简化体积模型作为冷冻电子断层成像中肌动蛋白网络分割的有效策略

摘要

本文介绍了一种将简化的体积模型置入噪声大、结构复杂的断层扫描三维体数据中的实验方案。该方法可实现对肌动蛋白丝密度的快速分割，检测毛束中纤丝的系统性弯曲及断裂间隙，并便于对体积模型的特性（如距离等）进行量化分析。

摘要

高效提取目标特征的方法仍是解析冷冻电子断层图像面临的主要挑战之一。已有多种自动化方法被提出，其中许多方法在高对比度数据集上表现良好，因为这些数据集中目标特征易于检测且彼此之间清晰分离。我们的内耳静纤毛冷冻电子断层图像数据集具有高度密集、呈六边形排列的肌动蛋白丝阵列，且这些肌动蛋白丝常通过交联结构相互连接。这些特征使得自动分割极为困难，而冷冻电子断层图像本身存在的高噪声环境以及密集结构的复杂性进一步加剧了这一挑战。基于对肌动蛋白束组织结构的先验知识，我们采用高度简化的球棍模型肌动蛋白层，首先实现对密度图的整体拟合，随后进行区域性和局部性的模型调整。我们证明，体模型构建不仅能够有效应对高度复杂的结构，还能提供关于肌动蛋白束的精确测量数据和统计信息。体模型还可作为局部分割的锚定点，例如在肌动蛋白-肌动蛋白交联结构的分析中。当传统的自动分割方法难以奏效时，体模型构建——尤其是结合基于计算机的自动化拟合方法进一步增强时——可成为一种强有力的替代方案。

引言

冷冻电子断层扫描技术能够在接近天然的状态下，以纳米级分辨率对整个细胞器或细胞及组织的部分进行可视化观察^1,2,3，该技术采用浸入式冷冻⁴或高压冷冻超快速玻璃化⁵方法制备样品。由于冷冻保存、未染色且保持水合状态的样品所能耐受的电子剂量有限，所获得的断层扫描三维数据通常具有较高的噪声水平。此类噪声可通过多种滤波算法显著降低^6,7，包括非线性各向异性扩散滤波⁸、双边滤波⁹和递归中值滤波¹⁰。

此外，显微镜载物台的倾斜角度受限，导致信息存在缺失的楔形区域，同时在高倾斜角度下样品厚度增加，这些因素均使其三维重构结果具有各向异性的分辨率。这意味着由于Z方向分辨率较低，密度在第三维度上发生弥散。因此，大分子的形状会出现扭曲（即在第三维度上定义不清且被拉长）。

在断层扫描数据解释中，最大的挑战之一是相关特征的自动提取，即所谓的分割¹¹。当具有足够独特的形状特征且噪声较低时，可通过模板匹配识别复杂三维体积中的大分子机器^12,13,14；然而，模板匹配的成功取决于断层图像的分辨率、合适的搜索模型，以及特征体积的大小和形状特性。如果目标特征之间间距足够大，且重复性结构（如大型大分子机器）能够被明确识别，则可将断层图像的子体积进行合并，以提高信噪比，并平均化单个颗粒的形状畸变。已有研究报道，通过模板匹配法实现了对冷冻水合的Dictyostelium discoideum细胞边缘电子断层图像中肌动蛋白丝网络的自动分割¹⁵。

然而，如果目标特征间距较近，数据分辨率的各向异性可能导致在Z方向（即电子束方向）上图谱密度发生弥散，从而使相邻的大型分子机器或超分子复合物的密度包膜出现明显的融合现象。在此类情况下，可采用诸如分水岭等自动化分割方法¹⁶，边界分割¹⁷，或多种基于机器学习的分类方法^18,19，可能无法识别出目标特征，或无法在感兴趣对象周围划定正确的边界。通常情况下，最终结果要么是少数几个过大的片段，要么是过度分割的体积数据，其中包含大量细小片段，需要耗费大量精力将其合并，直到目标特征被视为完整。这种对分割结果的手动校正过程可能极为耗时，尤其当感兴趣结构是由紧密排列且相互连接的细丝组成的阵列时，甚至可能完全失败。 通过 短连接子。在这个巨大的丝状结构网络中，可能很难确定方向。这是由于分辨率各向异性，导致密度看起来相互融合，从而给自动分割以及交互式手动分割方法都带来了巨大挑战。因此，人们很容易 "跳跃" 在仅通过肉眼观察小区域时，难以分辨丝状结构之间的差异。

幸运的是，对于内耳毛细胞静纤毛中的肌动蛋白束，我们已了解其整体肌动蛋白束结构以及肌动蛋白丝的方向性^20,21。该肌动蛋白束由数百根直径为6-8 nm的六边形紧密排列的肌动蛋白丝组成，彼此间距约为12-13 nm²²。

这使得我们能够采用一种截然不同的分割方法，该方法基于简化的球棍模型来表示肌动蛋白丝。该策略包括将理想化的规则排列的丝状模型同时置入冷冻电子断层密度图的切片中，从而逐层构建肌动蛋白束的三维模型。在对单个丝状模型或丝状模型组进行局部调整以精确匹配密度图之前，我们确保模型整体上与密度图具有良好的适配性。通过对丝状模型位置处的密度图数值进行自动颜色编码，我们能够轻松检测肌动蛋白束中存在的明显间隙。体素模型不仅可对体积特性（如肌动蛋白丝之间的距离）进行定量分析，还能简化整体三维丝状网络结构的展示。

此外，模型还可以作为分割其他特征（如肌动蛋白-肌动蛋白连接蛋白）的锚定结构，因为可以选择单个细丝模型的（部分）区域，并在其周围生成相应的半径密度图区域，用于检查和进一步分割。

我们认为，基于体积模型的分割方法对于可能包含间隙和纤维间交叉连接的大规模丝状结构网络尤为适用。分割算法通常进行局部操作，而人脑会考虑更大范围的区域，因此在识别丝状结构方面优于计算机，即使在复杂且高噪声的环境中也是如此。

方案

该方案遵循东南大学人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 用于体素模型构建的冷冻电子断层扫描数据来源

注意：用于构建三维模型的静纤毛冷冻电子断层重建数据此前已发表^22,23，并由 Metlagel 等人²²进行了描述。

用于静纤毛建模的 UCSF Chimera Python 脚本见于补充文件1、补充编码文件1、补充编码文件2、补充编码文件3、补充编码文件4和补充编码文件5。

1. 简而言之，将小鼠椭圆囊感觉上皮顶端表面的静纤毛印迹到透射电子显微镜（EM）载网的 lacey carbon 支持膜上。随后，在300 kV电压下，以3.5–4.5的标称离焦值，利用冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）进行超快速浸入式冷冻玻璃化处理及单轴冷冻电子断层成像数据采集。 µm，使用CMOS型相机在积分模式下成像，像素尺寸为0.47至0.59 nm（参见 材料表).
2. 单轴数据采集的典型剂量通常为80–100电子/ŲŲ使用软件包 IMOD 重建断层图三维体积²⁴，可通过加权反投影法或SIRT方法实现^25,26.
3. 使用 Priism 中的递归中值滤波或双边滤波对断层图像进行去噪²⁷ 或 IMOD 中的非线性各向异性扩散选项。
   注意：用于交互式可视化、体素模型构建和定量分析的关键软件包是 UCSF Chimera 软件^28,29所有使用的软件包均列于下文 材料表.

2. 用于体素模型构建的冷冻电子断层扫描数据准备

1. 断层图旋转
   注意：此步骤的目的是找到 "最佳角度" 其中肌动蛋白核心在三个轴（x和z）中的两个轴上对齐，因此在三维空间中放置模型时只需考虑一个轴。以下步骤在IMOD软件包中进行。
   1. 开放 3dmod (IMOD) 中打开 .mrc 格式的 3D 图像堆栈文件。确保该 3D 堆栈处于 16 位灰度模式，并在其图像文件头中正确显示 X、Y、Z 维度。如有必要，使用以下方法进行校正 修改页眉 命令： alterheader -d (x_pixelspacing),(y_pixelspacing),(z_pixelspacing) inputfilename.mrc 在命令提示符中。如果3D图像栈为TIFF文件格式，请使用以下命令 tif2mrc inputfilename.tif outputfilename.mrc 在命令提示符中输入以创建 .mrc 文件。
   2. 目视检查断层图像并打开 "切片器" （通过按下 反斜杠 "\") 在X、Y和Z维度上寻找最佳旋转角度，以将肌动蛋白丝平面与Z平面进行对齐. 操作 X 旋转，Y 旋转，Z 旋转 使用工具栏查找肌动蛋白丝在X轴和Z轴平面上排列的最佳角度。请注意，改变断层图显示的平均厚度（厚：图像) 可帮助确定 Z 平面密度的理想平均程度，从而提高对比度。使用键盘上的 + 和 - 键分别实现对断层图的放大和缩小。
   3. 确定最佳旋转角度后，通过输入 IMOD 命令旋转断层图像 rotatevol -a (Z旋转角度),(Y旋转角度),(X旋转角度) -s (x宽度),(y高度),(z深度) 输入文件名.mrc 输出文件名.mrc 在命令提示符中输入。确保为该图提供足够的空间以适应旋转，避免旋转时裁切图的部分区域。
      注意：有关如何使用 rotatevol 命令的更多信息，请从帮助菜单中选择相应选项，或访问以下网址（https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/rotatevol.html）。该命令（旋转体积) 不会改变 IMOD 窗口中当前显示的地图，而是生成一个新的地图文件，其中包含旋转后的密度图。
   4. 使用切片窗口，确定地图两个对角顶点的 X、Y 和 Z 坐标，以识别包含静纤毛的裁剪区域 trimvol 命令
   5. 使用 IMOD 命令 Trimvol 输入先前获得的坐标以裁剪该图 trimvol -x (x坐标1),(x坐标2) -y (y坐标1),(y坐标2) -z (z坐标1),(z坐标2) inputfilename.mrc outputfilename.mrc 将命令输入到命令提示符中。现在，该图谱已显著缩小，因此从此时起处理起来更加方便和快速。
      注意：有关如何使用 trimvol 命令的更多信息，请使用帮助菜单中的选项，或访问以下网址（https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/trimvol.html）。这些步骤将生成一个已旋转并裁剪的 .mrc 文件。 
2. 断层图滤波
   注意：此步骤使用 IMOD 提供的非线性各向异性扩散（NAD）滤波器进行降噪。我们采用 IMOD 帮助页面中针对非线性各向异性扩散滤波推荐的初始参数值（如下列网址所列：https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/NADexample.html），并将其作为初始值使用。
   1. 类型 etomo 在命令提示符中输入以启动 IMOD 的 etomo 图形用户界面。
   2. 选择 非线性各向异性扩散 从 etomo 菜单中选择选项并选取地图文件（选择一个体积).
   3. 为了通过目视评估确定能够提供最佳滤波效果的 K 值和迭代次数，需将 NAD 滤波器应用于一个较小的测试体积，以提取指定的 NAD 滤波测试体积。点击 橡皮筋 位于 3dmod 界面顶部的工具，左键拖动以选择测试体积，然后单击 你好 和 Lo 用于指示作为测试体积边界的Z切片的按钮（从 3dmod 获取测试体积范围）。通过点击提取测试体积 提取测试体积.
   4. 使用不同的 K 值对测试体积进行滤波为测试体积确定一个 K 值 > K 值列表），例如 0.1、1、5、10、15、25、30、50 和 75。使用每个指定的 K 值进行 NAD 滤波使用不同的 K 值运行 > 查看不同 K 值测试结果). 使用切片窗口评估NAD滤波器的性能，并选择一个K值用于对整个体数据进行滤波。
   5. 使用步骤 2.2.4 中确定的 K 值，并测试不同数量的迭代次数，例如 2、5、8、11、15 和 21（为测试体积确定迭代次数 > 迭代列表）。通过点击来评估不同迭代次数下的NAD滤波器性能 查看不同迭代测试结果 或使用切片工具。选择不同迭代次数的数值。
   6. 使用确定的 K 值和迭代次数（过滤完整体积 > K 值与迭代次数）并对整个体积进行滤波（过滤完整体积一个经过新过滤的体积文件将出现在已加载的完整体积文件所在的同一目录中，该文件在.mrc文件基础上附加了.nad文件扩展名。
      注意：这些步骤将生成一个经过NAD滤波器过滤的.mrc文件，其噪声较低，因此信噪比得到改善。

3. 体模型构建

1. 3D 模型放置准备
   注意：此步骤的目的是准备并分析密度图，以便使用 UCSF Chimera 程序将三维体素模型放置到旋转并去噪后的密度图中。
   1. 使用切片窗口，获取横截面视图（30个切片/28.4 nm的 slab），以确定待放置肌动蛋白丝模型的密度 slab 中心的Z坐标。点击纤维密度的中心，并在IMOD主窗口中记录Z坐标。
   2. 记录所确定的坐标，以备将来在 UCSF Chimera 中进行模型放置。
      注意：此步骤中记录的Z坐标将在步骤4中用于快速定位并放置预制的肌动蛋白丝模型至正确的Z高度，从而加快模型放置速度。
2. 3D 模型放置
   注意：此步骤的目的是使用 UCSF Chimera 将三维体素模型放置到已准备好的密度图中。
   1. 在 UCSF Chimera 中，打开经过滤波和旋转的密度图（文件 > 开放)
   2. 检查参数是否通过选择正确设置地图参数 特征 > 平面与特征 > 坐标 在体积查看器中打开特征和坐标界面。检查 体素大小 以检查是否已使用正确的体素间距设置 标题 在命令提示符（IMOD 中）输入命令。如果未正确输入，请更正 体素大小 界面以匹配正确的体素间距。将图像居中，使相机位于视窗中心（原点索引 > 中心).
   3. 打开 相机控制 窗口工具 > 观察控制 > 相机）。然后，将相机视图设置为正交视图（投影 > 正交投影)
   4. 加载预制作的 Python 脚本模型（文件 > 开放 > ActinFilamentPlane.py 并打开与该图谱中肌动蛋白丝平面数量相同的肌动蛋白丝平面脚本。
   5. 通过开启加载模型的移动功能来重新定位 移动鼠标模式 (工具 > 运动 > 移动鼠标模式）。启用移动鼠标选项（设置移动鼠标模式 > 移动选择）。使用 Ctrl + 拖动 以多选会话中存在的任意模型，然后单击右键（或根据指定的其他任意按键） 偏好 > 小鼠) 以将模型移动到所需方向。
      注意：模型使用具有一定厚度的球和棒创建半径 的 ActinFilamentPlane.py 脚本）以及特定间距（晶格间距 ActinFilamentPlane.py 脚本的
   6. 若要仅可视化感兴趣的模型，请打开模型面板（工具 > 常规控制 > 模型面板）。点击 复选框 下 S（显示） 用于启用或禁用特定模型的可见性。
   7. 激活命令行面板（工具 > 通用控制 > 命令行).
   8. 将每个肌动蛋白丝平面模型放置到合适的Z高度后，通过选中模型中多余的部位并输入以下命令，删除每个肌动蛋白丝平面模型中的多余肌动蛋白丝 德尔塞尔 （在 UCSF Chimera 主视图窗口底部的命令行中删除所选内容）
   9. 一次仅可视化一条肌动蛋白丝平面，方法是进入 模型面板 窗口，并选择并隐藏所有其他肌动蛋白丝模型（Ctrl + 单击 > 隐藏).
   10. 为了可视化与目标单根肌动蛋白丝平面模型邻近区域的密度图部分，选择该模型（模型面板 > 选择）并在体积查看器中打开区域控制面板（体积查看器 > 特征 > 区域）。设置 区域半径 至 100 Å，然后单击 区域 将图谱以100为半径进行分区 Å （= 10 nm）从所选模型中测量得出。请注意，Chimera 中的尺寸单位设置为埃（Å）øm (1 Å = 0.1 nm
   11. 如有需要，可通过开启模型来调整其与密度图的拟合 移动鼠标模式多选任何未处于正确位置的模型，以将其移动至区域化密度图内的适当位置。
   12. 克服编程错误 ActinFilamentPlane.py，运行 FixingMarkerID.py 脚本，用于修复缺失的 MarkerID "原子" （球棍模型中的球）。选择整个模型并输入 运行脚本 FixingMarkerID.py 在命令行中（该脚本应通过正确的目录指定，例如 C: \ directory \ Script.py).
   13. 如果密度图显示肌动蛋白丝呈弯曲状，应通过选择相应模型并输入指令，将直的肌动蛋白丝分割为多个部分，以适应其曲率 运行脚本 dividelinks.py number. 在肌动蛋白模型内部，按照命令中指定的数量等距放置额外的标记点，从而使得 "连接点" 模型可弯曲的位置。
   14. 通过移动附加标记来调整关节，以反映曲率 "连接点" 沿分区图使用 移动鼠标模式根据需要使用 dividelinks.py 脚本。
   15. 为验证所有肌动蛋白丝是否均已正确放置于肌动蛋白密度内部，可通过点击使用裁剪条 工具 > 观察控制 > 相机 在 UCSF Chimera 下拉菜单中打开 相机控制 窗口，然后选择 侧视图 以查看相机的两个裁剪条（近裁剪面和远裁剪面）。通过左键点击并拖动两条黄色条至狭窄的狭缝中，并拖动裁剪部分以调整 鼠标中键 一次检查模型的一小部分。
       注：静纤毛肌动蛋白核心模型现已完成。
3. 膜分割
   注意：此步骤的目的是创建静纤毛膜的表面模型。
   1. 表面分割利用了 体积追踪器 工具（工具 > 体数据 > 体积追踪器).
   2. 在 体积追踪器 窗口，点击 小鼠，且仅勾选选项 在数据平面上放置标记 和 将新标记链接到所选标记。这可以精确地将标记放置在同一Z平面上（当显示单个Z平面时）。同时检查 使用鼠标中键放置标记 在 体积追踪器 窗口。
   3. 创建一个新的标记集（文件 > 新标记集）。应在 体积追踪器 窗口。
   4. 使用体积查看器在主视图窗口中显示单个 Z 平面（轴向到 Z > 一。)
   5. 利用 鼠标中键，从可见膜的一端到另一端勾画出膜的轮廓。所有标记应通过连接线从一端到另一端依次连接。
   6. 按取消选择最后一个放置的标记 Ctrl + 单击 在没有可选项目的位置上进行背景操作。这可以确保下一个放置的标记点将与新平面中的连接线相连，而不会与另一个Z平面的先前膜迹线相连。
   7. 每隔10 nm沿同一方向从可见膜的一端到另一端重复进行膜追踪。
   8. 当许多平行的膜带被分割后，进入 体积追踪器 窗口并单击 特征 > 表面。这使得表面界面在 体积追踪器 窗口。单击 创建 紧邻 表面 在膜分割的条带之间创建表面的界面。这会生成一个薄瓣状的表面模型，以填充分离的膜轨迹之间的空隙。
      注意：静纤毛膜表面模型的创建现已完成。
4. 交联蛋白建模
   注意：此步骤的目的是对肌动蛋白丝之间的交联结构进行建模。
   1. 交联分子也可以通过利用 体积追踪器 工具。
   2. 在 体积追踪器 窗口，左键单击以仅选中 在表面上放置标记 和 将新标记链接到所选标记。然后，检查 使用鼠标中键放置标记 在 体积追踪器 窗口
   3. 仅通过使用区域功能，可视化目标单根肌动蛋白丝平面模型周围的密度。设置区域 半径 至 100 Å 在半径为100的范围内可视化该密度图 Å 从选定的模型中
   4. 通过单击在交联剂的可见密度上放置标记 鼠标中键放置两个标记点（即建模一个交联分子）后，务必取消选择第二个标记点，以防止后续的交联分子模型持续与该标记点连接。
   5. 对每根肌动蛋白丝平面重复上述步骤，并将整个上述过程重复应用于交联分子可能存在的全部三个主要方向。在对角线方向划分肌动蛋白丝平面时，需手动逐个选择肌动蛋白丝模型。
      注意：对于每个肌动蛋白交联蛋白模型，我们可以记录假定的交联蛋白所连接的肌动蛋白丝上的位置。原则上，该信息可用于后续的子断层平均化分析，但这超出了本研究的范围。

4. 三维模型的定量分析

1. 缺口分析
   注意：此步骤的目的是检测肌动蛋白丝中的间隙。
   1. 可对选定项目进行分析。使用其参数（如颜色）来指定它们 检查所选内容 工具（操作 > 检查).
   2. 所选项目的颜色可通过在 UCSF Chimera 中选择任意可选项目，并修改其旁边的顏色来指定 颜色 部分的 检查所选内容 窗口。
   3. 通过在 UCSF Chimera 中选择任意标记和连接，并修改其旁边的数值，来设定标记和连接的大小。 半径 的节段 检查所选内容 窗口，其中单位为埃（Å）øm.
   4. 利用密度缺口的自动检测进行缺口分析， 原子位置处的数值 功能（工具 > 体数据 > 原子位置处的数值).
   5. 选择要读取数值的地图，方法是选中所需地图旁边的选项 体数据 部分的 原子位置处的数值 窗口。通过选择参数旁边所需的模型，选中将为所有标记分配参数的模型 分子 部分。
   6. 随着 直方图 底部的按钮 原子位置处的数值 窗口，会在一个名为新窗口中创建直方图 渲染/选择 由 属性. Ctrl + 单击 直方图上的截断点可添加或移除，并可选择不同的颜色。取消勾选 保持不透明 为场景应用透明颜色。密度低于给定阈值的标记（代表间隙）不仅可以着色，还可以被选中，从而允许我们统计间隙区域中的标记数量。要进行选择，请点击 选择 > 属性 > 值映射名称.
2. 确定肌动蛋白间距离
   1. 为测量肌动蛋白间的距离，使用 UCSF Chimera 中称为 Y 平面的单个 XZ 平面放置标记点 体积追踪器 窗口，点击 小鼠，且仅检查 在数据平面上放置标记 并取消勾选 将新标记链接到所选标记。这可以精确地将标记放置在同一Y平面上（当显示单个Z平面时）。同时检查 使用鼠标中键放置标记 在 体积追踪器 窗口中将标记放置在用于测量肌动蛋白间距的目标Y平面。
   2. 单个Y平面的肌动蛋白位置成功标记后，选择所有标记并输入命令 findclash #model-spec test self overlapCutoff -200 hbondAllowance 0 log true Linewidth 10 pbColor black 在肌动蛋白丝平面底部的命令行中。此操作可查找200距离范围内所有标记点之间的碰撞 Å (overlapCutoff -200），并生成黑色线条（pbColor 黑色）厚度为10 Å (线宽 10标记之间的距离。
   3. 由于在给定的200范围内存在重叠的标记 Å，移除那些并非仅连接最近邻标记点的冗余测量数据。通过使用 RemoveCross.py 加州大学旧金山分校（UCSF）Chimera 网站提供的脚本，可移除所有非与其相邻标记形成最短连接的重叠连接。
   4. 为了测量剩余键的距离，选择所有伪键（由 findclash）并使用 Python 脚本 pblengths.py 通过输入 运行脚本 pblengths.py. 参见从中测得的数值 回复日志 (工具 > 实用工具 > 回复日志）。然后，将获得的数值从 回复日志 并转移至电子表格或任何其他合适工具以创建直方图。

结果

通过使用冷冻电子断层扫描技术对嵌入在玻璃态冰中的未染色、冷冻水合单个静纤毛进行成像，我们获得了肌动蛋白束的密度图，其中肌动蛋白丝呈六边形排列，并由交联连接蛋白相连²³。每个体素的尺寸为0.947 nm。在IMOD切片程序中对整个断层图像（400层/379 nm）进行三维可视化观察时，可见存在沿静纤毛长轴方向排列的丝状结构，这在纵向视图（XY平面；图1A-C，上排图）以及横截面视图（XZ平面；图1A-C，下排图）中均可观察到。我们注意到，当将原始重建的体积数据围绕X轴旋转-6°、Y轴旋转-13.5°、Z轴旋转5°时，穿过400层/379 nm丝状网络的投影视图最为清晰。在此角度下，所有丝状结构彼此对齐叠加，因此对比度达到最大，这一点可从横截面视图中明显看出（图1B）。由于单个横截面切片的信号强度不足以明确区分肌动蛋白丝，我们选择对30层/28.4 nm厚度的体积进行三维渲染，该厚度在横截面视图中清晰显示出六边形排列模式。图1C（上排图）中的蓝线指示了对应30层/28.4 nm横截面薄层在下排图中的中间位置。

偏离此最佳观察角度仅±2°的微小变化，就会显著降低肌动蛋白丝网络的有序性感知（图1A、C），这表明在断层图像的三维空间中极易迷失方向。

为了说明使用自动分割方法（如分水岭分割）所面临的挑战，我们选取了一个小的子区域（以金色表示）进行分水岭分割，该操作在 UCSF Chimera 软件包中实现（工具> 体数据> Segger> 分割）。该子区域相对于整个静纤毛图谱的位置由图1B中的小插图标示。

图1D-F展示了所选子体积在不同方向上的视图，其中图1D、E显示为纵向观察方向，图1F显示为横截面观察方向。图1D-F左侧的箭头指示肌动蛋白丝的方向。

图1D-F（右侧面板）显示了分水岭分割的结果。子体积根据对象身份进行着色，不同对象被随机分配不同的颜色。不同颜色表示不同的对象身份，因此从图1D-F可以明显看出，肌动蛋白丝的密度图在丝轴方向上均出现了断裂，而连接相邻丝状结构的密度图则被赋予了相同的颜色，即相同的对象身份。换句话说，分水岭分割算法无法长时间连续追踪肌动蛋白丝的密度图，反而将相邻丝状结构的密度连接在一起。尽管可以通过手动方式对结果进行校正（例如删除或合并对象），但这种方法相当耗时且劳动强度较大。

尽管重新定向（旋转）三维图谱以使肌动蛋白丝网络轴与Y轴对齐，并使肌动蛋白丝模型平面与断层图的X-Y平面一致，并非我们的体积模型构建策略所绝对必需，但这确实有所帮助。我们将此方向称为静纤毛断层成像显示的标准方向。

因此，我们决定探索一种不同的图像分割策略，利用肌动蛋白丝整体上呈现规则排列（六边形堆积），具有规律的间距和明确的整体束状取向这一特点。我们的策略是首先对肌动蛋白束模型（作为丝状结构的阵列）进行整体拟合，随后逐步对模型位置进行区域性和局部性调整，以匹配实验获得的密度图。通过首先放置一个整体模型，我们可以克服局部密度图的模糊性，并检测模型相对于其原始排列的区域性偏差趋势，例如丝状结构的弯曲。

为了放置模型，我们以标准方向显示了密度图的切片（每9.47 nm显示10个切片），其厚度对应于单层肌动蛋白丝的厚度，并在此基础上拟合了一层规则排列的直线型肌动蛋白丝模型。这当然只是对肌动蛋白丝的一种简化，实际上每根肌动蛋白丝均由具有螺旋对称性的肌动蛋白单体线性排列而成。图2A-C展示了在不同Z轴高度上的三个代表性层面，其中红色棒状结构代表肌动蛋白丝。上方图板显示了约30个切片（厚28.4 nm）的横截面，表明了由19根棒状结构组成的单个肌动蛋白模型层所放置的Z轴高度；下方图板则显示了纵向取向（尽管以透视视角呈现）。图2D展示了完整的简化模型，包括横截面（上图）和纵向透视视图（下图）。横截面取向使我们能够较为准确地定位肌动蛋白丝。在此过程中，我们将整个体积数据重新定向以与断层图的主要轴对齐的初始操作被证明是有帮助的，因为这意味着我们的模型在标准观察方向上的取向也与主轴平行。然而严格来说，即使不进行断层图的重新定向，我们的方法仍然可行，只是将模型与密度图对齐的过程会更具挑战性。

通过仔细检查密度图的各个切片，我们注意到，从静纤毛近端向远端（即朝向尖端方向）移动时，一条完全笔直的肌动蛋白模型无法很好地拟合观察到的密度图（图3A-C）。在静纤毛尖端附近，纤维的图谱密度位移超过13 nm（肌动蛋白-肌动蛋白间距），我们可通过从静纤毛密度图的近端向远端逐步调整模型来补偿这一偏差，从而在肌动蛋白模型中引入微小但可辨别的渐进式弯曲。图3D展示了肌动蛋白丝的一层切片密度图，并叠加了与密度图拟合的体积模型。图3E比较了直线模型（红色）与弯曲模型（黄色）。通过将带有模型的密度图切片绕X轴旋转80°，可最清晰地观察到这种弯曲，从而获得沿肌动蛋白纤维方向的透视视角（图3D，E）。

如果未采用我们所采取的方法，这两种模型的偏差——肌动蛋白模型靠近顶端的位置移动距离与肌动蛋白丝间距大致相同——可能会引起极大的困惑。这种先对肌动蛋白丝模型的一层进行“全局”定位，再进行“局部”调整的方法，使我们能够检测到这种在纵向或横截面视图中几乎无法察觉的微小弯曲。然而，如图3E所示，将两个模型叠加后，便揭示出了这一细微差异。

对多个层面重复此方法，即可获得完整的三维模型（图3F），仅在静纤毛最顶端和最底端的横截面方向观察时受限于数据的不确定性（图3G）。这种密度缺失是由于（单轴）断层数据采集中的缺失楔形区域以及相应的数据分辨率各向异性所致，其影响表现为静纤毛膜缺乏清晰定义的图谱密度。

获得三维模型后，我们根据每个位置的电子密度图数值对体积模型的各个区域进行颜色编码。模型中电子密度较弱的区域用红色表示，而电子密度信号较强的区域则用黄色表示（图4A）。我们将这些呈红色的区域——其范围可延伸至数十纳米——解释为肌动蛋白丝结构中的空缺区域；由于这些空缺范围较大，无法归因于冷冻电镜密度图高噪声环境中常见的局部密度波动。噪声通常仅影响单个体素或少量体素，但不太可能导致数百个体素范围内完全缺失肌动蛋白丝密度的大范围空洞。因此，这些空缺更可能是静纤毛肌动蛋白网状结构的真实特征，可能代表了肌动蛋白更新的位点。图4A中显示了两种不同的电子密度值，分别以浅蓝色和深蓝色呈现。需要明确指出的是，我们采用的体积建模方法结合对低密度区域自动进行颜色编码的策略，是一种快速且便捷的方法，可用于检测并可视化肌动蛋白丝模型中此类空缺的分布情况，而若不采用此方法，实现这一目标将非常困难。

如图4B所示，可根据图4A中获得的结果，轻松隐藏体积模型中密度相对较弱区域的部分结构。这将产生一个更加碎片化的模型，可能更真实地呈现静纤毛中的肌动蛋白模型。若改为构建短小的肌动蛋白丝片段，则工作量将极为巨大，且可能完全失败，原因在于描述图1时所讨论的问题。

此外，体积模型使我们能够通过在肌动蛋白丝模型两侧的交叉连接处的模型点位置之间简单地放置一个连接（以红色显示），轻松地对交叉连接器进行建模（图4C）。在我们的简化方法中，无需对每个交叉连接蛋白的确切身份做出任何假设，而确定其身份通常需要更高的分辨率和/或复杂的标记方法。相反，我们只需确定是否存在连接相邻肌动蛋白丝的密度；如果存在，我们就可以在一条肌动蛋白丝与其相邻肌动蛋白丝之间放置一个短连接。在图4D中，展示了包含五个肌动蛋白丝及其交叉连接器的模型，该模型呈现了交叉连接器沿肌动蛋白丝轴向的分布情况。

构建肌动蛋白束的体视模型的另一个优势在于，可以快速确定相邻肌动蛋白丝之间的间距（图4E-H）。图4E、F 分别显示了未拟合模型和拟合了六边形晶格模型的密度图横截面视图。图4G 显示了模型中最近邻球体之间的连接。UCSF Chimera 可自动计算最近邻中心之间的距离，并将结果绘制成距离分布图（图4H）。另外两个数据集的模型构建结果见补充图1和补充图2。

图1：毛细胞静纤毛断层图像进行流域分割时遇到的挑战。（A-C）在XY平面内穿过断层三维图的纵向投影（400层切片/379 nm）（上图）和在XZ平面内的横截面视图（30层切片/28.4 nm）（下图）。（A）沿Y轴旋转-2°后的断层图，偏离其最佳取向。（B）处于最佳取向的断层图，该取向通过调整X、Y和Z轴的旋转角度确定（X = -6˚，Y = -13.5˚，Z = 5˚），图中密度图显示出高度有序性，提示存在高度有序的肌动蛋白丝网络。（C）沿Y轴从最佳取向旋转+2°后的断层图；仅绕Y轴旋转2°即显著破坏密度图中规则性的视觉感知。下图显示了从横截面方向观察时肌动蛋白丝阵列的规则性。A-C中的蓝线表示横截面薄片的位置。（D-F）一个50 nm × 50 nm × 50 nm的立方体，在流域分割前（左图）和分割后（右图）从三个不同方向观察的结果。请注意，流域分割未能识别出连续的肌动蛋白丝密度，而相邻的肌动蛋白丝及其交联结构被归为同一对象，表明流域分割不适合用于断层图像的分割。D-F中，Chimera软件中的密度图以“表面”模式显示。（A-C）比例尺 = 100 nm。（D-F）比例尺 = 50 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：构建体积分球棍状肌动蛋白丝模型。（A-C）上图：密度图的横截面视图（30 层切片/28.4 nm），其中放置了单层简化的肌动蛋白丝模型，位于不同的 Z 轴高度。下图：密度图的一个单层切片（10 层切片/9.47 nm），包含单层简化的肌动蛋白丝模型。（D）完整直线型肌动蛋白丝模型的 30 层切片/28.4 nm 横截面视图（上图）和透视视图（下图）；比例尺 = 100 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：调整模型以校正检测到的肌动蛋白丝密度弯曲。（A-C）对模型进行仔细的视觉检查，无论是横截面视图（上图）还是纵切面视图（下图），均显示模型在静纤毛近端与密度图吻合良好。然而，当向静纤毛远端移动时，所有肌动蛋白丝模型的拟合度逐渐变差。可通过将球棍模型中的球体移动至正确的密度图位置来校正此问题，从而得到略微弯曲的肌动蛋白丝模型。直线模型以红色显示，校正后的弯曲模型以黄色显示。（D）单层密度图与拟合后的弯曲模型，显示肌动蛋白密度朝向静纤毛尖端的弯曲情况。为更清晰地展示肌动蛋白丝这种细微但显著的弯曲，肌动蛋白模型已绕X轴旋转80°。（E）红色表示未经校正的直线肌动蛋白模型与黄色表示经校正后的弯曲肌动蛋白模型的比较。为便于清晰显示，仅展示肌动蛋白丝模型的一层。（F-G）显示弯曲且经校正的肌动蛋白丝的肌动蛋白束模型，分别以纵向（F）和横截面（G）方向展示。分段的膜结构以蓝色显示。在图 D 中，Chimera软件中的密度图以“网格”（Mesh）模式显示。比例尺 = 100 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：利用体积模型构建检测肌动蛋白束中的间隙。使用球棍模型量化体积特性。 （A-C）显示了静纤毛密度图约10个切片/9.47 nm厚的纵向薄片的一个小区域（蓝色），以及经过弯曲校正的肌动蛋白丝模型。（A）密度图以较低密度阈值（浅蓝色）和较高密度阈值（深蓝色）显示。在肌动蛋白丝模型中存在一些没有对应密度的区域，在这些位置，模型被标记为红色，表示缺乏密度。我们将这些位置解释为肌动蛋白丝中的间隙。（B）肌动蛋白丝模型呈现碎片化，反映了在这些间隙位置缺乏肌动蛋白丝密度。（C）在发现有强密度连接相邻肌动蛋白丝的位置，添加了连接链（红色显示）的肌动蛋白丝模型。（D）显示了三个选定的肌动蛋白丝模型，并在与相邻肌动蛋白丝连接的位置添加了连接结构（为清晰起见，相邻肌动蛋白丝未显示）。注意，并非所有可能的肌动蛋白丝间位置都被连接蛋白占据，但其中许多位置已被占据；（E）静纤毛密度的横截面30个切片/28.4 nm厚的薄片。（F）拟合到横截面30个切片/28.4 nm厚静纤毛密度薄片的肌动蛋白丝模型。（G）去除底层密度图后的肌动蛋白丝模型。通过肌动蛋白丝模型球体之间的细线连接指示，自动检测最近邻肌动蛋白丝之间的距离。（H）肌动蛋白丝模型距离的直方图。在图版 A-C 中，Chimera 中的密度图以“网格”（Mesh）模式显示。（A-C）比例尺 = 50 nm。（D）比例尺 = 25 nm。（E-G）比例尺 = 100 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：两个额外静纤毛数据集之一的模型构建。 （A-C）以网格模式显示，展示了一段长约~10切片、厚9.47 nm的静纤毛密度图的局部区域（蓝色）。初始构建的模型以红色显示，校正后的模型以黄色显示。（A）仅显示密度图。（B）将初始模型置入密度图中。（C）将校正后的模型置入密度图中。（D-E）更大范围的静纤毛区域，分别显示未叠加（D）和叠加（E）校正后模型的情况，模型拟合于一段长约~10切片、厚9.47 nm的静纤毛密度图纵向切片。（F-G）展示整个静纤毛断层成像区域。（F）仅显示图谱。（G）叠加校正后模型的图谱。（H）初始模型与校正后模型的叠加视图。比例尺 = 100 nm 请点击此处下载该文件。

补充图2：第二个额外静纤毛数据集的模型构建。 （A-C）以网格模式显示，展示了一段长约~10切片、厚9.47 nm的静纤毛密度图的局部区域（蓝色）。初始构建的模型以红色显示，校正后的模型以黄色显示；（A）仅显示密度图。（B）将初始模型置入密度图中。（C）将校正后的模型置入密度图中。（D-E）较大范围的静纤毛区域，分别显示未叠加（D）和叠加（E）校正后模型的情况，模型拟合于一段长约~10切片、厚9.47 nm的静纤毛密度图纵向切片。（F-G）展示整个静纤毛断层成像区域。（F）仅显示图谱。（G）叠加校正后模型的图谱。（H）初始模型与校正后模型的叠加对比。比例尺 = 100 nm。请点击此处下载该文件。

补充文件 1：用于静纤毛建模的 UCSF Chimera Python 脚本。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件 1：pblengths.py。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件 2：RemoveCross.py。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件 3：ActinFilamentPlane.py。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件 4：dividelinks.py。 请点击此处下载该文件。

补充代码文件 5：FixingMarkerID.py。 请点击此处下载该文件。

讨论

我们已证明，在毛细胞静纤毛的冷冻电子断层图像中，由于存在高噪声和高复杂性，自动分割方法（如分水岭分割）可能会失败。仅通过观察小范围的断层子体积，很难准确区分该丝状网络中哪些部分代表肌动蛋白丝，以及在局部环境中哪些结构构成交联物。本研究采用的模型构建方法得益于对肌动蛋白束大尺度有序结构的先验知识，这有助于建立对肌动蛋白丝取向及交联分子密度分布的预期。或许更为重要的是，人脑能够通过考虑超出局部密度分布的更大范围上下文轻松识别出模式，而计算机算法通常只能处理算法所限定的相对较小区域，因此难以有效纳入大尺度趋势信息。通过将模型整体拟合到一层密度上，我们避免了在逐段建立单个肌动蛋白丝的小片段模型时可能产生的混淆。当然，这种全局拟合假设了在较大距离上存在有序结构。然而，由于我们发现肌动蛋白丝出现了意外的、虽小但显著的渐进性弯曲，因此全局拟合仅能作为初始近似，仍需对模型进行局部调整以更好地匹配密度图。由于初始模型提供了良好的起点，这些调整可以高度可靠地完成。我们方法的一大优势在于可以选择仅显示特定定义的密度区域，从而有助于降低场景的复杂性。此外，沿肌动蛋白丝模型轴向观察密度 slab 有助于识别出意外的弯曲结构，而如果仅仅显示较小的子体积，则极有可能忽略这一特征。初始模型的放置还便于快速缩放，可在肌动蛋白丝相应层的整体视图与细节视图之间切换，以进行模型调整。

该方案中的关键步骤包括：在目视检查后对图谱进行旋转，将模型构建并放置到密度图谱中，以及将纤维模型分割成较小的片段。随后可对这些片段的原子位置进行空间调整以适配密度图谱，和/或通过颜色编码来检测其中的空缺区域。

通过使用密度图的横截面视图，将一组"原子"（即球棍模型中的球）放置到丝状结构的密度中（该横截面为10-30层切片/9.47-28.4 nm的平均密度薄片），然后用化学键（即球棍模型中的棍）将其连接，从而对肌动蛋白建模方法进行改进。我们已将此方法应用于毛细胞静纤毛尖端区域的体积模型构建，该方法是对本文详细描述的方案的一种修改²³。此外，正如本文所述，我们的体积建模方法也非常适用于膜结构的分割及模型构建。

虽然体素模型构建可应用于任何显示丝状特征的密度图，但当存在一排排列规则且间距均匀的丝状结构时，我们在此描述的技术最为高效，因为此时可以获得体素模型的全局拟合。该方法还依赖于丝状特征以渐进的方式改变其方向性。如果丝状结构中存在突然的弯曲或急剧的转折，则我们的方法在分割方面可能并不十分有效。

与此同时，我们的合作者已开发出一种自动化的纤维追踪方法，该方法遵循本文用于手动分割的类似概念^30,31。未来最佳的方法可能是将手动识别与初始稀疏模型的放置相结合——即使仅在密度中放置少数几个球体作为起点，然后由搜索与拟合算法完成纤维的后续追踪。

简化的体视模型可降低系统的复杂性，使某些特定模式（如肌动蛋白丝尖端附近的弯曲）更易于观察。此外，该体视模型还可作为"锚定点"，用于在选定的球棍模型周围显示密度区域，从而实现对相邻肌动蛋白丝之间交联蛋白密度的检测与可视化。通过选择单根肌动蛋白丝，并设定合适的半径范围以显示其内部密度，可进一步将场景中过于复杂的结构信息简化至可管理的程度。

这种先进行全局拟合、再进行局部调整的体积模型构建方法的一个优势在于，我们能够识别出肌动蛋白丝似乎出现中断的区域，而肌动蛋白丝中的显著缺口则通过电子密度图中密度的缺失得以指示。由于我们已构建了体积型的球棍模型，因此可以利用UCSF Chimera软件包中的一个常规功能，该功能根据每个模型球所在位置的电子密度值对其进行颜色编码。这种方法使我们能够快速检测并可视化肌动蛋白束中肌动蛋白丝的缺口，这是我们在冷冻电子断层成像中发现的一个具有重要生物学意义的特征，而使用传统的分割方法则很难实现这一检测与可视化。我们体积模型的另一个优势在于，可以轻松获取包括长度和距离在内的体积属性，从而获得具体数值，进而开展统计分析。

总之，交互式手动模型点放置方法，可能再结合后续的自动局部拟合和纤维追踪功能，是一种非常有前景的技术，可用于电子断层成像中亚细胞结构的可视化与定量分析。该方法结合了人脑在模式识别方面的优势以及计算机科学在模型优化方面的强大能力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Chimera	RBVI		版本 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html
Chimera	RBVI		版本 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=win64/chimera-1.16-win64.exe
Chimera	RBVI		版本 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=mac64/chimera-1.16-mac64.dmg
Chimera	RBVI		版本 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=linux_x86_64/chimera-1.16-linux_x86_64.bin
Excel	Microsoft		版本 2211 https://www.office.com/?auth=1
Falcon II	Thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/accessories-em/falcon-detector.html
IMOD	科罗拉多大学		版本 4.11.1 https://bio3d.colorado.edu/imod/download.html
PC 台式机	Intel		Windows 10，版本 22H2
PC 笔记本电脑	Gigabyte		Windows 10，版本 22H2
Powerpoint	Microsoft		版本 2211 https://www.office.com/?auth=1
Titan Krios 电子显微镜	Thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html
Word	Microsoft		版本 2211 https://www.office.com/?auth=1