方法文章

通过计算机模拟方法对表皮生长因子受体特异性单链可变区片段的结构分析

DOI：

10.3791/65894

⸱

2023年11月10日

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2Amity University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本抗体同源建模预测流程随后进行抗体-受体Pyrx分子对接及分子动力学模拟。这三种主要方法用于可视化准确的抗体-受体结合区域以及最终结构的结合稳定性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单链可变区片段（scFv）抗体先前由通过 (Gly4-Ser)3 连接肽连接的轻链和重链可变区构成。该连接肽使用分子建模软件设计为环状结构。本文介绍了一种针对与表皮生长因子受体（EGFR）相互作用的完整 scFv 抗体进行in silico分析的实验方案。通过同源建模、使用 Pyrx 进行蛋白质-蛋白质分子对接，以及对相互作用的 scFv 抗体与 EGFR 进行分子动力学模拟来实现分析。首先，作者使用蛋白质结构建模程序和 Python 语言进行同源建模，构建了抗体 scFv 的结构模型。研究人员下载了 Pyrx 软件作为分子对接研究的平台。分子动力学模拟则通过建模软件运行。结果显示，当对分子动力学（MD）模拟结构进行能量最小化处理后，该蛋白模型的结合能最低，为 -5.4 kcal/mol。此外，本研究中的分子动力学模拟表明，对接后的 EGFR-scFv 抗体复合物在 20 至 75 纳秒期间保持稳定，此时结构的运动幅度急剧增加至 7.2 Å。综上所述，已成功完成in silico分析，分子对接与分子动力学模拟结果证实了所设计的 scFv 免疫治疗药物作为靶向 EGFR 的特异性治疗药物的有效性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质（配体和受体）的构象变化始终基于其结构依赖的功能而发生。研究蛋白质可能的结合沟槽并预测稳定的结合相互作用，是开发更适用于人体药物的先进方法。在同源建模基础上进行分子对接和分子动力学模拟，是一种直接且准确预测受体残基与构建的抗体之间稳定相互作用的方法，这些抗体被用作特异性的个体化药物1,2。预测得到的模型结构能够揭示配体-受体结合位点的构象变化和重排情况，尤其是在抗体-受体界面区域。这些变化可能由多种因素引起，例如侧链旋转、整体结构转变或更复杂的修饰。同源建模的主要目的是区分蛋白质的三级结构与其一级结构2,3。

一种称为表皮生长因子受体（EGFR）的酪氨酸激酶受体在癌细胞中发挥多种生物学作用，包括凋亡4,5、分化6,7、细胞周期进程8,9、发育9,10以及转录11。EGFR 是乳腺癌治疗中已知的重要靶点之一12。常规激酶活性（如 EGFR）的过表达通常会导致癌细胞进展，而这种进展可被多种癌症抑制剂所抑制13。本研究选用表皮生长因子受体（EGFR）作为靶标受体，设计了特异性针对该受体的单链可变区片段。并利用其预测结构来检测抗体的结合活性。

在本文中，使用带有 Python 脚本的建模软件和同源建模方法对 scFv 抗体结构进行了建模14,15。可基于受体和配体的蛋白质及氨基酸序列构建同源模型16,17。此外，还采用了分子对接等先进的生物信息学技术，以预测小分子配体如何结合至正确的靶标结合位点。该对接方法有助于推动针对多种疾病的新型药物研发。配体的结合行为也被纳入考虑范围5,18。

此外，分子对接是一种关键的技术，可促进并加速配体-受体结合的开发。分子对接使科学家能够针对目标蛋白对配体库进行虚拟筛选，并预测配体与目标受体蛋白的结合构象和亲和力。分子动力学模拟（MNS）可展示残基在空间中的运动方式，模拟抗体向其受体的运动过程，最终为抗体设计提供指导。本研究创新性地预测了决定scFv抗体与EGFR结合方式的网格盒尺寸，并在MD模拟中检测了该结合的能量和时间。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 单链可变区片段（scFv）蛋白的二级结构预测

  1. 利用BLAST蛋白数据库（PDB）、KABAT编号系统及建模软件构建单链可变区片段（scFv）蛋白的三维结构。scFv由连接可变重链（VH）和可变轻链（VL）的连接肽（Gly4-Ser）组成。
  2. 使用分子建模软件将连接肽构建为环状结构，并按照先前研究中所述方法进行所有操作2,19,20。

2. 模板选择及scFv与EGFR的三维结构预测和同源建模

  1. 选择 EGFR 结构的模板 1ivo（基于其高分辨率）。从 pdb 网站下载 1ivo.pdb 文件，如图 1B所示。
  2. 按以下方式准备输入文件 1ivo.pdb。
    1. 在 1ivo.pdb 文件中，通过打开 pdb.org 网站并选择 1ivo 结构，在 pdb 网站的 1ivo 结构页面中查找“小分子”标题下的配体名称，以移除所有外部配体。
    2. 找到配体名称 NAG。打开从 pdb 网站下载的 1ivo.pdb 文件，并查找终止残基（TER.）。
    3. 删除 1ivo 结构中外部配体的残基，从 TER. 之后的残基开始，到残基结束之前为止。将修改后的 1ivo.pdb 文件保存至系统中。
  3. 按以下方式准备已保存的 1ivo.pdb 文件。
    1. 从窗口选择区域下载 Autodock 分子对接软件（autodock.scripps.edu）。点击打开 1ivo.pdb 文件。
    2. 使用 Edit 命令选择添加氢原子 > 添加，然后选择仅极性氢，再点击确定。
    3. 使用 Edit 命令添加 Kollman 电荷（补充图 1）。使用 Edit 命令删除水分子。将 1ivo.pdb 文件保存至计算机。
  4. 按以下方式对 1ivo.pdb 结构进行能量最小化。
    1. 从 http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html 下载 SPDBV 软件。打开 1ivo.pdb 文件。
    2. 选择全部。选择命令 Perf > 能量最小化 > 确定（补充图 2）。将 1ivo 文件保存至计算机。
  5. 使用同源建模方法准备完整的 scFv 模型，具体如下所述。
    1. 从 Windows-64 平台下载建模软件17 和 Python 脚本 3.7.9 shell。将下载的软件文件保存在 D 盘中。
  6. 按以下方式准备输入文件。
    1. 从 NCBI 网站以 fasta 格式加载 scFv 的 Pdb 文件，并将其重命名为 TARGET.ali，如补充编码文件 1所述。在 NCBI 中使用 Blast 功能选择模板，粘贴测序文件，选择 pdb 格式的 7det.pdb 模板，如补充编码文件 2所述，然后提交。随后，使用 pdb.org 网站获取模板文件。
    2. 按补充编码文件 3所述准备第三个输入文件 align2d.py（Python），其打开界面如补充图 3A所示。点击显示更多选项，然后进入使用 IDLE 编辑 > 使用 EDLE (64 位) 编辑。在 align2d.py 中使用运行模块 5 命令运行程序，以获得两个输出文件：Tar-7det.ali 和 Tar-7det.pap。
  7. 完成上述三个步骤，以使用最后一个输入文件中的命令。
  8. 添加一个新的输入文件 model-single.py（Python 命令文件），如补充编码文件 4所示，具体步骤如下。
    1. 点击显示更多选项，然后进入使用 IDLE 编辑 > 使用 EDLE3.7 (64 位) 编辑。使用（运行模块 5）命令运行程序，如补充图 3B所示。
      ​注意：生成的输出文件为同源建模的六个文件，如补充图 3C所示。

3. 受体二级结构预测与评估

  1. 按照以下方法检测同源模型的正确性和准确性。
    1. 从 https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download 下载可视化工具，为 scFv 模型和 EGFR 模型生成 Ramachandran 图。
    2. 打开文件，右键单击鼠标并选择显示序列（补充图 4）。复制该序列，并将其粘贴到三维结构图示数据库（pdbsum） www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/ 中。
    3. 选择按序列搜索，粘贴复制的序列，然后提交。生成如 图 1B、D 所示的图谱。

4. 蛋白质-蛋白质对接

  1. 下载虚拟筛选工具软件。
  2. 进入 文件> 读取分子 > 加载 1ivo.pdb。在 Autodock 面板中右键单击蛋白质以创建大分子，再次右键单击以创建配体（补充图 5）。
  3. 在 Autodock 面板中单击以选择 蛋白质，然后选择 配体。
  4. 打开蛋白质列表，然后从列表中选择 scFv 蛋白质。
  5. 进入 切换选择球体。将网格框调整至受体中心。当圆形粉红色按钮出现时，点击 前进。
  6. 为准备 scFv 抗体和 EGFR（1ivo）结构的 pdbqt 文件，请执行以下步骤：
    1. 进入 C 盘 > 程序文件 (86) > 用户，然后选择包含大分子以及保存为 pdbqt 文件的蛋白质输出文件的 pyrx 文件。
    2. 接着，保存单链可变区片段（scFv）抗体的 pdbqt 文件。
  7. 在 PyMOL | pymol.org 下载 PyMOL 软件。使用 PyMOL 软件展示 scFv 抗体与受体 EGFR 的构型。
    1. 进入文件并打开 C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein。按照以下说明准备 图 2A 中 scFv 抗体与受体相互作用的对接构型。
      1. 使用显示选项将（1ivo）-受体文件以序列残基形式显示，并设置白色背景，如 补充图 6 所示。
      2. 以更高分辨率显示对接构型文件，以便观察配体为绿色以及残基为红色。将（1ivo）-受体的刚性表面显示为黄色。
  8. 按照以下说明准备 图 2B 中 scFv 抗体与受体相互作用的对接构型。
    1. 从窗口选择区域下载对接软件。使用 Autodock 展示 scFv 抗体与受体 EGFR 的构型和构象。
      1. 在 Autodock 中选择 分析选项，然后打开 Autodock Vina 结果。进入 文件 并打开 C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein。
      2. 选择蛋白质受体的 pdb 文件，然后选择配体构型区域（scFv 抗体结构）。将受体的刚性表面与对接结构的构型连接，并隐藏受体的其余部分。隐藏远离配体连接残基的受体残基，如 图 2B 所示。
    2. 随后，该蛋白质-蛋白质复合物被认为已准备好进行分子动力学（MD）模拟。

5. EGFR-scFv 抗体对接复合物的分子动力学模拟（MD 模拟）

  1. 下载分子动力学模拟软件并按以下方式使用。
    1. 使用修复向导准备 EGFR (1ivo) pdb 文件，如补充图 7A所示。运行预处理模块以优化文件，并将优化后的文件发送至系统构建器中进行设置。
    2. 从工作目录中加载分子动力学模拟软件。添加离子并升级优化后的文件，使其达到 20 Å，然后提交作业（见表 1），如补充图 7B所示。
    3. 从导入的文件中加载 EGFR (1ivo) pdb 文件，然后选择 100 ns 的时间步长运行模拟（见补充图 7C）。
  2. 在完成分子动力学模拟后，按以下步骤开始分析。
    1. 创建一个作业文件夹并将其保存为 cms 文件。加载该 cms 文件以在分子动力学模拟中执行此步骤。
    2. 为项目文件夹创建工作目录并记录能量值。使用 S.I.D. pdf 报告模拟结果，如图 3A所示；同时报告相互作用图和氢键情况，如图 3B所示。
    3. 通过浏览文件夹加载 cms 的 pdf 文件，并使用 TIP3P 作为文件体积最小化的模型。
    4. 创建溶剂化文件以执行此步骤，如补充图 7D所示。通过软件保存 pdf 文件，并分析数据，结果如图 4、图 5和图 6所示。
  3. 通过创建 resolve 文件来生成分子动力学模拟的最终设置。在边界框中查看结果，如图 7所示。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用噬菌体展示技术，从小鼠B细胞杂交瘤细胞系C3A8中获得了抗EGFR的scFv基因20,21。根据Chua等人的方法，分别构建了单链可变区片段（scFv）中VH和VL结构的模型22。随后，使用RasMol软件以带状形式可视化这些模型。接着，通过分子建模软件，使用合成肽[Gly4Ser]3将分别建模的VH和VL结构连接起来。配体与受体的相互作用会引发局部结构变化，从而改变称为可变区末端的结合位点。抗体蛋白结构中的互补决定区（CDR）形成了天然的沟槽状结合位点，用于识别表位3,23。抗原结合导致CDR发生构象改变，使残基183适配为理想形状，并促进残基具备合适的理化性质。相较于比较抗体结合态与非结合态分子的晶体结构，动态地观察结合过程被认为是理解潜在别构三维机制的最佳途径23。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EGFR 是乳腺癌的主要靶向受体。EGFR 的过表达导致全球乳腺癌病例增加。同时，单链可变区片段（scFv）等特异性抗体能够通过血液循环快速移动，并在体内具有较快的清除速率。抗体是一种明智的选择，也是一种有效的免疫治疗药物37。因此，基于结构的药物设计必须筛选出能够特异性作用于靶受体（EGFR）的抑制性药物，例如 scFv 抗体。本研究基于in silico药物设计方法，旨在实验验证 scFv 抗体与 EGFR 蛋白-蛋白对接结构的稳定性，将其作为基于结构的药物设计策略的一部分。本研究采用分子动力学（MD）模拟方法，评估该对接结构作为乳腺癌抑制剂药物的稳定性和准确性。先前研究中提到的分子生物学实验分析21表明，scFv 抗体能够以高亲和力和高特异性与 EGFR 结合。

该方法被认为是一种验证受体与抗体对接结构之间结合相互作用稳定性的有效途径，已在多项研究中被提及38,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Autodock 软件计算结构生物学中心 AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 软件 Schrodingerwww.schrodinger.com 
下载 Discovery Studio 2021  达索系统 https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler 版本 9.24[17] 加州大学https://salilab.org/modeller/9.24/release.html
三维结构图示数据库（pdbsum）欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI） www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL 软件 SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx 软件 Sourceforge 下载 PyRx - 虚拟筛选工具 (sourceforge.net)
Windows (64位) 系统下的 Python 脚本 3.7.9 命令行环境PythonPython 发行版 Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV 软件 Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

参考文献

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