方法文章

用于SARS-CoV-2检测的高性能石墨烯改性传感芯片

DOI：

10.3791/64730

⸱

2023年5月5日

 ,  ,  ,  , 
1RFIC Bio Centre, Kwangwoon University, 2Department of Electronics Engineering, Kwangwoon University, 3NDAC Centre, Kwangwoon University, 4Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 5Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 6Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 7NanoBioTech Laboratory, Department of Environmental Engineering, Florida Polytechnic University, 8School of Engineering, University of Petroleum and Energy Studies (UPES)

本文内容

摘要

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本方案描述了一种基于功能性纳米系统的低成本生物传感原型的制备方法，可用于精确检测病毒蛋白（检测限达飞克级别）。这种微型传感器平台适用于即时检测（point-of-care）应用，并可与医疗物联网（IoMT）集成，以实现远程医疗目标。

摘要

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该传感原型模型涉及开发一种可重复使用的双层氧化石墨烯（GrO）包覆的双叉指电容（DIDC）检测芯片，用于特异性且快速地检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。所制备的DIDC包含含钛/铂（Ti/Pt）的玻璃基底，其表面包覆有氧化石墨烯（GrO），并通过EDC-NHS化学修饰进一步固定针对SARS-CoV-2病毒刺突蛋白（S1）的抗体（Abs）。深入研究结果表明，GrO为抗体固定提供了理想的工程化表面，并增强了电容，从而实现更高的灵敏度和更低的检测限。这些可调控因素使得该传感器实现了宽检测范围（1.0 mg/mL 至 1.0 fg/mL）、最低检测限达1 fg/mL、高响应性、良好的线性关系（18.56 nF/g）以及3秒的快速响应时间。此外，在构建经济可行的即时检测（POC）体系方面，本研究中GrO-DIDC生物芯片的可重复使用性表现良好。值得注意的是，该生物芯片对血液中的抗原具有特异性，并在5 °C下可稳定保存长达10天。由于其结构紧凑，该微型化生物传感器在COVID-19感染的即时诊断中具有应用潜力。尽管目前仍在进行基于其他病毒样本的验证步骤，该系统亦可用于检测其他严重病毒性疾病。

引言

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一种由新型β冠状病毒1 （即2019-nCoV）引起的病毒性大流行，后来被命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）2（下文主要简称为该病毒），于2019年底在中国武汉出现，表现为肺炎聚集性病例和严重急性呼吸窘迫3。由于该病毒具有快速的人际传播能力、高感染率、高死亡率以及严重的危及生命的不良反应4，在大流行期间，病毒学研究5 迅速发展，以明确该病毒的基因组结构与组成5,6。COVID-197,8 的症状包括高热、干咳和全身性疼痛9。重要的是，该病毒的不同血清型可导致疾病严重程度的差异10。此外，无症状携带者也可能传播病毒。通常在显微镜下，COVID-19病毒颗粒呈现由刺突蛋白形成的棒状突起11。因此，为控制这一新病原体的传播，必须及时且高效地检测病例。因此，在病毒感染早期实现对病毒超灵敏、快速且特异性的检测变得至关重要2,11。需要采取社交/物理距离措施以防止病毒传播12 。卫生机构正强调开发智能诊断工具和纳米系统13。事实上，正如卫生机构所建议，有针对性的大规模检测14,15 是必要的，目前仍存在巨大需求。

原则上，持续使用的生物学诊断方法，如逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），是大规模鉴定SARS-CoV-2以及中东呼吸综合征相关冠状病毒（MERS-CoV）16 和SARS-CoV-117的最佳手段。在此背景下，目前对SARS-CoV-2感染的常规鉴定依赖于扩增感染特异性特征18,19。此外，还需考虑SARS-CoV-2感染在不同地区、年龄、种族和性别间的差异。为实现挽救生命的根本目标，建立可用于现场即时检测（point-of-care, POC）20,21 的快速诊断工具至关重要。

在此背景下，常规策略如荧光原位杂交（FISH）、蛋白质免疫吸附检测（ELISA）、基于微球的方法、电化学检测以及MRI、PET和NIRFOI22 对低病毒载量的检测灵敏度低、选择性差且重复使用能力有限；此外，这些方法还存在诸多缺点，包括生物传感诊断系统成本高昂、试剂不可重复使用以及需要高度熟练的专业技术人员23。因此，这些方法无法被视为快速、经济、高度特异或高灵敏度的即时检测（POC）手段24,25。值得注意的是，目前已开发出多种基于DNA和免疫反应的生物传感器，采用复合型、电容型及电学技术18,26,27,28。例如，电学DNA生物传感器具有高响应性，易于微型化且可调性强29,30，已被用于埃博拉病毒31、寨卡病毒、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）的检测32,33,34。类似地，一种基于场效应半导体（FET）的生物传感器已被成功构建，通过将特定抗体（单克隆抗体）固定在石墨烯涂层器件上，用于检测病毒的刺突蛋白35,36。然而，该新策略的灵敏度仍低于RT-PCR。此外，最近还开发出一种基于气溶胶喷射纳米颗粒还原的氧化石墨烯（GrO）覆盖的三维电极结构病毒检测平台，其检测限极低（2.8 × 10−15 M）；但该所提出的复杂生物传感器结构35 在即时检测（POC）应用方面的可行性已与其他现有病毒检测生物传感器策略进行了测试和比较35,37,38。

本研究设计并制备了一种基于氧化石墨烯（GrO）的微型化、可重复使用的DIDC生物传感器，用于检测病毒刺突蛋白，克服了上述其他生物传感器所存在的局限性。该生物传感器可在3秒的响应时间内实现飞克（fg）级别的检测18,27 。为实现本研究目标，选用了GrO纳米片以获得更高的响应性和选择性，这意味着可检测来自口咽或鼻咽拭子样本中极低浓度的病毒抗原蛋白。GrO是一种适宜的、合成稳定、性能一致且具有导电性的材料，可有效应用于生物传感领域2,39,40,41。此外，采用了一种无需标记的单克隆IgG抗体杂交方法，靶向病毒刺突蛋白S1亚基。所制备的SARS-CoV-2-GrO-DIDC生物传感器在经强氧化性的piranha溶液高级处理和清洗后可重复使用。这种超快速、高灵敏度、高选择性、无需标记且可重复使用的生物传感器，可用于临床样本的生物检测及个性化医疗应用26,42,43,44。

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方案

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1. DIDC 传感芯片的清洗

  1. 实验开始时，用piranha溶液（H2SO4:H2O2 按3:1比例混合）清洗DIDC芯片表面26 ，并将芯片置于80 °C的加热板上加热15分钟。随后，使用移液器逐滴加入蒸馏水冲洗传感器表面，以彻底去除清洗试剂。为确保试剂完全清除，再用四到五滴乙醇冲洗表面。
    注意：DIDC芯片的制备方法依据先前发表的文献26。
  2. 然后，在室温下将传感器表面干燥，以彻底去除残留试剂，获得亲水性传感器表面。该芯片可用于后续在芯片上构建氧化石墨烯层（步骤2）。
  3. 用聚酰亚胺胶带覆盖干净的传感器芯片电极焊盘。

2. 在双叉指电容传感芯片上制备氧化石墨烯薄层

  1. 将芯片水平放置于旋涂机中心，在芯片表面加入 4 µL 市售单层氧化石墨烯（GO）水溶液（参见材料表）。然后关闭旋涂腔室，以 1,300 rpm 转速运行 2 分钟。
  2. 对制备好的 GO 芯片进行退火处理时，将芯片水平置于加热板上，在 80 °C 条件下保持 40 分钟。

3. 氧化石墨烯镀层双叉指电容传感芯片的交联与功能化

  1. 进行 N-(3-二甲基氨基丙基)-N′盐酸乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）与薄膜氧化石墨烯（GO）芯片
    1. 加入4 µL（分别为0.4 M和0.1 M）的EDC-NHS（参见 材料表) 到薄膜氧化石墨烯（GO）芯片上，以实现氨基与羧基的共价结合 通过 酰胺键形成26.

4. 芯片上用于蛋白质检测的抗体准备及固定化

  1. 为了将功能化的 GO-DIDC 芯片与抗体结合，使用稀释缓冲液（含 0.1% BSA [牛血清白蛋白] 和 0.86% NaCl 的 0.01 M PBS）溶解市售的抗 SARS-CoV-2 抗体（由兔单克隆抗体抗 S1 蛋白制备，参见材料表）。
    1. 向 1 µg 纯化的抗体中加入 1 mL 稀释后的 PBS。然后，将 4 µL 抗体溶液滴加到交联活化的 GO-DIDC 芯片上。将芯片置于密闭腔室中，在室温下孵育 2 小时，使抗体结合到功能化芯片表面。
      注：由于 Fab 区域具有极性，通常含有丰富的反应性氨基和羧基26；因此，后续的特异性固定可实现稳定的共价“尾朝上”"（tail-on）" 抗体特异性取向。
  2. 当抗体在传感器表面固定完成后，将 4 µL 牛血清白蛋白（BSA）滴加到芯片上，以封闭免疫电容传感芯片的非特异性位点。将芯片水平放置于密闭腔室中，在室温下孵育 20 分钟。
  3. 用去离子水清洗免疫电容传感芯片，然后在室温下自然干燥。
    注：干燥后，基于 DIDC 的电容型免疫传感器（SARS-CoV-2-Ab-EDC-NHS-GrO-Ti/Pt-SiO2-DIDCs）即可用于病毒刺突抗原的连续检测。
  4. 为进一步检测病毒刺突蛋白，配制浓度范围从 1.0 mg 到 1.0 fg 的不同样品，以获得宽泛的检测限。

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结果

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本文介绍了一种利用氧化石墨烯包被的双叉指电容（DIDC）传感芯片检测SARS-CoV-2病毒S1蛋白的实验方案。 图1 展示了高灵敏度、可循环利用的氧化石墨烯修饰双叉指电容（DIDC）传感芯片的示意图（含电路布局的制备过程）。详细的分步制备流程如图所示。 图2. 图3 表面功能特性表征 通过 原子力显微镜（AFM）。所制备芯片的典型俯视图、FTIR光谱表征以及表面接触角如图所示。 图4. 图5 表示S1抗原的生物分子对金属电极与投影原型之间电场的扰动、DIDC芯片的灵敏度、DIDC芯片的选择性、电容随浓度变化的线性关系图（18.56 nF/g）以及不同浓度下的响应时间。 图6 显示了在不同时间（小时）和天数下对恒定性和可重复性的评估...

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讨论

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为了构建高效的基于DIDC芯片的生物传感器，DIDC的电荷分布、导电性以及介电常数极为重要。值得注意的是，这些检测限的改善与DIDC的电容电抗密切相关18,26,27。在本研究中，制备了一种针对病毒抗体的电容型免疫传感器，该传感器通过EDC-NHS偶联法在氧化石墨烯-DIDC基的SiO2基底上实现功能化27。此外，通过在GrO基底上采用共价结合的方式引入EDC-NHS交联，以实现对病毒抗体的功能化修饰。

通过精心设计的实验流程，确保了传感器表面的准备、抗SARS-CoV-2抗体的固定以及与病毒S1蛋白的结合，从而在固定方法的简便性、特异性识别效果和整体电容性能之间达到了平衡。采用电学与光学表面表征技术对石墨烯氧化物（GrO）调控的DIDC生物芯片的进展进行了验证。基于石墨烯材料的大比表面积，可促进多种分析物的吸附。此外，这种超灵...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究在一定程度上得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部长官资助，项目编号为2018R1D1A1A09083353和2018R1A6A1A03025242；部分经费来自GCS集团协会有限公司；同时获得韩国环境部（MOE）研究生院在“综合污染预防与控制项目”中投入的大量资源，以及光云大学2022年度研究基金的资助。

E.M. 感谢美国国立生物医学成像与生物工程研究所（5T32EB009035）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
淀粉样蛋白 β1-42 蛋白默克（Sigma-Aldrich）107761-42-2
抗 SARS-CoV-2 刺突蛋白（S1）单克隆 IgG 抗体 SinoBiological40150-R007
EDC [N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐]赛默飞世尔科技A35391
乙醇（C2H5OH）Sigma-Aldrich
过氧化氢（H2O2）
聚酰亚胺胶带聚酰亚胺胶带
NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，98+%；C4H5NO3）赛默飞世尔科技A39269
PBS
前列腺特异性抗原 Sigma-AldrichP3338-25UG
SARS-CoV-2 刺突蛋白 S1-His 重组蛋白SinoBiological40591-V08H
单层氧化石墨烯Graphene Supermarket
旋涂仪高精度旋涂仪（旋涂系统）ACE-200 
硫酸（H2SO4）

参考文献

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