自组装人源间充质干细胞聚集体的构建、表征及其再生应用

摘要

本研究描述了一种基于人源间充质干细胞自组装构建细胞聚集体的方法，并确定了用于颅骨缺损再生治疗的形态学和组织学特征。

摘要

间充质干细胞（MSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能，可来源于多种组织，是再生医学领域极具前景的候选细胞，尤其适用于牙齿、骨骼、软骨和皮肤的再生。MSCs通过自组装聚集形成细胞团簇，模拟发育过程中的间充质凝聚结构，可实现高密度干细胞递送，同时保留细胞间的相互作用以及细胞外基质（ECM）所构成的微环境生态位。该方法已被证实能够有效促进细胞植入与存活，从而优化外源性MSCs在组织工程中的应用，并为临床器官再生提供保障。本文提供了一套基于脐带间充质干细胞（UCMSCs）构建和表征自组装细胞聚集体的详细实验方案，并展示了其在颅骨再生中的应用实例。本实验流程的实施将有助于指导建立高效的MSC移植策略，推动组织工程与再生医学的发展。

引言

间充质干细胞（MSC）的凝聚是确保机体在早期器官发生过程中正常生长和发育的关键阶段^1,2，尤其在骨骼、软骨、牙齿和皮肤的形成中起重要作用^1,3,4。在过去的几十年中，利用体外培养的出生后MSC结合可生物降解支架的组织工程疗法，在成骨⁵和软骨再生⁶方面取得了重要进展。然而，支架的使用可能存在一些缺点，例如免疫排斥反应以及细胞亲和性与可塑性较低⁷。针对这一问题，我们研究了采用球形细胞培养方法的可行性，以获得无支架、自组装的细胞聚集体，模拟发育过程中的凝聚现象，该聚集体仅包含MSC及其分泌的细胞外基质（ECM）⁸。细胞聚集体的形成提高了应用的可塑性，可适应缺损部位的形状，同时避免了支架植入以及通过蛋白水解酶消化来获取用于移植的MSC⁹。

MSC聚集体已广泛用于骨、牙髓、牙周组织和皮肤的再生¹⁰，以及其他组织和器官。可选择多种不同类型的间充质干细胞作为种子细胞候选，包括但不限于骨髓间充质干细胞（BMMSCs）、脐带间充质干细胞（UCMSCs）、脂肪组织来源基质细胞（ADSCs）以及牙源性间充质干细胞（例如， 牙髓间充质干细胞 [DPSCs]，来自乳牙的间充质干细胞 [SHED]¹¹以及牙周膜间充质干细胞 [PDLSCs]¹²近十年来，已开发出多种用于三维细胞聚集体的技术，包括辅助聚集和自组装聚集。然而，辅助聚集方法在产生细胞外基质以及形成均一且致密的聚集体方面往往效果不佳，因此不适合用于模拟生理条件^13,14,15此外，一些辅助聚集方法需要细胞与材料之间的相互作用以形成稳定的结构^16,17,18,¹⁹，而这种自组装聚集方法通常适用于多种间充质干细胞。值得注意的是，在我们近期的临床试验中，间充质干细胞聚集体在植入受损的人类切牙后，已成功用于牙髓-牙本质复合体及牙周组织的再生，且已实现 从头合成 具有生理结构与功能的组织再生^20,21.

本文提供了间充质干细胞聚集体构建与表征的详细步骤，以及 体内 移植。当研究人员致力于基于干细胞应用修复牙齿、骨、软骨和皮肤等组织缺损时，该方法将引起广泛关注。该方法简便易行，完全由细胞和细胞外基质（ECM）构成，无需额外支架材料，可长期培养以获得致密且稳定的细胞聚集体²²与此同时，以这种方式培养的细胞聚集体富含细胞外基质（ECM），可模拟这些高密度细胞发育所需的微环境，从而促进组织再生²³该构建过程可分为两个阶段：细胞准备与培养，以及细胞聚集体的自组装形成与收获。聚集体的表征包括形态学鉴定 通过 倒置光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM），以及组织学分析 通过 苏木精-伊红（HE）和马松染色。所形成的聚集体被用于再生性植入，以修复颅骨缺损。该方法的实施将有助于指导建立高效的间充质干细胞移植策略，推动组织工程与再生医学的发展。

方案

注意：所有动物实验程序均经第四军医大学动物护理与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究使用了从商业来源获得的冷冻保存的人脐带间充质干细胞（见材料表）。使用人源细胞的研究已获得第四军医大学伦理委员会批准。本实验以脐带间充质干细胞为例描述实验操作流程，以颅骨缺损为例说明修复需求并展示植入操作过程。所有实验均重复三次。

1. 构建脐带间充质干细胞聚集体

1. UCMSCs 的制备与培养
   1. 在无菌生物安全柜中，向一个新的 15 mL 离心管中加入 10 mL 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）。
   2. 从液氮中取出含有冻存 UCMSCs 的冻存管，迅速放入 37 °C 水浴中。轻轻摇动冻存管，以促进细胞快速且充分地解冻。
      注意：整个操作必须在 1 分钟内完成，因为冻存液中的二甲基亚砜（DMSO）可能具有细胞毒性。
   3. 将冻存管中的细胞轻轻悬浮，然后将全部内容物转移至含有 10 mL PBS 的离心管中（步骤 1.1.1）。在 100 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并用 10 mL PBS 洗涤细胞。
   4. 在 100 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用完全 α-最低必需培养基（α-MEM）轻轻重悬细胞，该培养基含有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素和 584 mg/L 谷氨酰胺。
   5. 将重悬的细胞接种至 10 cm 培养皿中（通常每管细胞接种一至两个培养皿，具体数量取决于离心后细胞总量，接种密度为每皿 5 × 10⁶ 个细胞）。向培养皿中加入完全 α-MEM 培养基，总体积为 10 mL。
   6. 轻轻摇动培养皿以使细胞分布均匀。将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育。过夜孵育后，弃去上清培养基，加入 5 mL PBS 洗涤 1–2 次以去除未贴壁细胞。加入 10 mL 新鲜完全 α-MEM 培养基。每 2 天更换一次培养基。
   7. 进行细胞传代时，当细胞融合度达到 80%–90%，弃去上清液，并用 5 mL PBS 洗涤细胞，彻底去除残留培养基。加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 孵育 2 分钟。
   8. 在显微镜下观察，当细胞变圆且细胞间连接断裂时，轻柔地使细胞从培养皿表面脱离，避免过度破坏细胞结构。加入 4 mL 完全 α-MEM 培养基以中和胰蛋白酶活性。
   9. 用移液器反复轻柔地收集培养皿中的细胞，并转移至新的 15 mL 离心管中。在 100 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用完全 α-MEM 培养基重悬细胞，接种至新的培养皿或孔板中。每 2 天更换一次培养基。
      注：根据缺损区域的大小，一个 25 mm³ 的缺损需要使用在 6 孔板中培养形成的细胞聚集体。
2. 细胞聚集体的形成与收获
   1. 通过向含有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 584 mg/L 谷氨酰胺的 α-MEM 中添加 50 µg/mL 维生素 C，制备细胞聚集体诱导培养基。
      注意：使用维生素 C 时应避免直接光照，因为维生素 C 在光照下易氧化失活。
   2. 当步骤 1.1.12 中的细胞融合度达到 95% 时（补充图 S1），更换为细胞聚集体诱导培养基；每 2 天更换一次新鲜的诱导培养基。
   3. 诱导 7–10 天后（诱导时间长短取决于干细胞类型，UCMSCs 边缘通常约为 7 天），在显微镜下观察具有明显厚边且与培养皿底部分离的聚集体形态。
   4. 弃去培养基，用 PBS 轻柔洗涤细胞 2 次。使用小型无菌镊子将聚集体从边缘轻轻推向中央，并折叠聚集体。
   5. 在某些情况下，UCMSCs 可自发向中心卷曲，形成致密的凝聚结构。该结构等同于步骤 1.2.4 中获得的聚集体。

2. 聚集体的形态学鉴定

1. 大体与显微观察
   1. 观察发现，细胞聚集体致密且结构完整，不易因机械力（如分离和移植过程中的牵拉）而受损。
   2. 在显微镜下观察，可见具有一定厚度、呈编织状的膜样结构。
2. 活/死细胞染色
   1. 将细胞以每孔 1 × 10⁶ 个细胞的密度接种于 6 孔板中。
   2. 使用 PBS 配制 2 µM 钙黄绿素 AM 和 4 µM 碘化乙啶-1（EthD-1）工作液。
   3. 向细胞中加入 0.3% Triton，作用 5 分钟，随后用 PBS 洗涤三次，以诱导细胞死亡，作为染色的对照组。
   4. 用 PBS 将细胞、细胞聚集体及诱导死亡的细胞各洗涤两次。
   5. 向每孔中加入 100 µL PBS 和 100 µL 步骤 2.2.2 中配制的染色液。
   6. 室温孵育 30 分钟，再用 PBS 洗涤两次。
   7. 向每孔中加入 200 µL 浓度为 10 µg/mL 的 Hoechst 溶液，室温孵育 5 分钟，再用 PBS 洗涤两次。
   8. 在荧光显微镜下观察。
3. 扫描电镜（SEM）观察
   1. 接种并诱导获得步骤 1.2.4 或 1.2.5 中的细胞聚集体。在步骤 1.2.4 或 1.2.5 形成聚集体后，用 PBS 洗涤细胞。
   2. 使用戊二醛固定细胞，时间不少于 4 小时。
   3. 用 PBS 洗涤样品，然后依次用 30%、50%、70%、80%、90% 至 100% 的梯度乙醇溶液进行脱水处理，每次 5 分钟；最后用无水乙醇处理两次。
   4. 将聚集体浸入 3 mL 六甲基二硅氮烷（hexamethyldisilazane）中，作用 30 分钟。吸除全部液体后，自然彻底干燥。
      警告：整个操作过程必须在通风橱中进行，因为六甲基二硅氮烷具有挥发性且高度有毒。
   5. 用双面导电碳胶将干燥后的样品固定于样品台，并对样品表面进行金属镀膜。样品可在室温（RT）下保存数天。
   6. 在扫描电镜下观察。
      1. 将样品放入电镜腔内，调节仪器电压至 5 kV，焦距至约 12 mm，调节焦距调节杆直至出现清晰图像。
      2. 先在低倍镜下拍摄图像，再调节放大倍数并重新对焦，以获得高倍图像。
         ​警告：观察前不得触碰聚集体表面，以免破坏表面形貌。

3. 类器官聚集体的组织学分析

1. 样品的固定与切片
   1. 将步骤 1.2.4 或 1.2.5 中获得的聚集体用 4% 多聚甲醛在 4 °C 下固定至少 24 小时。固定后用 PBS 洗涤，并将样品放入包埋盒中，用流水冲洗过夜。
   2. 使用自动脱水仪按照制造商说明，通过梯度乙醇、二甲苯和石蜡对样品进行脱水。整个过程如下：室温下 85% 乙醇处理 2 小时，室温下 95% 乙醇处理 2 小时，室温下 95% 乙醇处理 2 小时，室温下 100% 乙醇处理 2 小时，室温下 100% 乙醇处理 1.5 小时，室温下二甲苯处理 45 分钟，室温下二甲苯处理 45 分钟，室温下石蜡处理 30 分钟，室温下石蜡处理 1.5 小时，最后在 60 °C 下用石蜡处理 2 小时。
   3. 用石蜡包埋样品，制备约 5 µm 厚的切片，将其贴附于阳离子载玻片上，并在 45 °C 下干燥 2 小时。
   4. 依次用二甲苯脱蜡 15 分钟（两次），再用 100%、90%、80% 和 70% 乙醇（每种浓度各 5 分钟）进行水化。
   5. 用流水缓慢冲洗载玻片 3 次，每次 5 分钟。
2. 苏木精-伊红（HE）染色
   1. 用苏木精染色 3–5 分钟，用水冲洗，并小心去除组织周围的多余液体。
   2. 用含 1% 盐酸的乙醇分化 3–5 秒，然后用流水冲洗，期间颜色略变浅并呈蓝色。去除组织周围的多余水分。
   3. 用伊红染色 1 分钟，用流水冲洗，并去除组织周围的多余液体。
   4. 依次用 70%、80%、90% 和 100% 乙醇脱水（每种浓度各 10 秒），再用二甲苯处理 15 分钟（两次），在通风橱中自然干燥后封片。
   5. 滴加中性树胶，用盖玻片封片，于光学显微镜下观察。
3. 马松三色（Masson's trichrome）染色
   1. 用 Weigert 铁苏木精染色 5 分钟，用水冲洗，并擦干。
   2. 用含 1% 盐酸的乙醇分化 3–5 秒，然后用流水冲洗，期间颜色略变浅并呈蓝色。将表面擦干。
   3. 用丽新红酸性品红溶液染色 5–10 分钟，然后用蒸馏水快速冲洗。
   4. 用磷钼酸水溶液处理 3–5 分钟。
   5. 不经过水洗，直接用苯胺蓝溶液复染 5 分钟。
   6. 用 1% 冰醋酸处理 1 分钟。
   7. 依次用 70%、80%、90% 和 100% 乙醇脱水（每种浓度各 10 秒），再用二甲苯处理 15 分钟（两次），在通风橱中自然干燥后封片。
   8. 滴加中性树胶，用盖玻片封片，于光学显微镜下观察。

4. 植入

1. 通过腹腔注射 50 mg/kg 戊巴比妥钠使裸鼠麻醉。
   ​注意：通过捏压足垫时角膜反射和肢体反应消失来确认小鼠已充分麻醉。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
2. 使用碘伏消毒后，用无菌小剪刀在裸鼠耳后皮肤上剪出一个横向切口（约 3–4 cm）。
3. 将皮肤向前牵拉以暴露颅骨。用 11# 刀片轻轻划出计划缺损区域的边缘，然后去除骨片。缺损区域为直径约 4 mm 的圆形区域。用生理盐水冲洗伤口，并充分止血。
4. 将步骤 1.2.5 或 1.2.6 中获得的聚集体用无菌纱布蘸干，以吸收表面水分后再进行植入。将聚集体置入缺损区域，并轻微加压以填满缺损。
5. 牵拉皮肤复位，确保植入物固定。使用 1/2、4 × 10 角针和 4-0 缝合线缝合切口。
6. 手术后，将动物置于复温毯上直至恢复活动能力，然后放回笼中。
   注意：在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。术后动物在完全恢复前不得与其他动物同笼饲养。

结果

根据实验流程（图1），可成功利用脐带间充质干细胞（UCMSCs）构建细胞聚集体。在使用前必须通过形态学观察和组织学分析对聚集体的质量进行评估（via）。显微镜下观察应可见完整且致密的层状结构，细胞相互交错形成编织样图案（图2A）。在聚集过程中可能出现边缘卷曲现象；过度卷曲的边缘提示聚集失败，并会留下细胞间隙（图2B）。最终形成的聚集体可通过肉眼观察并易于剥离（图2C）。可使用活/死细胞染色试剂对聚集体进行活体观察（图2D）。活细胞的细胞质可被Calcein AM染色呈绿色，而死细胞的细胞核可被EthD-1染色呈红色。所有细胞核均可被Hoechst染色呈蓝色。扫描电镜（SEM）分析显示，表面扫描结果表明聚集体具有正常的细胞结构，并富含细胞外基质（ECM）（图3A）；横...

讨论

随着组织工程生物技术的进步，构建具有高可塑性、包含长期存活细胞并能实现最佳再生效果的可植入结构，已成为众多科学家的研究重点。目前间充质干细胞（MSCs）的植入方法多种多样，例如仅使用细胞的方法、结合细胞因子的支架材料^6,24，或干细胞与支架材料联合使用的方法⁵。本文介绍一种高效的MSC细胞团构建与植入方法，该方法通过特定培养基诱导细胞自组装形成致密的细胞簇，具有富含细胞外基质（ECM）的优势，便于收获和应用。所沉积的ECM可作为天然支架，促进宿主与植入细胞团之间的生物分子交换，从而增强MSCs的递送效率和定植能力^25,26。通过该方式获得的细胞团，其细胞可被自然沉积的ECM紧密包裹，为组织再生提供更完整且生理模拟性更高的细胞微环境^27,28。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)	Sigma	T4049	细胞传代
自动脱水机	LEICA	ASP200s	聚集体脱水
离心机	Eppendorf	5418R	离心
离心管	Thermo Nunc	339650	离心
培养皿	Thermo	150466	UCMSCs 培养
乙醇	SCR	10009218	聚集体脱水
胎牛血清	Sijiqing	11011-8611	UCMSCs 培养
镊子	JZ	JD1080	收获聚集体
戊二醛	Proandy	10217-1	聚集体固定
苏木精-伊红染色试剂盒	beyotime	C0105S	HE 染色
六甲基二硅氮烷	SCR	80068416	干燥聚集体表面
Hoechst33342	Sigma	14533	细胞核染色
L-谷氨酰胺	Sigma	G5792	UCMSCs 培养
活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒	Invitrogen	L3224	活/死细胞染色
Masson 染色试剂盒	ZHC	CD069	Masson 染色
最低必需培养基 Alpha 基础型 (1x)	Gibco	C12571500BT	UCMSCs 培养
石蜡	Leica	39601006	组织包埋
多聚甲醛	Saint-Bio	D16013	聚集体固定
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	重悬并纯化 UCMSCs
青霉素/链霉素	Procell Life Science	PB180120	UCMSCs 培养
戊巴比妥钠	Sigma	P3761	动物麻醉
Polysporin	Pfizer		防止眼部干燥
扫描电子显微镜	Hitachi	s-4800	SEM 观察
剪刀	JZ	Y00030	动物手术切口
六孔板	Thermo	140675	UCMSCs 培养
缝合针	Jinhuan	F603	闭合伤口
缝合线	Xy	4-0	闭合伤口
恒温设备	Grant	v-0001-0005	水浴
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	商业化 UCMSCs
维生素 C	Diyibio	DY40138-25g	聚集体诱导
二甲苯	SCR	10023418	聚集体脱水