反义寡核苷酸作为在人源细胞系中实现核内lncRNA长期敲低的工具

摘要

为了分析长链非编码RNA（lncRNA）在染色体不稳定性等时间依赖性过程中的功能，必须实现持久的基因敲低效果。为此，本文介绍了一种利用修饰的反义寡核苷酸在细胞系中实现持续21天有效敲低的实验方案。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）在转录水平上对基因表达发挥关键的调控作用。实验证据表明，相当一部分lncRNA优先在细胞核内富集。为了分析核内lncRNA的功能，实现这些转录本在细胞核内的高效敲低至关重要。与依赖细胞质沉默机制的RNA干扰技术不同，反义寡核苷酸（ASO）技术可通过招募RNase H至RNA-DNA双链，在细胞核内实现RNA的切割和敲低。与可能引起染色质状态改变的CRISPR-Cas基因组编辑工具不同，ASO可在不改变基因组的情况下高效敲低核内转录本。然而，ASO介导的敲低面临的主要障碍之一是其作用具有短暂性。为了研究lncRNA沉默的长期效应，需要长时间维持高效的敲低效果。本研究建立了一种可持续超过21天的敲低方案，旨在评估lncRNA敲低对其相邻编码基因RFC4的顺式调控作用，而RFC4与染色体不稳定性相关，这种不稳定性只有在长时间观察和细胞衰老过程中才能显现。本研究采用了两种不同的人源细胞系：PrEC（正常原代前列腺上皮细胞）和HCT116（来源于结直肠癌的上皮细胞系），并在所检测的细胞系中均实现了成功的敲低。

引言

人类基因组的绝大部分都会被转录，产生多种多样的转录本，其中包括长链非编码RNA（lncRNA），其数量超过人类转录组中已注释的编码基因数目¹。lncRNA是指长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的转录本^2,3 ，近年来因其在细胞中重要的调控功能而受到广泛关注⁴。研究表明，lncRNA的功能依赖于其在细胞内的定位⁵，例如在细胞核中，大量lncRNA富集并积极参与转录调控⁶以及核结构的维持⁷等多种生物学过程^8,9,10。

为了对细胞核长链非编码RNA进行功能表征，必须采用能够在细胞核内诱导敲低（KD）的方法，其中反义寡核苷酸（ASOs）是一种有效沉默细胞核转录本的工具。通常情况下，ASOs是长约20个碱基的单链DNA序列，可通过沃森-克里克碱基配对与互补RNA结合^11,12,13 并且能够通过依赖其化学结构和修饰的机制来改变RNA的功能^13,14ASO 化学修饰可分为两大类：骨架修饰和 2' 糖环修饰¹⁵，两者均旨在通过赋予对核酸酶的高抗性来提高稳定性，同时增强预期的生物学效应^13,16在骨架修饰中，磷酸氨基甲酸吗啉酯（PMO）、硫代磷酸氨基甲酸酯和吗啉代键被广泛用于剪接干扰等目的^17,18 通过充当空间位阻阻断剂¹⁹ 但不会诱导转录本的降解。另一种骨架修饰是硫代磷酸酯（PS）键，这是反义寡核苷酸（ASOs）中最常用的修饰之一。与前述修饰不同，PS键不会干扰RNase H的招募。^12,20，从而实现RNA敲低。然而，还存在多种多样的2'糖环修饰²¹；然而，就RNA敲低而言，在能够诱导高效沉默效应的修饰中，包括锁核酸（LNAs）^{22, 23} 和 2'-O-甲基修饰²⁴尽管LNA在敲低效果上已证明比其他修饰更为高效²⁵，它们可能引发不良反应，例如肝毒性²⁶ 以及凋亡诱导 体内 和 体外²⁷.

为了实现RNA敲低，具有前述适当修饰的ASO可以招募RNase H1和H2^20,28，这些酶被募集至DNA-RNA杂交体并切割靶标RNA，从而释放ASO¹³。该切割反应产生的RNA产物随后被RNA监控机制加工，导致RNA降解²⁹，而不会改变目标基因组区域，这与其他技术（如CRISPR-Cas系统）不同——后者可能因染色质状态的改变而引发非预期的生物学效应³⁰。尽管ASO技术具有诸多优势，但由于细胞分裂或ASO随时间推移发生降解，其沉默效应是暂时性的，这在研究染色体不稳定性（CIN）等时间依赖性过程时构成需要克服的障碍³¹。

具体而言，染色体不稳定性（CIN）是指染色体数目和结构发生改变的速率高于正常细胞³²，其源于有丝分裂过程中染色体分离错误，随时间推移导致基因组改变并引发肿瘤内异质性³³。因此，仅通过发现非整倍体核型无法评估CIN。为了在细胞培养中对CIN进行恰当的研究与评估，必须对细胞进行长期监测。在研究长链非编码RNA（lncRNA）敲低（KD）对CIN的影响时，需要采用能够维持较长时间KD效应的方法。为此，本实验方案采用了反义寡核苷酸（ASOs），成功在人源细胞系HCT115和PrEC中分别持续沉默lncRNA-RFC4达18天和21天。该转录本是一种长度为1.2 kb、功能尚未明确的lncRNA，定位于3号染色体（q27.3），紧邻蛋白编码基因RFC4，而RFC4基因已被报道与多种人类癌症中的CIN相关^34,35,36。

方案

注意：本方案仅限具备实验室安全操作经验的实验人员执行。在开始操作危险材料和设备之前，必须仔细阅读本方案中所使用的所有试剂和材料的安全数据表。在整个实验过程中，必须阅读、理解并遵守所在机构实验室安全手册中规定的所有安全要求。所有生物和化学废弃物的处置必须按照机构的废弃物管理和处置手册进行。如果未谨慎操作或未遵循安全的实验室规范，本方案中使用的材料和设备可能导致严重伤害。务必始终遵循机构的实验室安全手册及相关安全规程。

1. ASO 的设计

1. 按照以下方法手动设计反义寡核苷酸（ASO）。
   1. 获取靶标转录本的完整序列，并在维也纳大学RNAfold WebServer³⁷（材料表）上使用网站默认参数进行分析，以获得最小自由能（MFE）二级结构。
   2. 当结果生成后，进入MFE平面结构图，点击View In Forna，在网页上打开MFE二级结构，软件将显示所分析转录本的预测二级结构。
   3. 从预测的MFE二级结构中，在RNA上选择一段长度为20 bp的区域，在设计寡核苷酸时避免G串（连续三个鸟嘌呤的序列）。为选择ASO的最佳靶向区域，应优先选择预测内部碱基配对概率较低的区域（图1）。
   4. 从选定的20 bp区域，生成其反向互补序列。可手动构建反向互补序列，或使用在线反向互补工具（材料表）。该反向互补序列即为需合成用于实验的ASO序列。
   5. 使用NCBI核苷酸Blast（blastn）和人类基因组浏览器UCSC Genome Browser（GRCh38/hg38）分析ASO序列，确保ASO在人类基因组中不与其他转录本或其他基因组区域存在同源性。
      注：ASO的合成与纯化由商业公司完成（材料表）。
2. 确保合成的寡核苷酸具备以下特性。
   1. 确保寡核苷酸整个序列中均含有磷硫键（PS键）³⁸（图2A）。确保ASO为嵌合型，其5'端和3'端各5个核苷酸的糖环经2'-O-甲基修饰（图2B）。
   2. 确保中间10个核苷酸的糖环未修饰，以利于RNase H结合（图2C）。
   3. 要求公司采用标准脱盐法和反相（RP）高效液相色谱法（HPLC）进行纯化³⁹。
   4. 订购以冻干形式提供的ASO。
3. 将冻干的ASO溶解于不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，终浓度为200 µM。于-20 °C保存。
4. 通过将浓缩储备液稀释至20 µM浓度来配制ASO工作液。使用DPBS进行稀释，于-20 °C保存。
   注：本研究中设计了两条靶向lncRNA-RFC4的ASO。为优化ASO转染浓度及效率，参照Zong等⁴⁰的实验方案，设计并实验优化了两条ASO：ASO-lncRFC4和ASO-lncRFC4-2。经优化后，选择其中一条有效靶向lncRNA-RFC4的ASO（ASO-lncRFC4）用于长期敲低实验（补充图1）。以一条已验证高效的靶向lncRNA MALAT1的ASO作为阳性对照⁸：ASO-MALAT1。阴性对照则设计了一条靶向大肠杆菌（Escherichia coli）lacZ基因的ASO：ASO-lacZ（NCBI登录号：FN297865）。

2. 细胞的制备

注意：每次操作细胞系、溶液、材料或任何用于细胞培养的物品时，均须在细胞培养罩内进行。进行细胞培养液体操作时，应始终使用灭菌的血清移液管或带有灭菌吸头的微量移液器。在整个实验过程中，必须满足并遵守所在机构实验室安全手册中规定的所有安全要求。

1. 按以下说明为每种细胞系制备完全细胞培养基。
   1. 对于 HCT116 细胞，使用含 10% 胎牛血清（FBS）的 McCoy's 5A 培养基。
   2. 对于 PrEC 细胞，使用前列腺上皮细胞基础培养基配合前列腺上皮细胞生长试剂盒。
2. 在进行基因敲低（KD）实验时，使用三个 100 mm 培养皿（表面积为 55 cm²），每个培养皿分别用于一种寡核苷酸：靶向长链非编码 RNA 的反义寡核苷酸（ASO）、作为阳性对照使用的 ASO（ASO-MALAT1）以及作为阴性对照使用的 ASO（ASO-lacZ）。
3. 使用两个 35 mm 培养皿（表面积为 9 cm²）作为细胞传代间 KD 效果的检测点，其中一个将用含 ASO-lncRFC4 的完全转染培养基进行转染，另一个则用于 ASO-lacZ。
   NOTE: 转染操作依据脂质体转染试剂（见材料表）生产商提供的方案及先前报道的方法进行^41,42。
4. 将细胞以 1 × 10⁴ 个细胞/cm² 的密度接种至细胞培养皿中。在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育，直至细胞达到 50% 汇合度（即细胞单层覆盖 50% 培养皿表面）。当细胞汇合度达到 50% 时，即可进行本实验方案的转染。
   ​NOTE: 对于 ASO-lncRFC4 和 ASO-lacZ 的转染，分别接种一个 100 mm 培养皿和一个 35 mm 培养皿；而对于 ASO-MALAT1 的转染，仅接种一个 100 mm 培养皿（图 3A）。

3. 转染

1. 在开始实验前，将低血清培养基预热至 37 °C。
2. 进行 ASO-lacZ 和 ASO-lncRFC4 转染时，请遵循以下步骤。
   注意：ASO-lacZ 和 ASO-lncRFC4 的转染适用于表面积为 55 cm² 的细胞；若使用不同表面积，可相应调整体积。每种 ASO 均需在相同条件下单独进行该操作。
   1. 在细胞培养超净台内，取一支 15 mL 圆锥形离心管（标记为管 1），将 43.75 µL ASO（20 µM）溶于 1.4 mL 预热的低血清培养基中。
   2. 在细胞培养超净台内，取一支 1.5 mL 无 RNase 的微量离心管（标记为管 2），将 18.66 µL 脂质类转染试剂与 1.4 mL 预热的低血清培养基混合。
   3. 将管 1 和管 2 置于细胞培养超净台内，室温孵育 10 分钟。
   4. 将管 2 中的溶液（转染试剂 + 低血清培养基）缓慢逐滴加入管 1（ASO + 低血清培养基）中，避免试剂在管壁表面扩散。
   5. 将管 1 中的混合液在细胞培养超净台内室温孵育 20 分钟。
   6. 向管 1 中加入预热的低血清培养基，终体积为 8.75 mL。
      注意：最终转染培养基中 ASO 的浓度为 100 nM。
   7. 移除待转染细胞培养皿中的原有培养基，将 7.5 mL 转染培养基逐滴加入 100 mm 培养皿中的细胞单层，或将 1 mL 转染培养基逐滴加入 35 mm 培养皿中的细胞单层。通过轻轻摇晃培养皿，确保培养基均匀覆盖整个表面。
   8. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 6 小时。
   9. 在转染培养基中孵育 6 小时后，向 100 mm 培养皿中的细胞加入 7.5 mL 完全培养基，向 35 mm 培养皿中的细胞加入 1 mL 完全培养基。继续在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。
3. 进行 ASO-MALAT1 转染时，请按以下步骤操作。
   注意：ASO-MALAT1 的转染适用于表面积为 55 cm² 的细胞。
   1. 在细胞培养超净台内，取一支 15 mL 圆锥形离心管（标记为管 1），将 37.5 µL ASO（20 µM）溶于 1.2 mL 预热的低血清培养基中。
   2. 取另一管（标记为管 2），将 16 µL 脂质类转染试剂与 1.2 mL 预热的低血清培养基混合。
   3. 将管 1 和管 2 置于细胞培养超净台内，室温孵育 10 分钟。
   4. 将管 2 中的溶液（脂质类转染试剂 + 低血清培养基）缓慢逐滴加入管 1（ASO + 低血清培养基）中，避免试剂在管壁表面扩散。
   5. 将管 1 中的混合液在细胞培养超净台内室温孵育 20 分钟。
   6. 向管 1 中加入预热的低血清培养基，终体积为 7.5 mL。最终转染培养基中 ASO 的浓度为 100 nM。
   7. 移除待转染细胞培养皿中的原有培养基，将 7.5 mL 转染培养基直接逐滴加入细胞单层，同时轻轻摇晃培养皿，确保培养基均匀覆盖整个表面。
   8. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 6 小时。
   9. 在转染培养基中孵育 6 小时后，向细胞中加入 7.5 mL 完全培养基，继续在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育。
4. 每隔 12–24 小时在显微镜下观察细胞状态，直至细胞达到下一轮转染的准备条件。
   注意：当下一轮转染所需细胞汇合度达到 70% 时，应进行转染。如有需要，可更换为完全培养基。
5. 当细胞培养皿中细胞汇合度达到 70% 时，重复步骤 3.1 至 3.4，进行下一轮转染。
   ​注意：第二次转染后，应每隔 12–24 小时在显微镜下观察细胞。当细胞汇合度达到 80%–85% 时，需进行细胞收获与传代。如有需要，可更换为完全培养基。

4. 细胞收获与传代

注意：每次转染两轮后以及第2轮转染后均需进行细胞收获与传代。^nd, 4^th, 和 6^th 转染轮次。HCT116 细胞的平均收获时间为转染后 6 天^st, 3^rd, 和 5^th 转染，而对于PrEC细胞，平均时间为转染后7天^st, 3^rd，以及 5^th 转染。本方案所用的两种细胞系进行转染的时间点不同。对于HCT116细胞，2^nd, 3^rd, 4^th, 5^th，以及6^th 转染分别在首次转染后的第3、6、9、12和15天进行。对于PrEC，第2^nd, 3^rd, 4^th, 5^th，以及6^th 转染分别在首次转染后的第3、7、10、14和18天进行。请参考时间线示意图 图3 检查转染、传代和收获的时间点。

1. 按照下述方法在100 mm培养皿中进行细胞收获与传代，用于KD实验。
   1. 当细胞融合度达到80%–85%时，进行细胞收获与传代。
   2. 将完全培养基和洗涤液预热至 37 °C。将解离试剂预热至室温。将解离试剂的中和溶液预热至室温。
      注意：本实验方案中使用的两种细胞系所对应的洗涤液、解离试剂和中和溶液各不相同。HCT116细胞使用PBS（磷酸盐缓冲盐水）进行洗涤，用胰蛋白酶-EDTA溶液进行解离，解离试剂的中和使用HCT116细胞的完全培养基完成。PrEC细胞则使用HEPES缓冲盐溶液作为洗涤液，胰蛋白酶-EDTA作为解离试剂，解离试剂的中和需使用胰蛋白酶中和溶液。
   3. 在超净工作台内，从细胞培养皿中移除培养基，用 3 mL 洗涤液轻轻洗涤，随后弃去洗涤液。重复此步骤 2 次。
   4. 根据细胞系向细胞单层中加入2 mL解离试剂，在37 °C孵育3–5分钟。每2分钟观察一次细胞，直至解离完成。
   5. 根据细胞系加入2 mL中和溶液，将细胞培养皿中的全部细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
   6. 取500 µL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，置于冰上，随后进行5.1步骤的RNA提取与RT-qPCR操作。
   7. 将剩余的细胞悬液在120 x g 室温孵育5分钟，弃去上清液。
   8. 将细胞沉淀重悬于2 mL完全培养基中，然后按照标准操作程序进行细胞计数。
   9. 进行核型分析时，将细胞接种至密度为 1 x 10⁴ 细胞/厘米²² 在直径为35 mm（表面积9 cm²）的细胞培养皿中²），在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育₂ 在空气中放置24小时，然后按照标准操作程序进行核型分析。
   10. 为了在下一次细胞传代中继续进行KD实验，将细胞接种至密度为1 x 10⁴ 细胞/厘米²² 在新的直径为100 mm的细胞培养皿中。该培养皿将作为实验的第2代传代。置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育₂ 在空气中培养至细胞融合度达到50%。
       注意：如有需要，可按照标准操作流程对剩余细胞进行蛋白质提取和/或冻存。
   11. 重复步骤 3.1 至 4.1.10，对第 2 代和第 3 代细胞进行转染和收获。
2. 按照以下步骤操作，用于在35 mm培养皿中进行KD实验检测点的细胞收获。
   注意：KD 实验第一个检测点的收获时间是在第 2 天之后 2 天进行^nd 和 4^th 转染实验步骤
   1. 将完全培养基和洗涤液预热至 37 °C。将解离试剂预热至室温。将解离试剂的中和溶液预热至室温。
   2. 在超净工作台内，从细胞培养皿中移除培养基，用0.5 mL洗涤液轻轻洗涤，然后弃去洗涤液。重复此步骤2次。
   3. 弃去洗涤液后，根据细胞系加入0.5 mL解离试剂，于37 °C孵育3–5分钟。每2分钟观察一次细胞，直至解离完成。
   4. 根据细胞系加入0.5 mL中和溶液，将细胞培养皿中的全部细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中，并置于冰上。
   5. 进入第5.1步进行RNA提取和qPCR。

5. RNA 提取与逆转录 PCR

1. 将细胞悬液在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 2 分钟，弃上清液。用 600 µL 冷的 PBS（4 °C）洗涤细胞沉淀。
2. 将细胞悬液在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 2 分钟，弃上清液。
   根据标准操作流程，使用细胞沉淀进行 RNA 提取。
3. 按照实验室常规标准操作流程对纯化后的 RNA 进行 DNase 处理。在暂停点，可将纯化的 RNA 长期保存于 -80 °C。
4. 对所获得的每一份 RNA 样本，均采用标准方法进行 cDNA 合成。在暂停点，可将 cDNA 长期保存于 -20 °C。
5. 按照以下所述步骤进行标准 qPCR 操作。
   1. 在 qPCR 中，寡核苷酸用于扩增以下转录本：目标 lncRNA、MALAT1 以及一个组成型表达的基因作为内参对照（表 1）。本方案中使用 RPS28 的表达作为内参对照。
   2. 使用 ASO-LacZ 样本的 cDNA 进行 qPCR 反应，扩增内参对照、目标 lncRNA 和 MALAT1。该样本将用于对其他样本的表达进行归一化处理。
   3. 使用 ASO-lncRNA 样本的 cDNA 进行 qPCR 反应，扩增内参对照 RPS28 和目标 lncRNA。
   4. 使用 ASO-MALAT1 样本的 cDNA 进行 qPCR 反应，扩增内参对照 RPS28 和 MALAT1。反应体系配置及热循环仪条件详见 表 2。
   5. 采用 ΔΔCt 法对 qPCR 数据进行分析：首先将目标转录本的表达量相对于内参对照进行归一化，然后将目标转录本（lncRNA 或 MALAT1）的表达量相对于 ASO-LacZ 样本中相同转录本的表达量进行归一化，从而获得该转录本的相对表达水平。

结果

在本实验方案中，将反义寡核苷酸（ASOs）的应用改进为可在人源PrEC和HCT116细胞系中长期敲低核内长链非编码RNA（lncRNA）。

显然，在实验的21天内，PrEC细胞系中的KD实验是成功的，如图4所示。为证实这一结论，除了分析细胞传代期间的表达情况（图4 A-C）外，我们还分析了第1代与第2代之间以及第2代与第3代之间的检测点，共5个时间点（图4-D）。每次收获细胞时均观察到lncRNA-RFC4的有效KD，且经ASO-lncRFC4处理的细胞中lncRNA-RFC4的表达水平显著低于对照ASO-lacZ细胞。检测点的取样时间经过精心选择，安排在较长的无细胞转染间隔期间进行。本方案所用ASO的化学修饰已被证实可赋予其对核酸酶的抗性，并使ASO稳定性维持超过120小时（5天）⁵⁶。细...

讨论

如前所述，长链非编码RNA（lncRNA）在细胞中具有关键的调控功能；因此，这些转录本的失调可能与多种疾病相关。癌症就是一种以lncRNA失调为特征的疾病^43,44。在癌症中，lncRNA已被证实可作为癌基因⁴⁵或抑癌基因⁴⁶发挥重要的调控作用。其中一些lncRNA参与了癌症特征性表型的形成，能够调控例如增殖^47,48,49、临床进展、转移^48,50,51,52,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 离心管 - 15 ml 圆锥形管	赛默飞世尔科技	339650
康宁 100 mm 经组织培养处理的培养皿	康宁	430167	表面积：55 cm²
康宁 35 mm 经组织培养处理的培养皿	康宁	430165	表面积：9 cm²
不含钙、镁的DPBS	赛默飞世尔科技	14190144
胎牛血清（FBS）	ATCC	30-2020
HCT 116 细胞系	ATCC	CCL-247
HEPES，1 M 缓冲液	赛默飞世尔科技	15630122
Integrated DNA Technologies	NA	NA	https://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX 试剂	赛默飞世尔科技	13778150
McCoy's 5A 培养基	ATCC	30-2007
正常人原代前列腺上皮细胞（HPrEC）	ATCC	PCS-440-010
核苷酸序列比对 NCBI	NA	NA	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM 低血清培养基	赛默飞世尔科技	31985070
PBS（10倍浓度），pH 7.4	赛默飞世尔科技
前列腺上皮细胞基础培养基	ATCC	PCS-440-030
前列腺上皮细胞生长试剂盒	ATCC	PCS-440-040
反向互补在线工具	NA	NA	https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold 网络服务器	NA	NA	http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
无RNase的微量离心管，1.5 mL	赛默飞世尔科技	AM12400
TrypLE Express 酶（1X），无酚红	赛默飞世尔科技	12604013	胰蛋白酶-EDTA 溶液
胰蛋白酶中和液	ATCC	PCS-999-004
原代细胞用胰蛋白酶-EDTA	ATCC	PCS-999-003
UCSC 基因组浏览器，人类（GRCh38/hg38）	NA	NA	https://genome.ucsc.edu/