始。最大表达量、生物量及 钡CDA 活性在诱导后 14 小时记录。在优化条件下，该 Ba表达的CDA活性 钡CDA 活性提高了约 2.39 倍。工艺优化使总发酵周期缩短了 22 小时，诱导后的表达时间减少了 10 小时。这是首次报道采用中心复合设计优化重组壳聚糖脱乙酰酶表达工艺并进行动力学表征的研究。采用这些最佳培养条件，有望实现对研究较少的单细胞脱乙酰酶的低成本、大规模生产，为生物医学级壳聚糖的绿色制备开辟新途径。

引言

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几丁质是一种结构为β-1,4-糖苷键连接的天然聚合物，是自然界中继纤维素之后含量第二丰富的多糖。尽管如此，由于其不溶性，几丁质在工业上的应用受到限制1这一瓶颈通过将壳聚糖进行处理来解决 N-脱乙酰化，赋予聚合物正电荷，并提高所得壳聚糖的溶解性1几丁质可通过化学法和酶法两种不同途径转化为壳聚糖。壳聚糖在生物医学领域的应用需要实现可控且明确的脱乙酰化，而化学法在此方面存在局限性。2,3. 可利用几丁质脱乙酰酶（CDAs）克服这一局限，该方法是一种用于脱乙酰过程的绿色酶催化途径4,5.

壳聚糖脱乙酰酶属于碳水化合物酯酶4（CE-4）家族，该家族定义于碳水化合物活性酶（CAZY）数据库中。CE-4家族的酶具有保守区域，即NodB同源区或称多糖脱乙酰酶结构域。中心复合设计（CCD）是一种统计学工具，已被用于多种野生型壳多糖修饰酶的优化6,7,8,9。然而，使用野生型生物体的下游步骤较为繁琐，因此研究逐渐转向重组酶的应用10,11,12,13,14,15,16,17。近年来，来源于海洋的嗜盐重组CDA因其在工业应用中的便利性以及在制备医用级壳聚糖方面的潜力而受到重视18,19。

在大肠杆菌（E. coli）中进行重组酶的生产存在工艺上的限制，且需要优化培养基，因为其在E. coli中的表达水平取决于所使用的基因和质粒20。因此，筛选合适的工艺条件和营养参数变得至关重要。一次单因素法（OFAT）是一种常用的优化方法，但需要耗费大量资源和时间来进行逐步实验。该方法缺乏关于各参数之间相互作用的统计学信息20,21,22,23。因此，本研究采用响应面法（RSM）中的中心复合设计（CCD），以研究嗜盐细菌壳聚糖脱乙酰酶（BaCDA）在E. coli Rosetta pLysS中的表达产量及BaCDA酶活性。在 E. coli宿主中用于表达优化的参数包括乳糖浓度、葡萄糖浓度、培养温度、摇床转速和培养时间。在大多数E. coli表达研究中，通常使用LB（Luria Bertani）培养基并添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂。然而，添加IPTG需要持续监测细胞生长情况24，而在发酵过程中频繁操作也增加了污染风险。因此，研究团队已逐渐转向使用含乳糖的TB（terrific broth）培养基作为诱导体系。 使用乳糖替代IPTG可有效解决上述问题：大肠杆菌消耗乳糖并产生别乳糖作为副产物，从而实现自诱导表达。这种自诱导培养基还含有甘油，已被证明可提高重组蛋白的表达产量25。  通过进一步优化工艺参数，可在TB培养基中更高效地实现重组蛋白的过表达。在本研究中，采用中心复合设计来优化嗜盐性BaCDA在E. coli Rosetta pLysS细胞中的异源表达。所选工艺参数为培养温度、摇床转速和培养时间，评估的营养参数为葡萄糖和乳糖浓度。通过预测所得的最优条件进行嗜盐BaCDA的表达，并利用SDS-PAGE进行验证。

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方案

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1. 表达培养基与培养条件

  1. 采用热激法将含有BaCDA基因的pET-22b质粒转化至E. coli Rosetta pLysS感受态细胞中，具体操作如文献15所述。
    注意：操作微生物时需格外小心。所有微生物实验均须在生物安全柜内进行，以避免污染。
  2. 在含有0.05%（w/v）葡萄糖和0.2%（w/v）乳糖的TB培养基中，于16 °C、180 rpm条件下进行初步表达研究。将6.792 × 107 个携带BaCDA克隆质粒的E. coli Rosetta pLysS细胞接种于100 mL培养基中，培养至对数生长后期（稳定期）。在此所述培养条件下，E. coli Rosetta pLysS细胞的600 nm光密度（OD600）达到10.85 ± 0.21。
    注意：TB培养基的组成（% w/v）：胰蛋白胨，1.2；酵母提取物，2.4；甘油，0.6；以及1× TB盐（17 mM KH2PO4 和 74 mM K2HPO4）17。

2. 优化与实验设计

  1. 使用统计工具软件设计实验，并在中心复合设计中拟合二阶多项式模型。本研究使用的统计软件为 MINITAB 17.0（试用版）。
    1. 具体操作为：打开软件，依次点击以下按钮：Stat > DoE > Response surface > Create response surface > Response design > Central composite，输出将显示为一个对话框。
  2. 在对话框中输入五个参数：培养温度、摇床转速、培养时间、葡萄糖浓度和乳糖浓度，每个参数设置五个水平（-2、-1、0、+1、+2）。
    1. 具体操作为：在对话框中输入各参数及其对应水平，填写所有参数的详细信息后点击OK。软件将生成实验设计矩阵，包含中心点的六次重复，共需进行32次实验运行。软件生成的表格包含以编码和非编码形式表示的参数及其水平，用于后续通过中心复合设计（CCD）进行工艺优化（表1）。
  3. 根据软件生成的条件进行32次实验，并将实验结果填入由软件生成的实验设计矩阵中，该矩阵包含以编码和非编码单位表示的参数水平（表2）。
  4. 使用软件分析实验设计矩阵（表2）。具体操作为：打开软件，将响应值输入数据表中，然后选择 Response column > Stat > DoE > Response surface > Analyze response surface design > OK。软件将对输出结果进行统计显著性分析，并预测出相应的模型。

表1：实验设计中用于估算重组壳聚糖脱乙酰酶表达量的参数及其编码与非编码水平 E. coli Rosetta pLysS 感受态细胞 请点击此处下载此表格。

表2：实验设计矩阵，包含实验值与预测值 Ba重组壳聚糖脱乙酰酶的CDA活性（表达） E. coli Rosetta pLysS 感受态细胞 请点击此处下载此表格。

3. 模型验证

  1. 使用软件中提供的响应优化器工具验证所设计的模型。
  2. 在软件预测的最佳条件下重复发酵实验，并将实验值与软件预测值进行比较。
    1. 具体操作步骤如下：打开软件，依次选择 响应列 > 统计 > 实验设计（DoE）> 响应面 > 响应优化器 > 最大化 > 确定。输出结果为软件预测的最佳工艺条件及相应数值。在预测的最佳条件下重复发酵实验，并比较实测值与预测值。

4. 分析方法

  1. 表达、生物量及蛋白质定量
    1. 根据实验设计矩阵软件提供的32种条件进行发酵（表2）。每次运行后，于4 °C、5,405 × g 离心10分钟收集菌体沉淀。称量细胞沉淀以确定生物量产率。
      注：所有微生物操作均应在无菌条件下进行（例如，在生物安全柜内操作）。
    2. 通过超声破碎法裂解细胞沉淀，获得周质蛋白。每克细胞沉淀加入5 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，10 mM 咪唑），在60%振幅下进行10个循环的超声处理，每个循环脉冲10秒，间歇10秒。于4 °C、5,405 × g 离心10分钟收集裂解液。采用Bradford法测定蛋白质浓度26。
      注：为避免蛋白质变性，超声处理必须在低温条件下进行。超声过程中将样品置于冰上。
    3. 采用SDS-PAGE结合ImageJ软件分析BaCDA的表达。取10 µL可溶性细胞裂解液（周质蛋白）上样至12%双丙烯酰胺凝胶，在1×三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸-SDS（TGS）缓冲液中以100 V恒压电泳2小时。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色并脱色以去除背景27。
    4. 使用凝胶成像系统拍摄图像。通过ImageJ软件比较条带强度（以像素值表示）来确定BaCDA的表达水平。将BaCDA活性和生物量最低的实验组作为参考像素值28。
      1. 具体操作如下：打开软件并载入图像文件，使用矩形框选中每一泳道；进入分析菜单，将各泳道设为100%；再使用矩形框选中各泳道中过表达的条带；进入分析菜单测定条带强度，重复此过程处理所有泳道，并将结果导出为.xls文件。将BaCDA活性最低的实验组条带强度设为参考强度，据此分析各泳道的表达水平。
  2. 酶活性测定
    1. 使用乙酸盐检测试剂盒15测定BaCDA酶活性，以1 mg/mL的乙二醇壳聚糖（EGC）作为底物29。
    2. 取20 µL BaCDA与40 µL底物在40 µL 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7）中混合，于30 °C、800 rpm振荡条件下反应1小时。
    3. 反应1小时后，将100 µL反应液在4 °C、2,111 × g 条件下通过3 kDa超滤柱离心15分钟。弃去含有BaCDA的截留液，收集含有反应释放乙酸盐的滤液。使用该滤液进行乙酸盐测定，以确定BaCDA的酶活性。
      ​注：一个酶活力单位定义为每分钟每微升酶液从底物释放1 µM乙酸盐的活性。酶活性测定实验设三个重复，相应计算酶活力值。
  3. 乳糖诱导的发酵动力学
    1. 通过测定活性变化曲线，确定乳糖诱导的时间点及表达起始点。活性曲线基于优化后的发酵条件，通过测定生物量和BaCDA酶活性获得。
    2. 使用葡萄糖检测试剂盒测定培养基中的葡萄糖浓度。以生物量、葡萄糖浓度和BaCDA酶活性对发酵时间作图，绘制活性变化曲线。

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结果

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利用中心复合设计（CCD）优化在E. coli中表达周质重组酶几丁质脱乙酰酶的工艺
pET22b-BaCDA 质粒在未优化条件下培养时，最大生物量得率为 22.26 ± 0.98 g/L，BaCDA 活性为 84.67 ± 0.56 U/L15。本研究采用统计学方法中心复合设计（CCD），以确定在E. coli Rosetta pLysS 细胞中表达周质重组酶几丁质脱乙酰酶的最佳工艺条件。根据前期研究结果，选取了五个工艺参数：培养温度（A）、摇床转速（B）、培养时间（C）、葡萄糖浓度（D）和乳糖浓度（E）（表1）。周质重组酶几丁质脱乙酰酶的表达水平通过BaCDA 活性（U/L）进行定量表示（表2）。因此，将参数 A、B、C、D 和 E 作为外源参数，而将周质重组几丁质脱乙酰酶表达的BaCDA 活性选为内源参数（响应值）。实验设计矩阵显示，最高BaCDA 活性...

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讨论

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脱乙酰壳聚糖（即脱乙酰化的甲壳素）具有多种应用，尤其在生物医学领域30。然而，壳聚糖的乙酰化程度（DA）和乙酰化分布模式（PA）的可重复性是一个主要问题，此外还存在其他环境方面的担忧。因此，人们开始采用更环保的酶法途径。利用一系列壳聚糖脱乙酰酶（CDA），可以制备出具有特定脱乙酰化模式的壳聚糖，从而拓展其在生物医学领域的应用4,5。在我们之前的研究中，克隆的 BaCDA 基因已在 E. coli Rosetta pLysS 细胞中成功表达15。

BaCDA 在 37 °C 初筛条件下以包涵体形式表达。根据文献报道，采用较低的表达温度（即 16 °C）可在 TB 自诱导培养基中获得可溶性 BaCDA31。然而，在 16 °C 发酵 52 小时后，酶活性最高...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢卡纳塔克邦曼尼帕尔高等教育学院（MAHE）提供的MAHE UNSW基金，同时感谢科学与工业研究理事会 &印度政府科学与工业研究委员会—人力资源开发组（CSIR-MHRD）高级研究奖学金，资助函编号：09/1165(0007)2K19 EMR-I，日期：2019年3月31日。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂盒
乙酸盐检测试剂盒Megazyme, 爱尔兰K-ACETAK该方案已稍作修改并优化，以便在96孔板中进行检测
葡萄糖测定试剂盒Agappe 诊断有限公司，印度12018013该方案已稍作修改并优化，以便在96孔板中进行检测
化学品
乙酸Hi-media, 印度AS001用于配制SDS-PAGE染色和脱色溶液
丙烯酰胺Hi-media, 印度MB068用于配制SDS-PAGE凝胶
过硫酸铵Hi-media, 印度MB003用于配制SDS-PAGE凝胶
双丙烯酰胺Hi-media, 印度MB005用于配制SDS-PAGE凝胶
考马斯亮蓝 G-250Hi-media, 印度MB092用于配制SDS-PAGE染色和脱色溶液
考马斯亮蓝 R-250Hi-media, 印度MB153用于配制Bradford法蛋白测定试剂
乙二醇壳聚糖Sigma-aldrich, 美国E1502用于制备乙二醇壳聚糖，后者作为酶促反应的底物
D-葡萄糖Hi-media, 印度MB037用作培养基组分
咪唑Hi-media, 印度GRM1864用于裂解缓冲液
乳糖Hi-media, 印度GRM017用作培养基组分
甲醇Finar, 印度30930LC250用于配制SDS-PAGE染色和脱色溶液
氯化钠 (NaCl)Hi-media, 印度MB023用于裂解缓冲液
磷酸Hi-media, 印度MB157用于配制Bradford法蛋白测定试剂
十二烷基硫酸钠 (SDS)Hi-media, 印度GRM6218用于配制SDS-PAGE凝胶
无水磷酸氢二钠Hi-media, 印度MB024用于配制TB盐培养基及酶促反应缓冲液
无水磷酸二氢钠Hi-media, 印度GRM3964用于配制TB盐培养基及酶促反应缓冲液
四甲基乙二胺 (TEMED)Hi-media, 印度MB026用于配制SDS-PAGE凝胶
Tris碱Hi-media, 印度MB029用于配制SDS-PAGE凝胶
胰蛋白胨Hi-media, 印度RM7707用作培养基组分
酵母提取物Hi-media, 印度RM027用作培养基组分
设备
AlphaImager HP 凝胶成像系统ProteinSimple, 美国92-13823-00用于拍摄SDS-PAGE图像
台式混匀仪Eppendorf, 德国 9.776 660配备2 mL适配器，用于维持酶促反应过程中的混匀
恒温摇床Trishul 仪器公司，印度13410622用于在不同温度和转速（RPM）下培养细菌
生物分光光度计Eppendorf, 德国 6135000009用于所有光谱读数的测定
冷冻离心机Eppendorf, 德国 5805000017用于离心培养物、裂解液及其他所有需要离心的步骤
干式恒温器Labnet International, 美国S81522039用于SDS-PAGE前蛋白质样品的变性处理
微量移液器Eppendorf, 德国 3123000900在整个实验流程中用于体积量取
摇床振荡器Trishul 仪器公司，印度11770719用于SDS-PAGE凝胶的染色和脱色过程中的振荡
SDS-PAGE电泳装置Bio-Rad, 美国1658001FC用于SDS-PAGE凝胶的制备和电泳运行
超声破碎仪Sonics & Materials, Inc., 美国VCX 130用于通过超声处理裂解细菌细胞
电子天平Sartorius, 德国BSA124 S用于整个实验流程中的质量称量
装置
Nanosep 带Omega膜离心过滤装置（3 kDa）PALL 生命科学公司，美国OD003C33用于底物处理后酶的分离
软件版本开发单位
MINITAB17.0 （试用版） 宾夕法尼亚州立大学用于实验模型设计和数据分析
ImageJ1.53o美国国立卫生研究院 (NIH)用于基于SDS-PAGE图像分析蛋白表达水平
质粒
pET22b (+) DNA—NovagenMerck- Millipore, 美国69744储存于 − 20 °C
细胞
E. coli Rosetta pLysS—NovagenMerck- Millipore, 美国70956保存于含25%甘油的Luria–Bertani (LB) 肉汤中，置于 − 80 °C

参考文献

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