优化的胶原蛋白表面固定化方法及胶原结合实验方案

摘要

本研究提供了一种优化的实验方案，可重复性地将I型和III型胶原固定于微孔板上并进行定量，随后采用改进的方法 体外 使用时间分辨荧光法研究胶原-化合物相互作用的结合实验方案。提供了后续逐步数据分析与数据解释方法。

摘要

纤维化是多种组织对损伤或损害产生的一种修复性反应。然而，若纤维化过度，则可导致组织瘢痕形成和器官功能衰竭，与高发病率和高死亡率相关。胶原蛋白是驱动纤维化过程的关键因子，其中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白是多种纤维化疾病中主要参与的类型。与用于固定其他蛋白质（如弹性蛋白、白蛋白、纤连蛋白等）的传统方案不同，目前尚无易于获取的、可重复地固定不同类型胶原蛋白以形成稳定包被的综合性实验方案。胶原蛋白的固定具有出乎意料的挑战性，因为多种实验条件可能影响其固定效率，包括胶原蛋白类型、pH值、温度以及所用微孔板的类型。本文提供了一种详细的实验方案，用于可重复地固定并定量Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，从而实现 稳定且可重复的凝胶/薄膜的制备方法。此外，本研究还展示了如何进行、分析和解读 体外 时间分辨荧光结合研究用于探究胶原蛋白与候选胶原结合化合物（例如，与携带铕[Eu(III)]的金属螯合物偶联的肽）之间的相互作用。该方法可广泛应用于多种生物医学领域，包括 分子成像领域的靶向成像探针开发、药物研发、细胞毒性研究、细胞增殖研究以及免疫分析。

引言

纤维性结缔组织在组织损伤后自然愈合过程中积聚的现象被称为纤维化。然而，如果纤维组织的沉积未能及时终止，并持续超出组织修复所需的程度，则会导致过度纤维化^1,2。过度纤维化会损害器官的生理功能，可能导致器官损伤甚至器官衰竭^3,4,5。纤维化的两个主要驱动因素是细胞外基质（ECM）蛋白I型和III型胶原⁶。胶原是一种存在于多种器官中的结构蛋白，约占人体总蛋白含量的三分之一¹。通过人类基因组测序已鉴定出28种不同类型的胶原，其中最丰富的是纤维状胶原⁷。主要的纤维状胶原为I型胶原，它赋予细胞外基质抗张强度和抗变形能力⁸。III型胶原是一种提供弹性的结构成分，通常与I型胶原共定位。它在胚胎发生期间表达，在成人的皮肤、肌肉和血管中天然存在，但含量较少⁹。

在体 胶原蛋白的合成始于细胞内过程，其中mRNA在细胞核中转录，随后转移至细胞质中进行翻译。翻译完成后，所形成的肽链在内质网中经历翻译后修饰，形成前胶原（胶原蛋白的前体）。前胶原随后转运至高尔基体进行最终修饰，然后被分泌到细胞外空间。¹⁰通过蛋白水解切割，前胶原转化为胶原蛋白单体。随后，该单体通过交联反应进行连接，交联方式为 通过 由赖氨酰氧化酶（LOX）催化的酶介导交联途径或 通过 一种非酶促介导的交联途径，涉及美拉德反应¹¹. 体外 固定胶原蛋白的方案主要依赖于胶原蛋白的自组装能力。胶原蛋白根据其溶解度从组织中提取，而溶解度在很大程度上取决于单个胶原原纤维交联的程度。⁷纤维状胶原可溶于乙酸，当调节pH值和温度时，纤维可重新形成¹². 体外，胶原蛋白的纤维形成可视为一个两阶段过程⁷第一阶段为成核期，此阶段胶原纤维先形成二聚体和三聚体原纤维，随后重排形成三重螺旋结构。第二阶段为生长期，此阶段 原纤维开始侧向生长，形成特征性的D带结构，这一过程通常可通过浊度变化观察到⁷原子力显微镜（AFM）研究还表明，I型和III型胶原蛋白具有不同的特性（表1)¹³.

为了研究胶原蛋白与其他化合物之间的结合相互作用，需要将胶原蛋白可重复地固定在微孔板的孔中。目前已有多种用于固定可溶性胶原蛋白的实验方案^14,15,16。市面上有售的预包被胶原蛋白的微孔板通常用于细胞培养。然而，这些预包被的微孔板在孔壁上所包被的胶原蛋白层非常薄，且胶原蛋白的含量未知，因此不适合用于体外（in vitro）结合实验。将胶原蛋白固定在微孔板孔壁上时存在多个挑战。其中一个关键挑战是选择合适类型的微孔板，因为不同类型的胶原蛋白（例如I型和III型）具有不同的化学性质，其在不同材质微孔板上的固定稳定性与效率也各不相同。另一个挑战在于固定化实验条件的优化，因为胶原蛋白纤维形成（fibrillogenesis）过程受多种因素影响，包括温度、pH值、胶原蛋白的储备浓度以及缓冲液的离子浓度⁷。

为了研究胶原蛋白（靶标）与其他化合物（例如靶向肽）之间的相互作用，还需要建立一种可靠的筛选检测方法，通过测定解离常数 K_d 来评估该化合物对靶标的特异性和选择性。蛋白质（胶原蛋白）与配体形成双分子复合物的平衡位置通常用结合常数 K_a 表示，其数值大小与结合亲和力成正比。然而，生物化学家更常使用双分子 复合物的平衡解离常数 K_d 来描述亲和力关系，K_d 定义为 K_a 的倒数（即 K_d = 1/K_a）。K_d 值越低，表明蛋白质与配体之间的结合强度越强。使用 K_d 比较不同配体对同一蛋白质（或反之）的结合亲和力的优势在于，双分子复合物的 K_d 单位为 mol/L（即浓度单位）。在大多数实验条件下，K_d 值对应于达到平衡时使靶标上 50% 可用结合位点被占据所需的配体浓度^17,18。解离常数通常通过分析受体的结合位点占有率（FO）来获得，FO 定义为被占据的结合位点数与总的可利用结合位点数之比，其值随配体浓度变化而变化。实现这一分析的前提是具备一种能够区分并定量检测结合态配体量的分析方法。

体外配体结合实验可采用多种生物分析方法进行，包括光学光度法、放射性配体法、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）以及表面等离子共振（SPR）。在光度法中，基于荧光发射的方法通常需要将配体或蛋白质标记荧光团，以提高检测灵敏度并改善实验的检测限。某些镧系三价离子（如 Eu(III)）的螯合物作为荧光团极具吸引力，因其具有较大的斯托克斯位移、窄发射带（可提供良好的信噪比）、较低的光漂白性以及长的荧光发射寿命。尤为重要的是，后一特性使得利用 Eu(III) 荧光团的时间分辨荧光（TRF）技术成为可能，从而消除背景自发荧光的干扰¹⁹。在基于 Eu(III) 的时间分辨荧光实验的解离增强镧系荧光免疫分析法（DELFIA）中，将用非发光 Eu(III)-螯合物标记的配体与固定在微孔板上的受体共同孵育。标记的配体-受体复合物与未结合的配体分离后，在酸性 pH 条件下使 Eu(III) 螯合物解离，随后 Eu(III) 与可增强荧光的螯合剂重新结合，形成嵌入胶束中的高荧光 Eu(III) 复合物²⁰。

脱络合步骤可使用具有快速脱络合动力学特性的螯合剂（如二乙烯三胺五乙酸，DTPA）合理实现。然而，Eu(III) 与某些大环螯合剂（如 DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）及其单酰胺衍生物（DO3AAm））形成的配合物具有很高的热力学稳定性和极强的动力学惰性。在此情况下，必须精确优化脱络合步骤，以实现基于 Eu(III) 的时间分辨荧光（TRF）信号的充分且可重复的活化。²¹值得注意的是，镧系元素（Ln(III)）-DOTA 和 Ln(III)-DO3AAm 配合物是目前最常被用作对比剂的类型 体内 利用磁共振成像（MRI）技术进行分子成像²²因此，基于镧系元素（Ln(III)）的时间分辨荧光（TRF）分析是研究 体外 MRI分子探针与其预定生物靶标结合亲和力。目前，尚缺乏用于固定I型和III型胶原以及可重复地进行相关实验的全面且可重复的操作方案。 体外 缺乏结合 Eu(III) TRF 的实验。为克服这些局限性，需要建立可重复的方法，以实现 I 型和 III 型胶原蛋白的自组装并将其固定，分别形成稳定的凝胶和薄膜，并达到结合 Eu(III) TRF 实验所需的足够胶原蛋白浓度 体外 结合实验，开发了铕(III)时间分辨荧光（Eu(III) TRF）检测方法。本文提出了一种针对高惰性铕(III)-DO3Aam类配合物的优化检测方案。最后，一种优化的 体外 使用微孔板Eu(III)时间分辨荧光法测定K_d Eu(III)标记配体对固定化的I型和III型胶原的结合性得到证实（图1).

方案

注意：本研究所用的所有产品信息均列于材料表中。

1. 胶原蛋白固定化

注意：进行结合实验时，确保微孔板中的每个孔周围都有空置的相邻孔，以避免交叉荧光。此步骤需在冰上操作，因为胶原蛋白在温度和pH升高时会发生自组装。本实验步骤应在组织培养超净台内无菌条件下进行，因为微孔板后续需要在组织培养（TC）孵育箱中孵育。

1. 将 I 型胶原固定在 96 孔微孔板上（图 2）
   ​第 1 天
   1. 准备一个装有冰的硅胶托盘。将含有 I 型胶原的试剂瓶、冷的 10× 磷酸盐缓冲液（PBS）和微孔板置于冰上，并用 70% 乙醇喷洒所有物品。将材料放置于组织培养罩内。
   2. 使用等体积的 I 型胶原和 10× PBS（pH 7.4）中和胶原。
   3. 轻轻倒置混合液数次，确保不产生气泡。
   4. 向微孔板中每隔一行、每隔一孔加入 100 µL 中和后的胶原，于 37 °C 孵育 18–20 小时，使胶原完全干燥。
      第 2 天
   5. 用 100 µL 的 1× PBS（pH 7.4）洗涤微孔板两次，以去除未结合的胶原。
   6. 将微孔板转移至 37 °C 培养箱中再干燥 2 小时，然后用于后续结合实验。
2. 将 III 型胶原固定在 96 孔微孔板上（图 3）
   第 1 天
   1. 准备一个装有冰的硅胶托盘。将含有 III 型胶原的试剂瓶、冷的 10× PBS 和微孔板置于冰上，并用 70% 乙醇喷洒所有物品。将材料放置于组织培养罩内。
   2. 使用等体积的 III 型胶原和 10× PBS（pH 7.4）中和胶原。
   3. 向微孔板中每隔一行、每隔一孔加入 70 µL 中和后的胶原，将微孔板置于组织培养罩内，于 37 °C 孵育 2 小时，使胶原完全干燥。
      第 2 天
   4. 用 70 µL 的 1× PBS（pH 7.4）洗涤微孔板两次，以去除未结合的胶原。
   5. 将微孔板转移至 37 °C 培养箱中孵育 1 小时，然后转移至实验台，静置干燥 1 小时后用于后续结合实验。

2. 固定化胶原凝胶/薄膜稳定性的评估

1. 用 PBS 孵育 1 小时
   注意：在结合实验期间，将固定化的胶原蛋白与目标化合物一起孵育。重要的是要考察所形成的胶原凝胶或薄膜的稳定性。为此，需测量三种条件下的稳定性：不洗涤 = 在孵育后直接测定固定化的胶原蛋白；洗涤 = 用 100 µL PBS 洗涤平板两次后测定固定化的胶原蛋白；以及 1 小时 PBS 模拟并洗涤 = 先用 PBS 孵育 1 小时，再用 PBS 洗涤两次后测定固定化的胶原蛋白。以下说明 PBS 孵育方法。
   1. 向每个包被有胶原蛋白的孔中加入 70 µL PBS (1x)，并将微孔板在室温下孵育 1 小时。
   2. 使用移液器吸去每孔中的过量液体，在进行下述蛋白质定量测定前，用 PBS (1x) 洗涤两次。
2. 使用二辛可宁酸法（BCA）定量固定化胶原蛋白的含量
   ​注意：按照生产商说明书使用 Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（材料表）。为此测定制备相应的胶原蛋白标准品。I 型胶原蛋白的浓度范围为 0–3,000 µg/mL，III 型胶原蛋白为 0–750 µg/mL。每种胶原蛋白共制备 11 个标准品。
   1. 根据生产商说明书配制所需总量的工作液（WR）。
   2. 将每种胶原蛋白标准品各 25 µL 加入微孔板孔中（设复孔）。这些溶液用于绘制标准曲线。
   3. 向含有标准品及包被了未知浓度胶原蛋白的各孔中加入 200 µL 工作液。
   4. 将微孔板置于板式振荡器上振荡 30 秒。盖好微孔板，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   5. 取出微孔板，于室温下冷却。使用酶标仪在 560 nm 处测定吸光度。
   6. 通过绘制 11 个标准溶液的 A₅₆₀（AU）对浓度（µg/mL）的标准曲线，并利用该标准曲线计算胶原蛋白含量。

3. 铕(III) 时间分辨荧光配体结合实验（图1）

注意：所使用的化合物是一种候选的胶原结合肽（CBP），标记有单个 Eu(III)-DO3AAm 复合物，称为 Eu(III)-DO3AAm-CBP（图 4）。

1. 将 Eu(III)-DO3AAm-CBP 化合物与胶原蛋白包被的孔板共同孵育
   1. 用 1× PBS 配制浓度范围为 0.1–15 µM（0.1 µM、0.5 µM、1 µM、3 µM、5 µM、7 µM、10 µM 和 15 µM）的 Eu(III)-DO3AAm-CBP 化合物溶液。
   2. 向胶原蛋白包被的孔（A 板）中每孔加入 75 µL 不同浓度的化合物溶液。每个浓度设置三个复孔，用于计算化合物与胶原蛋白结合的量。
   3. 使用第二个未包被的孔板（B 板），向空孔中每孔加入 75 µL 各浓度化合物溶液，用于测定化合物与孔板的非特异性结合。每个浓度均设三个复孔。
   4. 将微孔板在室温下孵育 1 小时。
   5. 使用移液器吸出并弃去每孔中的多余溶液，用 1× PBS 洗涤孔板两次，以去除未结合的过量化合物。该步骤需同时在胶原蛋白包被和未包被的微孔板上进行。
   6. 向第三个未包被的孔板（C 板）中每孔加入 10 µL 相同浓度范围的 Eu(III)-DO3AAm-CBP 溶液（设两个复孔）。利用溶液中 Eu(III)-DO3AAm-CBP 的荧光读数绘制标准曲线。
      注意：此板中的溶液无需洗涤或吸出。
2. 铕(III)的酸提取及时间分辨荧光（TRF）检测
   注意：有关酸性溶液（AS）和缓冲溶液（BS）体积的配制与校准，请参见补充信息。本研究中，为可重复地达到最佳 pH 值，所用 AS 和 BS 的体积分别为 54 µL 和 46 µL。以下操作需在 A 板、B 板和 C 板上同时进行。
   1. 向每孔中加入 54 µL 酸性溶液（AS），将孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 90 分钟，并用铝箔覆盖微孔板以防止蒸发。必须严格控制温度和孵育时间，以确保去络合反应的可重复性。
   2. 向每孔中加入 46 µL 缓冲溶液（BS），轻轻振荡孔板 30 秒。
   3. 向每孔中加入 100 µL 增强溶液（ES），振荡孔板 30 秒。
   4. 加入增强溶液后等待 30 分钟，再使用 TRF 酶标仪读板。检测参数见表 2。

4. 数据分析

1. 测定固定在孔板中的胶原蛋白浓度
   1. 获得标准溶液 A₅₆₀（AU）与浓度（µg/mL）之间校准曲线的方程
      1. 使用含有胶原蛋白标准品的孔所测得的吸光度读数。
      2. 将复孔的平均值制表，并以平均吸光度对已知蛋白（胶原蛋白）浓度（µg/mL）作图，得到标准曲线方程。
   2. 利用吸光度值计算固定化胶原蛋白的质量（µg）和浓度（M）
      1. 计算含有固定化胶原蛋白的三个孔的平均吸光度值，并记录标准偏差。
      2. 使用从胶原蛋白标准曲线（步骤 2.2.6）获得的标准曲线方程，将胶原蛋白包被孔测得的吸光度转换为浓度。由此计算实验孔中固定化胶原蛋白的浓度（µg/mL）。
      3. 将步骤 4.1.2.2 计算出的浓度（µg/mL）先转换为克/升，再根据胶原蛋白的分子量转换为摩尔浓度（M）。
      4. 最后，通过将浓度除以加入孔中的胶原蛋白体积（I 型胶原为 100 µL，III 型胶原为 70 µL），计算每个孔中固定化胶原蛋白的质量。
2. 解离常数（K_d）的计算（图 4）
   1. 提取荧光读数
      1. 将酶标仪的荧光读数导出至电子表格。
         注：在结合实验中，需考虑化合物非特异性结合到微孔板塑料表面的可能性。
      2. 分别对三种不同微孔板中每种化合物浓度的三复孔测量值取平均值：包被孔的特异性结合读数（板 A）、未包被孔的非特异性结合读数（板 B）以及未包被孔中溶液内总 Eu(III)-DO3AAm-CBP 的读数（板 C）。
      3. 通过从包被孔（板 A）的荧光读数中减去未包被孔（板 B）的荧光读数，确定结合化合物的荧光值。
         公式 1：结合荧光的确定¹⁷：
         结合荧光 = 特异性（包被孔） - 非特异性（未包被孔）
      4. 使用溶液中 Eu(III) 标记化合物的读数（板 C）生成校准曲线。将测得的荧光读数对 Eu(III) 标记化合物的浓度作图，并进行线性回归拟合。
   2. 将荧光读数转换为浓度
      1. 利用溶液中化合物浓度生成的标准荧光曲线（步骤 4.2.1.4），将结合荧光读数（步骤 4.2.3）转换为浓度。
         注：当比较一种化合物对不同浓度下固定化的不同靶蛋白的结合特性时，在计算结合到靶蛋白上的化合物量（即结合化合物/蛋白）时，需考虑靶蛋白的固定浓度。
      2. 将结合化合物的浓度除以孔中固定化蛋白的浓度。
         注：在此计算中，应使用孔与 PBS 孵育 1 小时后计算出的固定化胶原蛋白浓度（即所谓的 PBS 模拟实验；见上文第 2.1 节）。这是为了校正孵育和洗涤步骤中可能发生的胶原蛋白损失，这些损失不会对最终荧光信号产生贡献。
      3. 使用散点图绘制数据，横轴为化合物浓度（µM），纵轴为结合化合物/蛋白比值。
   3. 获得 K_d 值
      1. 使用两种可能的结合动力学模型拟合步骤 4.2.2.3 获得的数据：单一位点结合模型和带 Hill 斜率的单一位点结合模型。各模型的方程见 图 6。
      2. 选择在拟合数据时具有最高决定系数（R²）且拟合结果明确无歧义的模型。
      3. 排除每块板中每个浓度下荧光读数的异常值。
      4. 计算最终的 K_d 值，并以独立实验的均值 ± 标准偏差形式呈现数据。
         注：为获得可靠结果，应在每块板内进行三复孔测量，并至少使用不同的微孔板进行三次独立实验。
   4. 计算分数占有率（FO）。
      注：由公式 2 可知，靶标浓度未知，因此通过代数运算并结合公式 3 中的 K_d，可推导出可用于计算分数占有率的实用公式，即公式 4。
      公式 2：分数占有率的定义¹⁷：
      
      公式 3：解离常数 K_d，即在平衡状态下化合物占据 50% 靶标时的浓度¹⁷：
      
      公式 4：重新整理后用于计算 FO 的方程¹⁷：
      
      1. 使用从每块独立微孔板获得的独立 K_d 值计算 FO。绘制 FO 随化合物浓度变化的结果、均值及标准偏差。
      2. 以 0 到 1 之间的数值或 0% 至 100% 的百分比形式报告 FO 值。

结果

评估凝胶/薄膜中固定化的I型和III型胶原蛋白的稳定性和浓度
每孔固定化胶原蛋白浓度的定量通过三种不同条件进行：a）蛋白固定后未用PBS洗涤的孔（不洗涤）；b）蛋白固定后进行洗涤步骤（用PBS洗涤两次）以去除未结合蛋白的孔；c）用PBS孵育1小时后的孔（PBS模拟实验）。PBS孵育模拟步骤旨在了解在实际结合实验中，候选化合物溶液孵育后胶原凝胶/薄膜的稳定性。准确定量每孔中固定化的胶原蛋白量，对于精确计算和比较结合分数与解离常数（K）至关重要。_d) 一种化合物对不同靶标的作用，特别是当这些靶标的包被效率不同时。 图7 显示了III型胶原蛋白的代表性稳定性检测结果，从中可以明显看出，当包含洗涤和/或孵育步骤时，固定在孔板上的胶原蛋白量有所减少。结果表明，胶原蛋白从凝胶/薄膜上的损失主要发生在洗涤步骤期间，而在孵育步骤期间损失较少。然而，洗涤是在实验过程中至关重要的一步 体外 结合实验以确保未结合的化合物被去除。因此，重要的是应计算并采用仍保留在孔内涂层中的胶原蛋白量（而非最初固定的胶原蛋白量）对实验结...

讨论

本研究提供了一种可重复的I型和III型胶原固定化方法，并展示了获取、分析和解释相关数据的实验方案。 体外 Eu(III) TRF结合数据用于表征候选配体对I型和III型胶原的结合特性。本文所述的I型和III型胶原固定化方案是在参考既往关于I型和III型胶原纤维形成的文献基础上开发并优化的 体外^13,16具体而言，通过优化微孔板类型、缓冲液的pH值、温度和离子浓度等关键条件，实现了I型和III型胶原的可重复性包被。鉴于胶原在pH值和温度升高时会发生自组装，因此为固定胶原而进行的中和与加样步骤必须在冰上完成。这可确保胶原的成核速率（纤维形成的第一步）不会在胶原接触孔板前启动，而是在孵育过程中温度升高后于孔内发生。通过定量各孔中的蛋白含量发现，使用具有非离子亲水表面的非特异性结合微孔板，可实现I型胶原稳定且可重复的包被。相比之下，III型胶原则在经等离子气体处理、亲水性增强的组织培养级聚苯乙烯微孔板上表现出可重复且稳定的包被效果。相较于I型胶原，针对III型胶原的固定化方案研究较少，因此本方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS	Gibco	14200075	用蒸馏水稀释（1:10）配制1x PBS
10x PBS	Gibco	14200075	用蒸馏水稀释（1:10）配制1x PBS
2M HCL			自行配制，详细信息见支持性文件
2M HCL			自行配制，详细信息见支持性文件
2M 氢氧化钠 + 2M 甘氨酸			自行配制，详细信息见支持性文件
2M 氢氧化钠 + 2M 甘氨酸			自行配制，详细信息见支持性文件
Cell-star 96孔 微孔板	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96孔 微孔板	Greiner Bio-One	655 160
DELFIA 增强溶液	Perkin Elmer	1244-104
DELFIA 增强溶液	Perkin Elmer	1244-104
冰
冰
Infinite 200 PRO NanoQuant 微孔板读板仪	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant 微孔板读板仪	TECAN
非结合（NBS）96孔微孔板	Corning	3641
非结合（NBS）96孔微孔板	Corning	3641
pH电极 Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH电极 Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH计（sevenCompact）	Mettler Toledo
pH计（sevenCompact）	Mettler Toledo
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermofisher	23227
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermofisher	23227
组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）
I型牛胶原蛋白，3 mg/mL	Corning	354231
III型人胎盘胶原蛋白，0.99 mg/mL	Advanced Biomatrix	5021