利用表面等离子体共振（SPR）技术实时检测生物分子间的动态亲和力

摘要

本研究旨在阐明表面等离子体共振（SPR）技术的原理与方法，该技术在多个领域具有广泛的应用。本文介绍了SPR技术的基本原理、操作简便性及其卓越的效能，旨在促进读者对该技术的更广泛认知与应用。

摘要

表面等离子体共振（SPR）技术是一种灵敏且精确的检测方法，可用于病毒、致病性分子蛋白和受体的检测、血型鉴定以及食品掺假分析等多种生物分子检测。该技术能够快速识别生物分子之间潜在的结合反应，实现无需标记、快速、便捷且非侵入性的多种指标筛查。此外，SPR技术还支持高通量药物筛选的实时检测。本项目简要介绍了SPR技术的应用领域和基本原理，详细阐述了操作流程，包括仪器校准和系统基本操作、配体捕获以及分析物的多循环分析。文中还深入解析了槲皮素和毛蕊异黄酮与KCNJ2蛋白结合的实时曲线及实验结果。总体而言，SPR技术为药物筛选、相关药代动力学的实时检测、病毒检测以及环境与食品安全鉴定提供了一种高度特异、简便、灵敏且快速的方法。

引言

表面等离子体共振（SPR）技术是一种光学检测技术，无需对分析物进行标记，可实现对结合亲和力、动力学和热力学参数的实时、动态定量监测。该方法具有高通量、高灵敏度和良好的重复性，能够测定多种结合速率（on rates）、解离速率（off rates）及亲和力。此外，该技术所需样品量少，进一步提升了其应用价值^1,2。这种快速响应的生物分子检测方法³通过监测生物分子间的亲和结合，已成为当前重要的研究领域。

表面等离子体共振（SPR）技术在药物研发领域具有多种应用⁴。其用途之一是揭示特定药物靶点的结构基础。该技术还可用于鉴定具有显著药理活性的中药有效成分，并研究其作用机制，以进行药物筛选与验证。Gassner 等人通过 SPR 测定建立了双特异性抗体的线性剂量-反应曲线，可用于浓度分析和质量控制⁵。此外，SPR 还可用于药典中的临床免疫原性检测以及疫苗研发⁶。

该技术可应用于农产品和食品安全检测中，用于检测农药残留、兽药残留、非法添加物、致病菌以及重金属^7,8,9,10。通过使用 SPR 技术，可提高这些检测的准确性和效率。

表面等离子体共振（SPR）技术的另一个应用领域是毒素和抗生素的快速检测。该技术可将病毒抗体、小分子化合物以及适配体固定在SPR生物传感器芯片上，随后利用该芯片检测作为分析物的不同浓度的病毒RNA¹¹。该方法已成功用于H5N1、H7N9禽流感病毒以及新型冠状病毒的快速检测^12,13,14。除上述应用外，SPR技术在蛋白质组学、药物筛选、药代动力学相关参数的实时检测，以及病毒与致病性蛋白质和受体的研究中也具有重要价值^15,16,17,18。该技术特别适用于高校和科研机构中的科学研究与教学实验，是多种科研环境下的重要工具。

表面等离子体共振（SPR）的原理是入射光波在金属薄膜与电介质界面处引发自由电子的集体振荡运动¹⁹。本质上，这是倏逝波与金属表面等离子体波之间的共振²⁰。当光从光密介质进入光疏介质时，在特定条件下会发生全反射。从波动光学的角度来看，当入射光到达界面时，并不会立即产生反射光，而是首先穿透光疏介质约一个波长的深度，然后沿界面传播约半个波长后再返回光密介质。这种穿过光疏介质的波被称为倏逝波，前提是光的总能量保持不变。由于金属中含有自由电子气，可被视为等离子体。入射光激发电子气的纵向振动，从而在金属-电介质界面处产生一种电荷密度波，称为表面等离子体波。该共振以指数衰减的形式在两种介质中传播，因此反射光的能量显著降低。反射光完全消失时对应的入射角称为共振角²¹。SPR对附着在金属薄膜表面介质的折射率高度敏感²⁰。SPR角随金属薄膜表面折射率的变化而变化，而折射率的变化主要与金属薄膜表面的分子质量成正比²²。表面介质性质的任何改变或结合量的变化都会导致不同的共振角。因此，可通过分析共振角的变化来研究分子间的相互作用。

这种基于上述原理的非破坏性、无标记、实时光学表面等离子体共振（SPR）分析适用于多个领域的研究。因此，我们以槲皮素和芒柄花素与KCNJ2重组蛋白的结合为例，通过多周期分析展示了SPR曲线的角度位移及实验结果。

方案

注意：完整的实验传感曲线表明，实验过程可分为八个不同的阶段。

1. 样品与缓冲液的制备

1. 实验前准备传感器芯片。
   1. 将芯片用piranha溶液（30% H₂O₂ : H₂SO₄ = 1:3；v/v）处理2分钟，随后用大量去离子水彻底清洗，并浸泡于无水乙醇中，自然晾干。
   2. 接着，将芯片在浓度为50 M的11-巯基-1-十一醇（MUOH）溶液中浸泡过夜。之后，将芯片置于表氯醇溶液中，在25 °C下反应4小时。
   3. 将芯片从溶液中取出，用蒸馏水和无水乙醇充分清洗。最后，在芯片的金膜表面滴加葡聚糖基础溶液，在25 °C下反应20小时。用去离子水清洗芯片，然后将其浸入溴乙酸溶液中，以实现葡聚糖羟基的羧甲基化修饰。所用槲皮素和芒柄花素的纯度分别≥98.5%和≥99%。
2. 配制所有缓冲液，包括运行缓冲液、活化剂、固定化缓冲液（10 mM醋酸钠）以及再生溶液（10 mM甘氨酸-盐酸，pH 1.5）。活化剂包含115 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、750 mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）以及10.5 mL pH 8.5的1 M盐酸乙醇胺-NaOH溶液。通过向每瓶中加入10 mL过滤后的去离子水溶解EDC和NHS（见材料表）。
   ​注意：EDC和NHS分装后应储存于-18 °C或更低温度，分装物需在2个月内使用完毕。所有溶液在使用前均应脱气。

2. 仪器校准

1. 在裸金表面注入不同浓度的酒精（体积比分别为 2%、1%、0.5%、0.2% 和 0.1%），测定其峰值，并绘制酒精浓度与峰值得标准曲线。
   注：以 50 µL/min 的流速进样，通过 Origin 数据分析软件获得标准曲线。
2. 根据技术手册，使用以下公式计算仪器的校正因子 K：
   K = Δθ / Δ[(A-B)/(A+B)]
   其中，A 和 B 代表相应检测器的信号值。手册中给出的理论斜率值为 0.06，因此校正因子 K 可计算为 K = 0.06 / R（R 为标准曲线线性回归方程的斜率）。
3. 将测得的 Δ[(A-B)/(A+B)] 值乘以校正因子，得到实际的 Δθ 值。

3. 基本系统操作

1. 启动系统时，打开电源开关，等待检测单元达到预设温度（通常为 25 °C）。
2. 通过点击 开始 > 程序 > OpenSPRTM 控制软件 打开控制软件，软件运行后将自动连接至主机系统。
3. 按照 SPR 仪器的标准操作程序安装 COOH 芯片（葡聚糖基芯片）。首先，在 SPR 生物芯片背面滴加一滴雪松油。然后，将 COOH 芯片贴附到传感器的棱镜表面，确保芯片与棱镜之间无气泡。最后，安装流路池并将其拧紧至光斑位置。
   注意：将流路池放入指定槽位，并使用固定螺钉牢固固定。通道尺寸为 10 mm x 1 mm x 1 mm。
4. 芯片放置
   1. 要打开芯片舱门，请从 工具 菜单中选择 插入芯片 选项。如果芯片仓中已有芯片，请在 工具 菜单中点击 弹出芯片 选项。
   2. 若使用新芯片，请从芯片类型下拉菜单中选择相应的 芯片类型，并填写与芯片相关的实验信息作为芯片 ID。芯片批号可选填写。若为已使用过的芯片，请选择 重用芯片，并在芯片 ID 下拉菜单中查找对应的芯片信息。
   3. 手持芯片时使文字面朝上，沿芯片上箭头所示方向轻轻将芯片推入卡槽，最后关闭芯片仓门。
   4. 点击 对接芯片 按钮。芯片放置完成后，系统将自动切换至待机状态。
   5. 为以高流速冲洗整个内部流路系统，请选择 工具 > 引导命令 > 开始。整个过程耗时 6–7 分钟。点击 关闭 可自动将系统切换至待机状态。
5. 按住管架右侧的 黑色按钮 ，向左打开金属盖。放置合适的试管后，轻轻合上金属盖。若听到咔哒声，则表示金属盖已锁定。
6. 沿卡槽方向轻轻推入试管架至样品仓，听到咔哒声表示试管架已到位并锁定。
7. 在 弹出架托盘 对话框中点击 确定，系统将自动将样品架送入样品仓并关闭舱门。
   注意：样品舱门开启时有时间限制。开启 60 秒后舱门将自动关闭。最后 15 秒内，对话框中的倒计时将以红色字体闪烁显示。请等待舱门完全关闭后再重新开启，以避免夹伤手指。
8. 响应信号归一化
   1. 选择 工具 > 更多工具，在 维护工具 目录中选择 归一化，然后点击 开始 > 下一步。
   2. 向一支 7 mm 试管中加入 120 µL 的 70% BIA 归一化溶液。将试管置于程序指定的位置（R2F6）。确认试管架盖已正确关闭后，将试管架放入样品仓，关闭舱门，然后点击“开始”以运行程序。

4. 配体捕获

1. pH 值测定
   1. 在将配体固定于芯片之前，需筛选合适的配体缓冲液 pH 值，通过静电吸附使配体富集于芯片表面附近，以获得更优的偶联效果。通常配体浓度为 10–100 µg/mL，首次实验建议使用 20 µg/mL。
   2. 使用 10 mM 醋酸钠缓冲液，pH 值分别为 5.5、5.0、4.5 和 4.0 的条件进行配体筛选。设置实验参数时，选择 Run-Wizard, Surface Preparation-Immobilization pH Scouting，然后点击 New。
   3. 选择芯片通道，可从通道 1、2、3 或 4 中选择。缓冲液有四种预设条件：10 mM 醋酸钠，pH 值分别为 5.5、5.0、4.5 和 4.0。接下来输入配体名称、接触时间（180 s）和流速（5 µL/min）。
   4. 用 50 mM NaOH 再生芯片表面后，设定芯片表面温度和样品室温度。然后在左侧选择样品架和试剂架1，并根据样品架中的对应位置放置溶液。保存实验方法后，点击 Next 开始实验。
2. 配体固定
   1. 选择 Run-Wizard, Surface Preparation-Immobilization，然后点击 New。设定流动相通道为四个通道：FC1、FC2、FC3 和 FC4。通常在配对使用通道 1 和 2 时，通道 1 作为参考通道；当四个通道均用于偶联时，通道 3 作为参考通道。
   2. 参考通道可用于空白对照或激活-封闭无配体固定，例如使用通道 1 和 2 在通道 2 上偶联配体。
      ​注意：有两种偶联模式可供选择：目标固定水平模式和指定接触时间模式。在目标固定水平模式中，输入目标偶联水平，软件将自动达到相应水平；接触时间模式则需输入注入时间和流速，通常基于预实验结果进行设置。

5. 多循环分析物方法

1. 运行Prime程序，用固定缓冲液填充注射器和腔室。选择Run-Manual运行模式，在流路中选择串联的Channels 1-2，然后点击Start。
2. 以最大流速（150 µL/min）开始运行，并检测缓冲液HEPES（pH 7.4）。当达到稳定基线时，用缓冲液冲洗样品环并排空样品环。
   注意：如果在10分钟内未达到基线（缓冲液运行时传感曲线上形成的平衡线），可尝试注入10 mM氢氧化钠溶液30秒。
3. 用EDC/NHS（1:1，各50 µL）溶液活化芯片。
4. 以活化缓冲液稀释配体后，取200 µL样品以4分钟时间注入。待结合稳定后，用缓冲液冲洗样品环。
5. 取200 µL封闭溶液进样，用缓冲液冲洗样品环，并用空气排空。观察基线5分钟以确保稳定性。
6. 用缓冲液溶液稀释分析物，分别取3.9 µM、7.8 µM、15.625 µM和31.25 µM的槲皮素，以及15.625 µM、31.25 µM、62.5 µM、125 µM和250 µM的芒柄花素作为样品，在20 µL/min流速下进样。
7. 蛋白质（10 µg/mL–50 µg/mL）与配体的结合时间为240秒，自然解离时间为360秒。将流速提高至150 µL/min，并注入适当的再生缓冲液以去除分析物。

6. 再生

1. 对于再生，使用 10 mM 甘氨酸-盐酸、高盐或不同 pH 值的酸碱溶液（例如 2.5、4.5、5.0、5.5 等）。
2. 为筛选再生条件，使用运行向导-分析开发-再生条件筛选并点击 新建。在流路中选择 1-2 个串联的通道，选择芯片，然后点击 下一步。
3. 为预热芯片，点击 启动，此步骤应重复 3 次以上。输入分析物名称，并将再生溶液的流速设置为 150 µL/min。

7. 数据分析

1. 使用 SPR 数据分析软件，采用“1:1”分析模型分析实验结果。
   ​注意：整个过程均在运行缓冲液中进行。SPR 检测过程中使用的其他缓冲液与进样缓冲液相同。

8. 系统维护

1. 实验结束后，取下检测芯片并更换为维护芯片。将运行缓冲液替换为足量的新鲜纯水，并用“引液”功能冲洗系统。引液完成后，系统将自动进入待机模式，以清洗废液瓶并更换针头用水。

结果

为了确定蛋白质是否固定在芯片表面，使用 SPR 传感器图的纵坐标（响应信号），同时获得 SPR 曲线的角度位移。图 1、图 2 和 图 3 描绘了在 KCNJ2 重组蛋白固定化表面，槲皮素和芒柄花素与 KCNJ2 重组蛋白相互作用的 SPR 曲线，其浓度范围为 3.9 µM 至 250 µM，并以对照组进行校正。为尽量减少由质量传递效应引起的误差，KCNJ2 重组蛋白分子不仅以低浓度固定，而且在动力学测试期间采用了 20 µL/min 的较高流速。因此，获得了槲皮素和芒柄花素的剂量-响应传感图。表 1 和 表 2 列出了动力学速率常数（结合速率常数 Ka；解离速率常数 Kd）以及解离平衡常数 KD 的计算结果。比较两者发现，芒柄花素的 Ka 常数高于槲皮素，表明其形成复合物所需时间更短；相反，槲皮素的 Kd 常数低于芒柄花素，说明当更多 KCNJ2 重组蛋白固定在表面时，槲皮素降解该蛋白所需时...

讨论

表面等离子体共振（SPR）分析循环分为四个阶段。第一阶段为基线期，注入缓冲液。随后进入第二阶段，即配体捕获。使用EDC/NHS（1:1）以20 µL/min的流速活化COOH传感器芯片，然后以20 µL/min的流速用1 M盐酸乙醇胺-NaOH对芯片进行封闭。进入第三阶段，即多循环分析物法。以20 µL/min的流速将分析物注入通道，进行240秒的结合期，随后进行360秒的解离期。结合与解离过程均在运行缓冲液中进行。根据分析物浓度由低到高的顺序重复进行分析物循环。每次相互作用分析循环结束后，需使用10 mM甘氨酸-HCl作为注入缓冲液，以150 µL/min的流速对传感器芯片表面进行彻底再生，以去除残留的分析物。随后，通过重复分析物注入和再生步骤，进行下一个浓度的循环。最后，在第四阶段，通过在运行缓冲液中以150 µL/min的流速注入10 mM甘氨酸-HCl对芯片进行再生。该循环可实现对多种指标的快速、无损筛选，有助于高通量药物筛选²³。

此外，该技术可检测早期抗体反应并预测可能的结果²⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）	Nan Jing Reagent,南京,中国	C08296594
无水乙醇	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	459836
BIAnormalizing 溶液	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	49781
封闭溶液	博生生物技术有限公司, 上海, 中国	110050
溴乙酸	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	17000
毛蕊异黄酮	普世生物技术有限公司, 成都, 中国	PU0124-0025
葡聚糖	康赛普科学仪器有限公司, 上海, 中国	PM10036
表氯醇	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	492515
乙醇胺盐酸盐	远业生物科技有限公司, 上海, 中国	S44235
甘氨酸-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	3587191
H2SO4	南通高新技术产业开发区, 中国	2020001150C
HEPES	西亚试剂有限公司, 山东, 中国	S3872
KCNJ2（人）重组蛋白	Abnova, 西美杰科技有限公司, 北京, 中国	H00003759-Q01
MUOH	吉至生化科技有限公司, 上海, 中国	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	SX0603
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	远业生物科技有限公司, 上海, 中国	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
槲皮素	普世生物技术有限公司, 成都, 中国	PU0041-0025
COOH 传感器芯片	Nicoya
乙酸钠	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	229873