利用流式细胞术分析测量三维脑类器官中的多种线粒体参数

摘要

本方案报告了一种利用流式细胞仪和多种抗体同时评估多个线粒体功能参数的独特方法，包括线粒体体积的变化、线粒体呼吸链（MRC）复合物亚基的含量以及线粒体DNA（mtDNA）复制情况。

摘要

线粒体功能障碍是多种神经退行性病变常见的原发性或继发性因素，线粒体数量、线粒体呼吸链（MRC）复合物以及线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的变化通常在这些过程中起重要作用。由人诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的人脑类器官能够模拟大脑三维（3D）细胞结构排列，为在复杂的人体系统中研究疾病机制和筛选新型治疗药物提供了可能。本文报道了一种基于流式细胞术的独特方法，用于检测iPSC来源皮质类器官中的多个线粒体参数。本报告详细描述了从iPSC生成皮质脑类器官、对所生成类器官进行单细胞解离、固定、染色以及后续流式细胞分析以评估多个线粒体参数的实验方案。通过针对MRC复合物亚基NADH：泛醌氧化还原酶亚基B10（NDUFB10）或线粒体转录因子A（TFAM）与电压依赖性阴离子选择通道1（VDAC 1）的双重染色，可评估每个线粒体中这些蛋白的含量。由于TFAM的数量与mtDNA含量相对应，因此可间接估算每单位线粒体内容物中mtDNA的拷贝数。整个实验流程可在2–3小时内完成。关键的是，该方法可同时定量多个线粒体参数，包括相对于线粒体质量的总水平和特异性水平。

引言

线粒体是细胞中重要的细胞器，也是三磷酸腺苷（ATP）生成的主要场所。除了为细胞提供能量外，线粒体还参与多种细胞过程，包括细胞信息传递、细胞分化和细胞凋亡，并具有调控细胞生长和细胞周期的能力。线粒体功能的改变已在多种神经退行性疾病中被发现，包括帕金森病（PD）^1,2、阿尔茨海默病（AD）³和肌萎缩侧索硬化症（ALS）⁴。线粒体功能障碍在衰老过程中起着重要作用，表现为体细胞线粒体DNA（mtDNA）突变的累积和呼吸链功能的下降⁵。

神经退行性疾病中存在多种类型的线粒体功能障碍，在研究疾病机制和测试潜在治疗方法时，能够检测这些变化极为重要。此外，建立合适的 体外 用于重现人类脑细胞疾病特征的模型系统对于深入理解疾病机制和开发新疗法至关重要。研究人员已利用神经退行性疾病患者的诱导多能干细胞（iPSCs）生成了多种表现出线粒体损伤的脑细胞^6,7,8,9由诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的三维脑类器官的建立是疾病建模领域的重要进展。这些源自iPSC的脑类器官具有高度复杂性，并保留了患者的遗传背景，从而构建出更能准确反映患者脑部病理特征的疾病模型。

尽管已有部分研究利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的脑类器官开展线粒体相关研究^10,11,12，但目前仍缺乏便捷且可靠的实验技术，用于测定iPSC衍生脑类器官中多种线粒体功能参数。流式细胞术是一种可在单细胞水平上检测线粒体参数的有力工具，我们此前已对此有所验证¹³。本研究提供了一套详细的从iPSC生成皮质类器官的实验方案，并结合一种新型的基于流式细胞术的方法，可同时检测多个线粒体参数，包括线粒体数量、呼吸链复合体亚基以及线粒体DNA（mtDNA）拷贝数（图1）。尤为重要的是，通过将线粒体数量作为分母，本方案能够分别测定每个线粒体单位的总水平和特异性水平。

方案

1. 将iPSCs分化为皮质类器官

1. 基质包被板的制备
   1. 将市售的基底膜基质冻存管置于冰上过夜解冻。用预冷的Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12将其稀释至1:100（终浓度为1%）。分装后于-20 °C保存（见材料表）。
   2. 在4 °C条件下解冻基质溶液（保持低温），并包被所需数量的孔板（6孔板中每孔1 mL）。于37 °C孵育1小时。
   3. 从培养箱中取出孔板，使其恢复至室温（RT）（静置约1小时）。
      注意：包被好的孔板可在冰箱中保存最多2周（使用前需取出当日所需的孔板，在室温下放置至不再有凉感）。建议在3天内使用。如需长期保存，可在包被后的孔板中加入1 mL Essential 8培养基（见材料表），以防止凝胶干燥。

2. 准备受精8（E8）培养基用于iPSC培养

1. 在无菌环境中，通过将 E8 基础培养基与 E8 添加剂混合配制 E8 培养基（见材料表）。配制好的培养基可在 4 °C 保存 2 周。
   注意：配制完全培养基前，需在 4 °C 过夜解冻冷冻的 E8 添加剂。不建议在 37 °C 解冻冷冻添加剂；E8 培养基使用期限为 2 周。使用前，将当日所需的 E8 培养基在室温下回温，直至触摸时不再感觉冰凉。

3. iPSCs 的传代培养

1. 将基质包被的培养板在室温或37 °C培养箱中预热20–30分钟。将所需量的E8培养基在室温下预热。
2. 用移液器吸除培养基。
3. 用不含Ca²⁺/Mg²⁺的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS-/-）清洗诱导多能干细胞（iPSCs）（6孔板中每孔4 mL）（参见材料表）。
4. 加入乙二胺四乙酸（EDTA）（0.5 mM）（6孔板中每孔1 mL），在37 °C孵育，直至菌落边缘开始从培养板脱离（通常为3–5分钟）。
5. 吸除 解离溶液。
6. 加入预热的E8培养基（6孔板中每孔4 mL），并用高压力吹打使iPSC菌落脱落。
7. 转移至经基质包被的6孔板中的两个不同孔（每孔2 mL），并在37 °C孵育。
   注意：将培养板放入孵育箱前需轻轻摇晃。传代比例可为1:2至1:4。
8. 每日更换培养基，直至菌落融合度达到80%，且菌落大小适中、相互连接良好。
   注意：应监测大小合适的菌落，其典型特征为边界清晰、呈圆形，直径范围为0.5至1 mm。菌落应呈现致密紧凑的结构，边缘光滑且界限分明。

4. 胚状体（EB）形成与神经诱导

1. 通过组合材料表中列出的组分来制备神经诱导培养基（NIM）。
2. 吸除培养基，并用DPBS -/-（每孔4 mL，6孔板）冲洗细胞。
3. 向孔中加入预热的Accutase（每孔1 mL，6孔板）（见材料表），在37 °C孵育10分钟。
4. 使用1000 µL移液器吸头轻柔吹打溶液上下3至4次。
5. 加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中和，将含有细胞的15 mL离心管在室温下以600 × g离心5分钟。吸除上清液。
6. 通过轻柔吹打重悬细胞沉淀，直至形成单细胞悬液。
7. 使用台盼蓝¹⁴在自动细胞计数仪中计数并计算活细胞浓度。
8. 计算稀释比例，并用NIM稀释细胞，使最终细胞浓度为60,000个活细胞/mL。
9. 向细胞悬液中加入Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632（终浓度50 µM）（见材料表），轻轻混匀。
10. 将150 µL单细胞悬液加入超低吸附96孔板的每孔中（见材料表），放入培养箱中。设为第0天。
11. 第1天，观察各孔中的细胞和胚状体（EB）形成情况。
    注意：根据显微镜下EB明亮、球形且半透明的外观、其保持悬浮且相互分离的能力，以及无死亡细胞（表现为暗斑）的存在，评估EB形成的成功与否。
12. 第2天，小心从每孔中移除75 µL培养基，并向每孔加入150 µL NIM和50 µM Y-27632。
13. 第4、6、8天，从每孔中移除100 µL培养基，并向每孔加入150 µL NIM。

5. 皮质类器官的生成

1. 通过组合材料表中列出的组分，制备不含维生素A的神经分化培养基（NDM-）。
2. 第10天，使用5 mL移液管将拟胚体（EBs）从超低吸附96孔板转移至超低吸附6孔板中。小心地将八个拟胚体转移至每个孔中（图2）。向每孔加入5 mL NDM-。
3. 将培养板置于培养箱内的轨道摇床上，以80 rpm开始旋转。
4. 在第12、14和16天，吸出3 mL旧培养基后，向每孔加入4 mL新鲜NDM-。

6. 皮层类器官的成熟与长期培养

1. 准备含维生素A的神经分化培养基（NDM+）和脑源性神经营养因子（BDNF）。具体细节请参见材料表。
2. 第18天，移除3 mL培养基，并加入4 mL NDM+。
3. 将培养板放回旋转培养系统中。
4. 每4天换液一次，并在NDM+中维持分化的皮层类器官直至使用。用于后续分析的皮层类器官为25-40天龄。
   注意：皮层类器官可维持更长时间（长达3-4个月）；但由于营养交换不足，细胞活力将下降。

7. 通过免疫细胞化学和免疫荧光染色进行细胞表征

1. 使用 1000 µL 移液器轻轻从培养基中吸取类器官，并将其轻柔地放置在载玻片上，载玻片上的培养基应尽量少。
2. 在室温下完全干燥。加入 4% 多聚甲醛（PFA）（每样本 300 µL），孵育 30 分钟。去除 PFA 后，用 PBS 洗涤两次。
   注意：PFA 有毒，且疑似具有致癌性。避免接触皮肤和眼睛，应在化学通风橱中操作。
3. 向载玻片上加入 30% 蔗糖溶液（每样本 300 µL），于 4 °C 过夜孵育。
4. 使用封闭缓冲液（BB）（每样本 300 µL）对类器官进行封闭和通透处理，缓冲液包含 PBS（含 Ca²⁺/Mg²⁺）、0.3% Triton X-100 和 10% 正常山羊血清，在室温下孵育 2 小时（或 4 °C 过夜）。使用疏水屏障笔在类器官周围画圈，以防止缓冲液在载玻片上扩散。
5. 在封闭缓冲液中加入一抗（每样本 300 µL），包括抗 SRY（Y 染色体性别决定区）-box 2（SOX2，1:100）和抗神经标志物微管蛋白 β III（Tuj1，1:1000），于 4 °C 避光过夜孵育（参见 材料表）。
6. 在温和摇床上用 PBS 洗涤 3 小时，期间更换缓冲液两到三次。
7. 加入二抗（每样本 300 µL），包括抗 Alexa Fluor 488（1:800）和抗 Alexa Fluor 594（1:800），于 4 °C 湿润避光环境中过夜孵育。同时加入 Hoechst 33342（1:5000）进行核染色（参见 材料表）。
8. 吸除抗体溶液，快速用 PBS 冲洗，然后加入含 0.01% NaAzide 的 PBS，在 4 °C 保存 1–2 天以防止污染。
9. 吸除 PBS 并去除多余液体。使用封片剂封片（参见 材料表），盖上盖玻片。避免产生气泡，并将载玻片置于室温避光处至少 12 小时，使封片剂充分聚合。
   注意：样本现已准备好在荧光显微镜下成像。

8. 皮质类器官的解离

1. 在50 mL离心管中加入30 mL DPBS -/-。
2. 使用10 mL移液器轻柔地将脑类器官收集到管中。每次染色至少使用3个类器官，且类器官培养时间应超过25天但少于40天。
3. 静置约5分钟使类器官沉降。不要离心。
4. 吸除DPBS，并向管中加入2 mL预热的Accutase。将样品在37 °C水浴中孵育5分钟。
5. 使用1000 µL移液器枪头轻轻吹打15次，避免产生气泡。将样品继续在37 °C水浴中孵育5分钟。
6. 使用1000 µL移液器枪头轻轻吹打15次，使细胞充分解离，避免产生气泡（图3A）。
   注意：如果仍有未解离的细胞团块，将未解离部分转移至新的50 mL离心管中，再于37 °C水浴中孵育5分钟，然后使用1000 µL移液器枪头轻轻吹打20次。
7. 加入4 mL含10% FBS的DMEM中和反应，将含有细胞的15 mL锥形管在室温下以600 × g 离心5分钟。
8. 吸除上清液，使用1000 µL移液器枪头在200 µL DPBS中轻轻吹打重悬细胞10次，避免产生气泡。
9. 再加入200 µL DPBS，使DPBS中的细胞悬液总体积达到400 µL。
10. 使用滤膜或滤管过滤（选用35或40 µm滤膜，使用前用DPBS冲洗滤膜）。
11. 将一半溶液分装至另一管中，作为未染色对照样品使用。

9. 固定细胞中MRC复合物亚基和TFAM的流式细胞术检测

1. 加入活/死（L/D）染色染料（1:1000）（参见材料表）（根据流式细胞术标记的设置选择远红或近红外染料）。
   注意：若开启新的L/D染料小瓶，请加入50 µL DMSO进行重悬，并分装成10 µL aliquot，于-20 °C保存。
2. 室温避光孵育30分钟。加入40 mL DPBS -/-。以600 × g离心5分钟。
3. 弃去上清液后，将细胞重悬并制成单细胞悬液。
4. 用1 mL预冷的90%甲醇在-20 °C固定和透化细胞20分钟。
5. 在封闭缓冲液（1 mL）中封闭样本，封闭液含0.3 M甘氨酸、5%山羊血清和1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（含Ca²⁺/Mg²⁺）溶液。
6. 用20 mL流式缓冲液（含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS，含0.2% BSA）洗涤一次或两次。
7. 加入以下一抗孵育30分钟 （参见材料表）：Alexa Fluor 405标记的抗NDUFB10抗体（1:100）、Alexa Fluor PE标记的抗VDAC1抗体（1:100）以及Alexa Fluor 488标记的抗TFAM抗体（1:200）。
8. 用20 mL流式缓冲液洗涤。
9. 吸除液体，残留约100 µL，将细胞沉淀重悬于300 µL流式缓冲液中。
10. 将细胞转移至1.5 mL流式管中，避光并置于冰上。
11. 在流式细胞仪上进行分析（参见材料表）。使用450/50带通滤光片检测抗NDUFB10-Alexa 405信号，使用530/30带通滤光片检测TFAM-Alexa 488信号，使用670/14带通滤光片检测VDAC1-Alexa 647信号，使用780/60带通滤光片检测L/D染料信号（图3B）。

10. 流式细胞术数据采集与分析

1. 使用对照类器官的未染色和单染样本确定流式细胞仪设置的电压。
2. 使用未染色对照管根据细胞群体的大小和颗粒度设置前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）散点图图 4A).
3. 通过FSC-A和SSC-A图排除碎片以选择活细胞，利用侧向散射高度（SSC-H）排除双联体 与. SSC-A 图图4B).
4. 根据L/D染料的染色情况，通过切换至APC-cy7通道选择活细胞 与FSC-A 图图4C).
5. 使用每条样本的未染色样品，在FSC-A图中主细胞群上方绘制门控 与荧光染料通道（FITC、APC、BV 421）图谱
6. 设置流式细胞仪的补偿¹⁵.
7. 使用同型对照作为阴性对照，以观察背景染色情况。
8. 进行数据采集。
   1. 根据L/D染料的染色情况，通过切换至APC-cy7通道选择活细胞 对比FSC-A 图图4C).
   2. 利用未染色的 作为阴性对照。然后，在检测FSC-A时 与荧光染料通道（FITC、APC、BV 421）图谱中，在单细胞事件主群体上方设置门控（gate）图4D- F).
9. 使用 FlowJo 软件进行数据分析（参见 材料表).
   1. 将门控位置复制到染色的细胞样本上，记录显示阳性染色的细胞数量。
   2. 针对每个目标群体，通过分析直方图 x 轴上不同通道（FITC、APC、BV 421）的中位荧光强度（MFI）来识别线粒体信号。通过将复合物 I 亚基 NDUFB10 或 TFAM 的 MFI 除以线粒体质量指示剂 VDAC 1 的 MFI，可计算出 NDUFB10 和 TFAM 的特异性数值。

结果

图1 展示了分化过程的示意图以及用于流式细胞术分析的策略。人iPSCs在非黏附性96孔板中培养以形成拟胚体（EBs），随后转移至非黏附性6孔板中以获得完全发育的皮质类器官。通过免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察神经元¹⁶和胶质细胞标记物¹⁷，对类器官的细胞组成进行验证。将类器官解离为单细胞，以便通过流式细胞术在单细胞水平上检测多种线粒体参数。本方案中采用多种染色策略，用于获取和分析线粒体质量、MRC复合物I亚基和TFAM的含量，以及线粒体DNA（mtDNA）相对拷贝数的间接测量。本方案提供了类器官解离及获取流式细胞术数据的具体步骤。

采用 Park, I. H. 等人先前的实验方案¹⁸，通过诱导前部神经外胚层命运，从诱导多能干细胞生成皮质类器官 通过 双SMAD和MAD相关蛋白（SMAD）抑制以及Wnt（Wingless/Integrated）抑制。如图所示

讨论

本文介绍了一种从人诱导多能干细胞（iPSCs）生成皮质脑类器官的方案，以及对从这些类器官中分离出的单个细胞进行线粒体参数流式细胞术分析的方法。通过共聚焦显微镜结合神经元和胶质细胞标志物的免疫组织化学染色，验证了类器官的细胞组成。基于流式细胞术的联合染色策略，使用抗NDUFB10、VDAC1和TFAM抗体，可实现相对于细胞内线粒体数量测定复合物I和线粒体DNA（mtDNA）的特异性水平。该方案适用于测量各类类脑细胞中的线粒体，可用于线粒体功能障碍相关疾病的研究。

本方案通过联合使用双SMAD抑制和Wnt抑制，可实现脑类器官的生成。与仅采用双SMAD抑制相比，这种三重抑制可产生更为均一的皮层神经干细胞（NSC）特征²¹。某些细胞系在NIM培养基中可能需要添加10%热灭活胎牛血清（FBS），但本实验未使用FBS。为确保分化成功，诱导多能干细胞（iPSCs）在接种形成拟胚体（EBs）前应保持未分化状态。

分离脑类器官以获得具有活性的单细胞是一项关键步骤，在进行流式细胞术和单细胞RNA测序...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
流式细胞术中使用的抗体
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa Cruz Technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D 可固定近红外死细胞染色试剂盒	Life Technologies	L10119
免疫荧光染色中使用的抗体
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
anti-Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
anti-Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
商用细胞
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			由挪威奥斯陆大学基础医学科学研究所的 Gareth John Sullivan 提供
Essential 8 培养基（iPSC 培养基）
Essential 8 基础培养基	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 补充剂（50 倍浓度），使用时稀释至 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
4 °C 保存，使用前恢复至室温
仪器
Heracell 150i CO2 培养箱	Fisher Scientific, USA
轨道摇床 - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD 显微镜相机 Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
水浴锅 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
液体抽吸系统 BVC 控制	Vacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜	Leica Microsystems, Germany
50 mL Falcon 管	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
FlowJo 细胞分析软件	FlowJo LLC, USA
10 mL 移液器	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1、10、100、1000 µL 移液器	Sigma-Aldrich
40 µm 细胞筛	Sigma-Aldrich	CLS431750
超低吸附 96 孔板	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific
神经分化培养基  (NDM+)
DMEM/F12	Life Technologies	11330032
Neurobasal 培养基	Life Technologies	2110349
Glutamax 补充剂 1% (v/v)	Life Technologies	35050
N2 补充剂 0.5% (v/v)	Life Technologies	17502-048
B27 补充剂 1% (v/v)	Life Technologies	17504-044
β-巯基乙醇 50 µM	Sigma-Aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
抗坏血酸 200 µM	Sigma-Aldrich	A92902
4°C 保存，最多可保存 2 周
不含维生素 A 的神经分化培养基 (NDM-)
DMEM/F12	Life Technologies	11330032
Neurobasal 培养基	Life Technologies	2110349
Glutamax 补充剂 1% (v/v)	Life Technologies	35050
N2 补充剂 0.5% (v/v)	Life Technologies	17502-048
不含维生素 A 的 B27 补充剂 1% (v/v)	Life Technologies	12587010
β-巯基乙醇 50 µM	Sigma-Aldrich	M3148
4°C 保存，最多可保存 8 天
神经诱导培养基 (NIM)
DMEM/F12	Life Technologies	11330032
Knockout 血清替代物 15% (v/v)	Life Technologies	10828028
Glutamax 补充剂 1% (v/v)	Life Technologies	35050
β-巯基乙醇 100 µM	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µM	Tocris	1614
XAV939 2 µM	Sigma-Aldrich	X3004
4°C 保存，最多可保存 10 天
中和培养基
IMDM	Life Technologies	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
其他试剂
DPBS（无 Ca²⁺/Mg²⁺）	Thermo Fisher Scientific	14190250
牛血清白蛋白	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life Technologies	A11105-01
Geltrex	Life Technologies	A1413302
EDTA	Life Technologies	15575038
Advanced DMEM / F12	Life Technologies	12634010
神经组织解离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-092-628
Y-27632 二盐酸盐 ROCK 抑制剂	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ 封片介质	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908