方法文章

通过酶联免疫吸附测定/免疫荧光分光光度法对植物组织中的胼胝质进行定量分析

DOI：

10.3791/65833

⸱

2026年5月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案采用针对胼胝质的特异性方法——免疫荧光分光光度法/酶联免疫吸附测定（ELISA），对植物组织中的胼胝质进行定量。该方法基于植物样品中的胼胝质与特异性抗胼胝质抗体结合，随后通过酶标记的检测抗体测定其酶活性，从而对结合的胼胝质进行定量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前用于植物组织中胼胝质定量的方法包括落射荧光显微镜、荧光分光光度法、免疫荧光显微镜，以及对胼胝质合酶和β-(1,3)-葡聚糖酶活性的间接评估。然而，这些方法中的一些存在显著局限性，包括耗时、对胼胝质缺乏特异性、劳动强度大、主观性强、自体荧光高、灵敏度低、更偏向定性而非定量，以及需要获取软件资源和技术技能。因此，迫切需要探索用于植物组织中胼胝质定量的替代方法。我们假设，使用特异性识别胼胝质的抗体的免疫荧光分光光度法或酶联免疫吸附测定（ELISA）可克服当前胼胝质定量方法的部分局限性。通过将组织培养获得的香蕉苗接种Xanthomonas vasicola pv. musacearum（Xvm）细菌以施加生物胁迫，诱导胼胝质的产生。在接种后14天（dpi）采集香蕉球茎组织样本，采用新建立的免疫荧光分光光度法进行胼胝质定量。在两种香蕉基因型中，接种Xvm组与对照组球茎中的胼胝质生成量存在显著差异（独立样本t检验，p < 0.05）。本文所述的免疫荧光分光光度法可用于不同植物组织中胼胝质的定量，具有对胼胝质高度特异、高灵敏度、高可靠性和可重复性的优点。此外，使用96孔板使该方法适用于高通量的胼胝质定量研究，并最大限度地减少取样和分析偏差。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胼胝质是一种由β-1,3-葡聚糖组成的多糖，是多种高等植物细胞壁中天然存在的化合物。胼胝质由胼胝质合酶（CalS）合成，并由β-(1,3)-葡聚糖酶降解1,2,3。它参与多种生物学过程，包括生长发育以及对非生物和生物胁迫的响应4,5,6。在病原体侵染过程中，乳突中胼胝质沉积的增加有助于阻止微生物进一步定植，起到邻近植物细胞之间通透性屏障的作用2,4,7,8,9,10,11,12。通过减缓病原体在受侵组织中的入侵，胼胝质沉积为诱导其他防御反应争取了时间13。准确地在时空尺度上定量植物组织中的胼胝质，对于理解其在各种生理过程中的作用至关重要。然而，目前从植物组织中定量胼胝质的方法，包括落射荧光显微镜、免疫荧光显微镜和荧光分光光度法，均存在显著的局限性和定量挑战。因此，迫切需要探索替代方法以克服这些缺点。已有假设认为，免疫荧光分光光度法或酶联免疫吸附测定（ELISA）可能为植物样品中胼胝质的定量提供更高效的方法，具备高特异性、高灵敏度、可靠性、可重复性，并可实现高通量检测。

胼胝质定量的金标准方法是通过落射荧光显微镜对苯胺蓝染色的胼胝质颗粒进行成像14,15,16,17。苯胺蓝染色的胼胝质在蓝光或紫外光激发下呈现为黄色荧光颗粒，可通过人工计数荧光胼胝质颗粒的数量14,15，或使用自动胼胝质计数软件进行计数。人工计数胼胝质颗粒费时费力，且易受研究人员主观因素影响18，而自动计数则需要获取相应的软件资源并具备较高的技术能力。用于自动胼胝质计数的一些软件包括 ImageJ19,20,21,22、Photoshop23、CalloseMeasurer24、Icy18,25 和 Ilastik26。此外，也可采用荧光分光光度法对苯胺蓝染色的胼胝质进行定量17,19,27,28,29。然而，落射荧光显微镜和荧光分光光度法常伴随较高的背景信号或自发荧光，导致信噪比低，使这些方法难以操作且结果不可靠26。此外，苯胺蓝除了染色胼胝质外，还可染色其他β-1,3-葡聚糖30，因此使用落射荧光显微镜和荧光分光光度法检测和定量胼胝质在一定程度上缺乏特异性且不可靠。已有若干研究采用基于胼胝质特异性抗体的免疫荧光显微镜方法进行胼胝质定量31,32,33。尽管该方法与苯胺蓝染色胼胝质的落射荧光显微镜法存在一些共同缺点，但由于使用了特异性抗体，其优势在于对胼胝质具有高度特异性。此外，还曾采用基于酶活性的方法进行胼胝质定量。基于酶活性的定量方法包括检测胼胝质合酶（CalS）20,33 和 β-(1,3)-葡聚糖酶活性34,35。与落射荧光显微镜、免疫荧光显微镜和荧光分光光度法相比，基于酶活性的方法存在多个缺点，包括对胼胝质的间接估算、酶提取和酶活性测定的困难，以及胼胝质在植物组织中分布不均等问题。

由于目前胼胝质定量方法（包括落射荧光显微镜、免疫荧光显微镜、荧光分光光度法、CalS 和 β-(1,3)-葡聚糖酶检测）存在诸多缺点，亟需建立一种新的胼胝质定量方法，以具备以下优势：1）高特异性、高灵敏度、高可靠性和良好的可重复性；2）操作简便且具备高通量检测能力。免疫荧光分光光度法在胼胝质定量中的应用尚未被探索。本文报道了一种基于免疫荧光分光光度法、更具体而言是酶联免疫吸附测定（ELISA）的新型胼胝质定量方法。该方法可针对不同植物或其组织中的胼胝质进行优化，具有良好的胼胝质特异性、精确性、可重复性以及高通量实验能力。此外，若存在针对特定分析物的抗体，该方法还可被改造用于定量任何植物源性分析物。为确保准确、高效且可靠地揭示胼胝质在植物组织中的时空分布，建议同时结合使用多种胼胝质定量方法，包括显微镜技术、分光光度法以及基于酶活性的检测方法。由此可准确且高效地阐明胼胝质在多种生理过程及胁迫响应中的作用。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 实验植物的接种

  1. 使用标准程序分离、制备并确认Xvm接种物36,37。随机选取10株2个月大的组织培养来源的Musa balbisiana和Mbwazirume植株，在最年轻且完全展开叶片的叶柄背面接种200 µL（1 × 108个细胞）经PCR确认的Xvm接种物（图1）38。
  2. 同样，随机选取10 株Musa balbisiana和Mbwazirume香蕉幼苗，用200 µL无菌蒸馏水（SDW）进行接种。
  3. 将接种Xvm的香蕉植株与对照组植株置于防虫网室中，在25 °C、12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下培养，每3天浇水一次。
    ​注意：材料与设备清单见材料表，缓冲液配方见表1。

2. 球茎组织取样及样品制备

  1. 进行破坏性取样，从实验植株中获取球茎样品（图1）。
  2. 接种后14天（dpi），使用无菌外科刀片迅速切取约2 g的球茎样品，分别放入已标记的50 mL离心管中。对每株接种Xvm的植株和对照植株均采集10个样品，每个样品均按此操作。
  3. 立即将装有样品的50 mL离心管浸入液氮中。
  4. 将样品运送至实验室，并在-80 °C条件下保存直至后续使用。样品可在−80 °C下保存长达1年或更长时间，尽量减少冻融循环。
  5. 使用冷冻干燥机对样品进行72 h的冷冻干燥（图1）。
  6. 准确称取30 mg冷冻干燥后的样品，放入含有2颗钢制研磨珠的2 mL离心管中，设置速度为5，研磨1 min，使其粉碎成细粉（图1）。
  7. 将粉碎后的样品密封保存于阴凉干燥的室温环境中，直至后续使用。粉碎样品可在室温下保存最多4个月，或在−80 °C下保存最多1年，尽量减少冻融循环39,40。

3. 胼胝质的提取以及海带多糖标准品和空白对照的制备

  1. 为了从30 mg粉碎的球茎样品中提取胼胝质，加入800 µL的1 M NaOH，在80 °C水浴中孵育30分钟，每隔10分钟轻轻涡旋混合一次27,41（图1，步骤6）。
  2. 让样品冷却至室温（约5分钟），然后在15,294 x g条件下离心5分钟。
  3. 将上清液（胼胝质提取物）转移至无菌的2 mL离心管中，并用封闭缓冲液（表1）按1:2的比例稀释。
    注意：稀释倍数应根据预实验和优化结果确定。胼胝质提取物的稀释可能必要也可能不必要。如需稀释，应使用封闭缓冲液进行，并针对不同类型的样品优化稀释比例，使其落在标准曲线范围内。
  4. 将胼胝质提取物在-20 °C下保存，直至准备进行后续操作。提取物可在尽量减少冻融循环的情况下保存长达6个月。
  5. 用1 M NaOH配制浓度为100 mg/mL的岩藻聚糖标准品浓储备液6,42,43,44,45。
    注意：岩藻聚糖是一种1-3-β-葡聚糖聚合物，可作为免疫荧光分光光度法中胼胝质当量的标准品。
  6. 将配制好的标准品悬浮液置于80 °C水浴中孵育，间隔轻轻振荡，直至所有岩藻聚糖完全溶解（约20–40分钟）。
  7. 将溶解后的标准品冷却至室温（约10分钟）。
  8. 从100 mg/mL的浓储备液出发，使用封闭缓冲液配制浓度分别为80 mg/mL、60 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL和0.01 mg/mL的岩藻聚糖标准品溶液。
  9. 通过将1 M NaOH与封闭缓冲液按1:2的比例混合来制备空白对照。如果需要稀释，则使用与制备胼胝质提取物相同的稀释比例。
  10. 将岩藻聚糖标准品和空白对照在−20 °C下保存。标准品和空白对照可在尽量减少冻融循环的情况下保存长达6个月。

4. 通过免疫荧光分光光度法进行胼胝质定量

  1. 使用包被缓冲液（表 1）配制的初级抗体（1-3-β-葡聚糖特异性小鼠 IgG），向聚苯乙烯 ELISA 板的每个 96 个孔中加入 100 µL（图 2）。
  2. 用石蜡膜严密封闭酶标板，并在 4 °C 冰箱中孵育过夜。
  3. 次日，将酶标板置于实验台面上，使其恢复至室温（约 10 分钟）。
  4. 采用标准的振荡洗涤程序进行洗涤46。简要步骤如下：向各孔中加入 200 µL 洗涤缓冲液（表 1），使用数字振荡器在 500 rpm 条件下涡旋振荡 30 秒，然后用纸巾吸去液体。重复该洗涤步骤 2 次（图 2）。确保各孔不完全干燥，并使用无菌微量移液器枪头去除孔内气泡，注意不要触碰孔底和孔壁。
  5. 向每个孔中加入 200 µL 封闭缓冲液（图 2），并用石蜡膜严密封闭酶标板。在 37 °C 条件下孵育 4 小时，然后按上述方法洗涤酶标板（图 2）。
  6. 向指定孔中加入来自 10 株 Xvm 接种植株和 10 株对照植株的胼胝质提取物各 100 µL。向其他孔中加入 100 µL 的昆布多糖标准品溶液。向另外的孔中加入 100 µL 空白对照液（图 2）。
  7. 用石蜡膜严密封闭酶标板，并在 4 °C 冰箱中孵育过夜。然后按上述方法再次洗涤酶标板（图 2）。
  8. 使用封闭缓冲液配制的初级抗体（1-3-β-葡聚糖特异性小鼠 IgG），向每个孔中加入 100 µL（图 2）。
  9. 用石蜡膜严密封闭酶标板，在 37 °C 条件下孵育 4 小时，然后按上述指示洗涤酶标板（图 2）。
  10. 向每个孔中加入 100 µL 抗小鼠 IgG-碱性磷酸酶标记的二抗46,47（图 2）。
  11. 用石蜡膜严密封闭酶标板，并在 4 °C 冰箱中孵育过夜。然后按上述指示洗涤酶标板（图 2）。
  12. 向各孔中加入 100 µL 新鲜配制的对硝基苯磷酸盐（pNPP）溶液（浓度为 1 mg/mL）（表 1）（图 2）。
  13. 将酶标板置于实验台面上，在室温下孵育 30 分钟48。
    注意：孵育时间可能因植物样品和所用标准品的不同而有所变化。本研究中，昆布多糖在 30 分钟时获得最佳读数。
  14. 通过向每个孔中加入 100 µL 新鲜配制的终止液（0.5 M NaOH）来终止反应48（图 2）。
  15. 将酶标板转移至已平衡至 37 °C 的酶标仪中，以中等速度振荡 1 分钟，然后在 405 nm 波长下读取吸光度值48（图 1，图 2）。

5. 数据分析

  1. 通过海带多糖在405 nm处的吸光度与其浓度（µg/mL）进行简单线性回归，绘制标准曲线。标准曲线方程为
    Y = β1X + β0
    其中Y表示海带多糖在405 nm处的吸光度，β1为回归直线的斜率（Pearson相关系数），X为海带多糖浓度（µg/mL）的Log10值，β0为Y轴截距。
  2. 通过从样品吸光度中减去空白对照的吸光度，计算小鳞茎样品中的胼胝质浓度。然后利用标准曲线估算样品中以海带多糖当量（LE）表示的胼胝质浓度（µg/mL）。
  3. 使用Shapiro-Wilk检验对所有数据进行正态性检验，并使用Levene's检验检查方差齐性（α > 0.05）。
  4. 采用独立样本t检验比较Xvm接种组与对照组之间的胼胝质生成量（p≤ 0.05）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过分光光度法分析已知浓度的昆布多糖标准品，并记录其相应的吸光度值。利用该数据，以昆布多糖标准品的浓度为横坐标（x轴），吸光度为纵坐标（y轴），绘制了比尔-朗伯曲线。回归直线方程为 y = 0.5079x − 0.04534（图3）49。该比尔-朗伯曲线具有较高的相关系数（r）0.9988 和决定系数（r2）0.9975，表明浓度与吸光度之间存在强烈的线性关系，且因变量（吸光度）的变异中有高达99.75%可由自变量（浓度）解释（图3；p<0.0001）。因此，该模型拟合良好，准确且可靠，可用于预测昆布多糖和胼胝质的浓度。通过分光光度法测定香蕉球茎样品的吸光度，并利用回归方程代入吸光度值，计算得出各样品中胼胝质的浓度。

免疫荧光分光光度法检测显示，诱导的胼胝质显著增加 Xvm与对照组相比，两种香蕉基因型接种植株的独立样本 t-测试， p < 0.05; 图4）。对照植株在14 dpi时的胼胝质产量分别为Mbwazirume 1474.34 mg/mL和1037.11 mg/mL M. balbisiana，分别（图4）。用病原体接种植物 Xvm 导致球茎中葡聚糖的含量分别为 4190.78 mg/mL 和 1996.07 mg/mL Xvm接种的 Mbwazirume 和 M. balbisiana 分别在接种后14天观察到小植株（图4). Xvm 接种导致的胼胝质生成量是对照组植物的1.9倍至2.8倍（独立样本） t-测试， p < 0.001; 图4).

香蕉组培苗的愈伤组织检测；分光光度法、ELISA步骤示意图。
图1：采用新型免疫荧光分光光度法进行胼胝质定量的主要步骤示意图。 本图展示了从香蕉组织中定量胼胝质所涉及的主要步骤，包括通过组织培养获得组培苗、接种Xvm、采集球茎组织进行破坏性取样、样品冷冻干燥、胼胝质提取以及采用新型免疫荧光分光光度法对胼胝质进行定量。本图已重印50。 请点击此处查看此图的放大版本。

ELISA 流程图，逐步展示抗体-抗原相互作用及比色检测。
图 2：用于胼胝质定量的免疫荧光分光光度法详细示意图。 本图详细展示了用于胼胝质定量的免疫荧光分光光度法，说明了如何将各种组分加入ELISA板，以及最终如何通过分光光度法对胼胝质进行定量。本图已重印50。请点击此处查看此图的放大版本。

在405 nm处的昆布多糖吸光度与浓度关系、线性回归图、数据分析结果
图3：蛋白质定量。 基于已知浓度的昆布多糖标准品及其在405 nm处的吸光度读数绘制的比尔-朗伯曲线，用于根据球茎样品的吸光度读数计算胼胝质浓度（以昆布多糖当量，LE表示）。该图已重印49。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示接种Xvm后香蕉基因型的平均胼胝质浓度图表；统计分析。
图4：胼胝质浓度比较。 采用新型免疫荧光分光光度法测定接种Xvm后M. balbisiana和Mbwazirume香蕉苗球茎中平均胼胝质浓度的比较（均值 ± 标准误，n = 9）（独立样本t检验，α ≤ 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液   成分储存 
封闭缓冲液 10 g 牛血清白蛋白（BSA；1% w/v），溶于 1 L PBS 中。-20 °C 下可保存长达 6 个月
包被缓冲液 1.59 g 碳酸钠（Na₂CO₃）2CO3)，2.93 克碳酸氢钠（NaHCO3)，0.2 g 叠氮化钠（NaN3)，溶于1 L去离子H2O，pH 9.6-20 °C 下可保存长达 12 个月
结合缓冲液 2 g PVP（2% w/v），溶于1 L封闭缓冲液中。-20 °C 下可保存长达 6 个月
对硝基苯基磷酸酯（pNPP）溶液 将对硝基苯磷酸盐（pNPP）溶于底物缓冲液中，配制成1 mg/mL的工作浓度-20 °C 下可保存长达 12 个月
磷酸盐缓冲液（PBS）8.0 g 氯化钠（NaCl），0.2 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)，1.15 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4)，0.2 g 氯化钾（KCl），0.2 g 叠氮化钠（NaN3)，溶于1 L去离子H2O，pH 7.4-20 °C 下可保存长达 12 个月
封闭液中的初级抗体 根据制造商说明，将冻干的一抗复溶，获得浓缩储存液。用封闭缓冲液将复溶后的一抗储存液稀释至工作浓度为 2 μg/mL。-20 °C 下可保存长达 6 个月
包被缓冲液中的初级抗体根据制造商说明，将冻干的一抗复溶，得到浓缩储存液。用包被缓冲液将复溶后的一抗储存液稀释至工作浓度为 2 μg/mL。-20 °C 下可保存长达 6 个月
二抗 1:1000 的二抗浓缩液：偶联缓冲液-20 °C 下可保存长达 6 个月
底物缓冲液 97 mL 二乙醇胺，0.2 g 叠氮化钠（NaN3)，溶于1 L去离子H2O中，pH 9.8-20 °C 下可保存长达 12 个月
洗涤缓冲液 0.5 mL 吐温20（0.05% v/v），溶于1 L PBS中，pH 7.5-20 °C 下可保存长达 12 个月

表1：缓冲液配方。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫荧光分光光度法首次被应用于香蕉球茎中胼胝质的定量分析。该方法基于酶联免疫分析（EIA），利用特异性识别胼胝质的抗体，对香蕉粗提物（1 M NaOH 提取液）中的胼胝质进行定量47,51,52。简而言之，这种基于免疫荧光分光光度法的胼胝质特异性定量检测包括：将微孔板包被上特异性抗胼胝质抗体，该抗体可与植物提取物中的胼胝质结合；随后加入另一种同样特异于胼胝质的二抗。接着加入与酶（碱性磷酸酶）偶联的检测抗体，该抗体与二抗形成复合物。然后加入底物对硝基苯磷酸盐（pNPP）。样品中胼胝质的定量依赖于碱性磷酸酶将pNPP分子中的磷酸基团水解，生成黄色产物（对硝基苯酚）。通过分光光度计在405 nm波长下检测黄色产物的显色强度，并将吸光度值与碱性磷酸酶活性相关联，而酶活性与样品中胼胝质的浓度呈正比。通过加入0.5 M NaOH提高pH值以终止反应，从而阻止碱性磷酸酶的进一步活性。

相比之下，胼胝质定位与定量的标准方法是落射荧光显微镜法，该方法基于使用苯胺蓝荧光染料对胼胝质进行染色，是一种成熟可靠的技术53。简而言之，该方法依赖于苯胺蓝染料与β-1,3-葡聚糖（即胼胝质）特异性结合形成复合物。该复合物中的苯胺蓝可通过紫外光（波长365–375 nm）激发。当苯胺蓝被激发后，会发射出蓝色荧光，从而实现植物组织中胼胝质的特异性可视化53。对经苯胺蓝染色的胼胝质进行定量，需采用一系列成像技术来测定植物组织发出的荧光强度，荧光强度与植物组织中胼胝质的含量成正比。落射荧光显微镜已被广泛应用于生物胁迫条件下胼胝质的可视化与定量分析54。

在另一项研究中，采用落射荧光显微镜和免疫荧光分光光度法检测了胼胝质沉积49。尽管数据中观察到一些差异，但统计分析总体上显示落射荧光显微镜与免疫荧光分光光度法的结果具有一致性，表明这两种胼胝质检测方法具有可重复性49。尽管两种方法的结果基本一致，但仍建议将落射荧光显微镜与免疫荧光分光光度法相互补充，以获得更可靠的评估结果。尽管基于ELISA的方法具有胼胝质特异性、高灵敏度和可靠性，但在实验方案优化以及获得适用于所有浓度和吸光度的标准曲线时，初期较为耗时。

一些用于胼胝质定量的方法较为繁琐17,32,55，耗时26,56，非胼胝质特异性染色，因为苯胺蓝除胼胝质外还可染色其他β-1,3-葡聚糖30，需要昂贵且复杂的胼胝质计数软件23,24,26，需要较高的技术水平，且由于荧光分光光度法存在较强的背景干扰或自发荧光，导致胼胝质定量困难且结果不可靠26基于ImageJ等软件的自动化图像分析流程进行胼胝质定量分析时，需要对图像分析插件（如ImageJ的Trainable Weka Segmentation（TWS））进行适当的训练，这一过程十分繁琐57.

基于免疫荧光分光光度法的检测因其特异性强、灵敏度高、操作简便和可重复性好而备受青睐。然而需要注意的是，检测系统的性能及其灵敏度可能因具体检测方案和所用设备的不同而有所差异。

本文介绍了一种基于免疫荧光分光光度法的新型胼胝质定量方法。该方法可用于不同植物组织和物种中胼胝质的定量，对胼胝质具有较高的特异性、精确性和可重复性。该方法是对现有多种胼胝质定量方法的补充，可用于监测植物生长发育过程中以及在各种刺激或处理条件下胼胝质水平的变化。此外，采用96孔板可减少主观取样和分析误差，使该方法适用于高通量的胼胝质定量。值得注意的是，尽管胼胝质可从新鲜采集的植物组织中较易提取17,27,55，但本新方案中包含的冷冻干燥样品制备步骤，使得样品可在常温下长期保存（长达1年），并便于在不同实验室之间运输和储存易腐烂的生物样品。这使得无需重复进行完整的实验和新鲜样品采集，即可重复进行胼胝质提取。

对于高通量的胼胝质定量实验，推荐使用免疫荧光分光光度法，而落射荧光显微镜和免疫荧光显微镜则可用于胼胝质的定量分析以及植物组织中胼胝质的组织定位。为确保植物组织中胼胝质时空分布的准确性、高效性和可靠性，建议同时采用多种胼胝质定量方法，包括显微镜法、分光光度法以及基于酶活性的方法。这将有助于准确且高效地理解胼胝质在各种生理过程和胁迫响应中的作用。未来的研究可全面且同步地评估多种胼胝质定量方法，包括落射荧光显微镜、免疫荧光显微镜、荧光分光光度法、免疫荧光分光光度法以及基于酶活性的方法。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由比尔 & 比尔及梅琳达·盖茨基金会，资助编号 INV 009894/OPP1134098。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、稿件撰写，以及决定是否发表研究结果等方面均未参与。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝箔 Kim-Fay EA Limited, 内罗毕, 肯尼亚
分析天平 Mettler-Toledo AG, 格赖芬塞, 瑞士ML204/01
96孔珠磨机BioSpec Products Inc., 巴特尔斯维尔, 俄克拉何马州, 美国1001EUR
吸水纸 Kim-Fay EA Limited, 内罗毕, 肯尼亚
牛血清白蛋白 (BSA) Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国B14
离心机, 5425REppendorf, 汉堡, 德国5406000240
组合式冰箱-冷冻柜 (4 °C 和 −20 °C) 海尔医疗与实验室有限公司, 青岛, 中国HYCD-282
二乙醇胺 PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙191287
数字摇床, MixMateEppendorf, 汉堡, 德国5353000529
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙141679
ELISA 板, 96孔, 平底, 透明, 聚苯乙烯, 高结合力Sarstedt AG & Co. KG, Nümbrecht, 德国82.1581.200
iMark 微孔板读数仪滤光片, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., 开普敦, 南非BRD1681011
冷冻干燥机, VirTis—BenchTop “K” 系列; 型号: 4KBTXLLabWrench, 加拿大, 美国448053
盐酸 (HCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙141020
恒温强制对流培养箱, IFA-54-8Esco Lifesciences Group, 新加坡2100002
昆布多糖 Alfa Aesar, 马萨诸塞州, 美国J66193
微量离心管 1.5 mL Eppendorf, 汉堡, 德国022363204
微量离心管 2 mL Genesee Scientific Corp., 加利福尼亚州, 美国24–283
多道移液器 (30–300 μL), 12通道, 2100系列 Eppendorf, 汉堡, 德国EP-12-300R
移液器吸头 epT.I.P.S.  单个装Eppendorf, 汉堡, 德国022363204
移液器 (0.5–1000 μL), Research  plusEppendorf, 汉堡, 德国3123000900
微孔板吸光度读数仪, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., 加利福尼亚州, 美国1681135EDU
Microplate Manager 6 Version 6 软件 Bio-Rad Laboratories, Inc., 加利福尼亚州, 美国1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, 德国740751
对硝基苯磷酸 (pNPP)Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国20-106
pH计, HI9126Hanna Instruments, 伍恩斯科特, 罗得岛州, 美国02310048991
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙A2260
氯化钾 (KCl)PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙A2939
磷酸二氢钾 (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙141509
精密水浴锅, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newington, 康涅狄格州, 美国TSGP10
一抗 (1-3-β-葡聚糖特异性小鼠IgG) Bio supplies Australia Pty Ltd., 墨尔本, 澳大利亚400-2
试剂储液槽 Thermo Fisher Scientific Inc., 马萨诸塞州, 美国15075
碱性磷酸酶标记的二抗 (抗小鼠IgG-碱性磷酸酶) Sigma Life Sciences, 新泽西州, 美国A5153
叠氮化钠 (NaN3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙A1430
碳酸钠 (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙141648
氯化钠 (NaCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙A2942
碳酸氢钠 (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙141638
氢氧化钠 (NaOH)PanReac AppliChem ITW Reagents, Química SLU, 巴塞罗那, 西班牙141687.1210
Tween-20Biomatik Corporation, 安大略省, 加拿大A4031
超纯蒸馏水Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国10-977-015

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

视频即将推出

相关文章