图像引导光学相干断层扫描评估啮齿类动物视网膜结构变化

摘要

本文所述方案详细介绍了图像引导光学相干断层扫描（OCT）的数据采集与数据分析步骤，并展示了其在多种啮齿类动物眼科疾病模型中的应用。

摘要

年龄相关性黄斑变性、青光眼、视网膜色素变性以及葡萄膜炎等眼病通常伴随视网膜结构的改变。影响眼底的这些疾病常在视网膜特定细胞类型中表现出典型的异常，包括光感受器细胞、视网膜神经节细胞、视网膜血管细胞以及脉络膜血管细胞。临床实践和基础研究均需要具备无创性、高效率和良好适应性的成像技术。图像引导的光学相干断层扫描（OCT）技术满足了这些要求，因其结合了眼底照相与高分辨率OCT，能够对微小病灶以及视网膜结构的重要变化做出准确诊断。本研究详细阐述了图像引导OCT的数据采集与分析流程，并展示了其在脉络膜新生血管（CNV）、视神经挤压（ONC）、光诱导视网膜变性以及实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）等啮齿类动物模型中的应用。该技术有助于眼科领域的研究人员便捷、可靠且可追踪地识别啮齿类动物视网膜的结构变化。

引言

影响眼底的ocular疾病通常表现为视网膜中某些细胞类型的典型异常，例如光感受器细胞、视网膜神经节细胞、视网膜血管内的细胞以及脉络膜血管内的细胞，这些异常可能继而影响患者的视力¹。为避免不可逆的视力损害，需要及时诊断和适当治疗¹。光学相干断层扫描（OCT）已在临床上广泛用于评估多种ocular疾病，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、青光眼、葡萄膜炎和视网膜脱离等^2,3,4。这种无创、高效且适应性强的成像技术同样需要用于实验动物疾病状况的及时评估^5,6,7,8,9,10。

图像引导的光学相干断层扫描（OCT）利用干涉测量技术，以1.8 µm的纵向分辨率和2 µm的轴向分辨率生成动物视网膜的横截面图像。该技术在研究视网膜结构变化方面至少具有三个优势^{2,3,4,5,6,7,8,9,10}。首先，它是一种无创技术，可使研究人员在同一只动物的视网膜中动态追踪感兴趣区域的位置^5,6,7,8,9,10。其次，这一特性显著减少了每次实验所需的样本量³。同时，它还为科研项目节省了大量时间和精力^{2,3,4,5,6,7,8,9,10}。第三，图像引导的OCT在采集OCT图像的同时可获取彩色眼底图像，从而为用户提供准确且可靠的结果。

本文描述了图像引导光学相干断层扫描（OCT）的图像采集与数据分析流程，并详细阐述了该技术在脉络膜新生血管（CNV）^11,12、视神经 crush 损伤（ONC）^13,14,15,16、光诱导视网膜变性^{17,18,19,20,21}以及实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）^22,23的小鼠和大鼠模型中的应用。利用这一多功能技术，研究人员能够方便、高效地获取高分辨率的OCT图像以及眼底图像。

方案

所有动物实验均符合眼科与视觉研究中动物使用问题的视力研究协会声明，并经温州医科大学（WMU）机构动物护理和使用委员会批准。大鼠和小鼠可自由获取水和食物，环境光照强度为18勒克斯，光照/黑暗循环周期为12小时光照/12小时黑暗。

1. 眼部动物模型的制备

1. 小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型^11,12
   1. 使用氯胺酮和赛拉嗪麻醉4周龄雌性小鼠（C57BL/6J背景），并按照步骤3.2使用托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液散瞳。当轻捏脚趾无任何运动反应时，视为小鼠已充分麻醉。
   2. 启动光源箱、软件和激光器（波长：532 nm），将输出能量调节至100 mW，持续时间调节至100 ms。
   3. 将小鼠置于实验平台上，调整小鼠和平台的位置，直至眼底视野清晰。
   4. 按下激光器屏幕上激光开启按钮，调节红色激光参考光斑的焦距。移动参考光斑，使其位于视盘旁1至2个瞳孔直径处，踩下脚踏开关实施激光损伤。
   5. 立即检查激光照射后是否出现汽化气泡，这是激光损伤成功的标志。每只眼睛产生3至5个激光斑点。
2. 小鼠视神经钳夹（ONC）模型^13,14,15,16
   1. 对出生后21天至35天（P21至P35）的雌性小鼠（C57BL/6J背景）进行麻醉，方法同步骤3.2。当轻捏脚趾无任何运动反应时，视为小鼠已充分麻醉。
   2. 将小鼠置于手术显微镜下，使用弹簧剪刀切开单侧眼睛的结膜，确保切口大小约为1 mm。
   3. 暴露眶内视神经，在距视盘0.5 mm处用精细镊子钳夹5秒。操作时轻柔拨开眼眶肌肉及其他组织并移至一侧，避免损伤手术眼中的任何血管。
      注意：操作时需谨慎，因触碰或牵拉呈束状的白色视神经时，眼球可能发生摆动。
   4. 术后涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
3. 小鼠光诱导视网膜变性（LIRD）模型^{17,18,19,20,21}
   1. 实验前准备：用铝箔和铁丝网盖将小鼠笼（30 cm × 18 cm × 13 cm）包裹封闭，并将每个笼子放入一个顶部装有白光灯的纸箱（52 cm × 35 cm × 30 cm）中。
   2. 将6周龄雄性小鼠（BALB/c）在暗室中暗适应过夜，然后每只眼睛滴加托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液以散瞳。充分散大瞳孔，直至虹膜未遮盖角膜面积的3/4；通常不超过3分钟即可完成。
   3. 用10,000 lux白光照射小鼠2小时。术后将小鼠置于黑暗环境中过夜，随后恢复至正常的明暗循环环境。为确保有效的光刺激，每个笼内始终只保留一只小鼠。
4. 大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型
   1. 实验前准备：将2.5 mg hIRBP161-180与完全弗氏佐剂（1:1 质量/体积）及2.5 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra^22,23乳化。
   2. 将100 µL乳剂皮下注射至每只雄性Lewis大鼠（约180 g）的左足垫。

2. OCT 模块设置

1. 将光纤和OCT控制电缆连接在OCT扫描头与OCT引擎之间（图1A）。将光纤上的缺口与连接器上的槽对齐，轻轻插入直至完全就位（图1B）。
   注意：连接控制电缆前，请先将OCT引擎的电源开关关闭。光纤非常脆弱，因此请避免触碰光纤两端的端面（图1C）。若该模块处于频繁使用状态，应尽量避免拆卸和重新组装OCT扫描头及光纤/电缆。
2. 将小鼠或大鼠用OCT物镜旋入设备主体前端（图1A）。将OCT扫描头安装到OCT物镜上，使M-R焦点指示标记朝向远离设备主体的方向（图1A）。
3. 使用两个手拧螺钉固定OCT扫描头：一个固定在物镜上，另一个固定在相机机身。确保扫描头牢固固定。
4. 依次打开主电源开关、相机光源，然后启动OCT软件。
   ​注意：相机启动需要一定时间，计算机才能识别到该设备。

OCT 实验的动物准备

1. 在OCT实验开始前10分钟，向动物眼睛滴入托吡卡胺去氧肾上腺素眼药水，并用干净毛巾擦去多余药液。
2. 实验开始前5分钟，向小鼠腹腔注射200 µL麻醉液，向大鼠腹腔注射2.0 mL麻醉液。当捏脚趾后未观察到动物有任何活动时，表明麻醉已充分生效。
   注意：麻醉液由氯胺酮（12 mg/mL）和赛拉嗪（小鼠用1 mg/mL，大鼠用2 mg/mL）溶于生理盐水中配制而成；通常按每克动物体重10 µL麻醉液的剂量给药。麻醉液在4 °C下保存，最长不超过2周。
3. 麻醉给药后，立即在角膜表面涂抹凝胶状眼膏以防止眼球表面干燥。

4. 图像引导的光学相干断层扫描成像

注意：软件界面分为三个部分：明场图像、OCT 控制选项卡和 OCT 显示窗口（图 2）。

1. 观察明场图像时，如有需要，输入动物信息的注释。
2. 使用复选框打开或关闭光束位置控制，以决定是否在图像上叠加线条后采集明场图像。
3. 为更精确地定位扫描光束，使用位置微调箭头进行精细控制，将光束向上、下、左或右移动。选择光束的厚度值和颜色，并设定角度以对准目标位置（例如，厚、黑色、0度）。将增益值调节至14 db。
4. 进入OCT控制选项卡。从菜单中选择文件/文件设置，然后创建OCT和眼底图像的保存路径。
5. 指定扫描类型、尺寸和动物种类（大鼠或小鼠）；选择眼睛（左眼或右眼）以及成像视网膜。
   注：OCT可对线状、环状和三维体积扫描类型进行全尺寸、半尺寸、四分之一尺寸和八分之一尺寸的扫描。
6. 设置图像控制参数：对比度调整为60，伽马值调整为100，亮度调整为0。
7. 将小鼠放置于实验平台上，调整小鼠和平台的位置，直至小鼠眼底视野清晰。精细调节位置，使视盘位于视野中央。
8. 初始时，将参考臂设置为小鼠850、大鼠830，然后通过点击<-1 或 +1>按钮进行微调。水平调整OCT图像，然后将OCT图像移至全视野的上三分之一区域。
9. 如有需要，移动偏振滑块以调节穿过视网膜信号的亮度。
10. 在观察到清晰且稳定的OCT图像以及眼底图像后，设定帧数（通常为20、50、80或100），然后点击平均。
    注：采集OCT图像需要数秒钟。帧数越多，图像采集所需时间越长，但获得的图像质量更高。
11. 点击保存以保存OCT和眼底图像，然后点击重新开始以采集下一个样本。
    ​注：动物在37 °C加热板上恢复直至苏醒。在动物恢复足够意识并能维持胸卧位之前，不得使其无人看管。接受处理的动物在完全恢复前不得返回与其他动物共用的饲养系统。

5. 厚度测量与定量分析

注意：该OCT设备内置分析软件，可使用该软件对OCT图像进行分割和分析（图3）。

1. 打开分析软件，并载入需要分析的OCT图像。
2. 选择层数，然后点击获取初始层（图3A）。软件将自动绘制各层结构。
3. 点击铅笔图标，然后移动目标层上的点，以精细调整该层位置（图3A，B）。请逐一仔细修改所有图层。
   注意：可增加更多图层。点击加号图标，在OCT图像上绘制若干点，然后按下对勾图标，即可创建新图层。
4. 完成各层的精细调整后，导出分割后OCT图像的详细数值（CSV格式）及不同类型的图像（图3A）。
   注意：可导出多种图像类型，包括图层、厚度、厚度图、无OCT背景的图层以及屏幕截图。每幅图像中与视神经重叠的中央区域因无视网膜层结构，其数值需舍弃并设为零。

结果

图像引导的光学相干断层扫描（OCT）可用于监测激光诱导小鼠脉络膜新生血管（CNV）过程中激光斑的发展。如图1所示，新生血管穿过布鲁赫膜以及视网膜色素上皮（RPE）层，在激光损伤后形成纤维化瘢痕^11,12。该病变区域可在全尺寸扫描（图4A）或半尺寸扫描（图4B）下被捕捉。推荐使用半尺寸扫描，因其可提供放大的图像，使观察更集中于激光斑。当然，若研究需要，也可监测更宽的时间窗口，包括0天、3天、7天和14天。

在小鼠视神经 crush（ONC）模型中，测量了由视网膜神经纤维层（RNFL）、节细胞层（GCL）和内丛状层（IPL）组成的节细胞复合体（GCC）厚度的动态变化。采用环形扫描模式（图5A），在OCT图像中观察到节细胞的退行性特征（...

讨论

本方案提供了图像引导OCT的图像采集和厚度测量操作指南。通过展示四种最常用的啮齿类动物眼病模型，研究人员发现，图像引导OCT在检测显著的视网膜结构改变方面表现出优异性能。事实上，借助高分辨率图像，OCT图像中亦可轻松识别微小病灶。在图像引导OCT的辅助下，实验室团队还在微重力小鼠模型和Cacna1f突变小鼠模型中发现了外丛状层（OPL）内的异常高反射斑点^24,25。此外，还可识别从玻璃体到脉络膜之间的其他细微结构变化^26,27,28,29。综上所述，高分辨率OCT不仅能够准确诊断微小病灶，还可揭示视网膜结构的重要改变^5,6,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BALB/c 小鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司		动物模型制备
C57BL/6JNifdc 小鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司		动物模型制备
卡波姆眼用凝胶	Fabrik GmbH，Bausch 的子公司 && 罗姆		湿润角膜
完全弗氏佐剂’佐剂	Sigma	F5881	EAU实验
实验平台	凤凰科技集团		动物模型制备
hIRBP161-180	上海桑戈生物工程技术服务 &有限公司		EAU实验
氯胺酮	Ceva Sante Animale		全身麻醉
激光盒	Haag-Streit 集团	Merilas 532α	动物模型制备
Lewis大鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司		动物模型制备
结核分枝杆菌 H37RA	Sigma	344289	EAU实验
Phoneix Micron IV 眼底成像系统，配备图像引导的光学相干断层扫描和图像引导激光	凤凰科技集团		动物模型制备
组织镊	苏州明仁医疗器械有限公司	MR-F101A-5	动物模型制备
托吡卡胺去氧肾上腺素滴眼液	SANTEN OY，日本		散瞳
Vannas 剪刀	苏州明仁医疗仪器有限公司	MR-S121A	动物模型制备
赛拉嗪	Ceva Sante Animale		全身麻醉