利用自动化液体处理技术实现去黄化玉米叶片原生质体的高通量转基因表达研究

摘要

本方案描述了使用自动化液体处理仪创建随机转染布局的方法、黄化玉米叶片原生质体的分离方案，以及利用液体处理仪进行96孔板转染的操作流程。

摘要

近年来，植物生物技术领域取得了显著进展，彻底改变了针对多种用途对植物进行操控和改造的能力。然而，随着该领域研究的多样性和复杂性日益增加，迫切需要在早期阶段采用高效、可靠且高通量的瞬时筛选方法，以缩小后续进行稳定转化的策略范围。近年来重新受到关注的一种方法是利用植物原生质体，目前已有多种物种、组织和发育阶段的原生质体分离与转染技术。本文介绍了一种在96孔板中随机化质粒制备的简单自动化流程、一种黄化玉米叶片原生质体的分离方法，以及一种自动化转染程序。在植物生物技术中采用自动化解决方案——以这些新型液体处理原生质体转染流程为代表——相较于传统人工方法是一次重大进步。通过利用自动化技术，研究人员能够轻松克服传统方法的局限性，提高实验效率，加快科研进程。

引言

植物原生质体转染是一种将外源遗传物质导入去除细胞壁的植物细胞的技术，在过去半个世纪中，该技术已涵盖多种物种，支持了植物生物技术研究的发展。然而，即使每次分离能获得数百万个原生质体，这些方法的应用仍可能费时费力且适用范围有限。传统的植物原生质体转染方法通常操作繁琐、耗时较长、易受变异影响且技术要求高，导致其仅适用于少数特定体系，且重复性较差¹。然而，近年来自动化解决方案的出现为这项已有60年历史但仍具活力的技术带来了新的发展机遇^2,3。通过自动化实现材料准备、聚乙二醇（PEG）孵育以及后续转染试剂分配等关键但重复性高的步骤，研究人员可显著减少手动操作需求及其他潜在的人为误差来源⁴。此外，自动化液体处理系统所提供的精确控制和操作均一性，可确保转染结果的一致性和可重复性。

尽管原生质体分离是一个精细的过程，涉及切碎、消化、孵育、过滤和离心等步骤，但这些方案中的转染部分非常适合由自动化液体处理设备完成。大多数原生质体转染方案采用聚乙二醇（PEG）介导的方法，将分离得到的原生质体与PEG及纯化的质粒DNA在特定时间、精确浓度（取决于物种和组织类型）条件下混合，从而使细胞吸收质粒DNA⁵。转染后需进行一系列洗涤步骤，最终进行过夜孵育⁶。如果实验设计和操作均正确，在孵育结束后，可实现目标组分的表达和/或对不同调控元件的潜在功能进行评估⁷。该过程中涉及的所有吸液、加样以及振荡/混合步骤通常由手动移液器完成。若以手工方式逐个处理反应体系，不仅费时费力，还会在样本之间引入不必要的变异，同时限制了单次可处理的样本通量。在制药行业中，针对哺乳动物细胞或昆虫细胞操作以及化学合成的自动化方案已应用多年^4,8,9。目前，原生质体的应用以及涉及植物材料自动化液体处理的实验方案正在日益增多^10,11,12,13。

采用自动化液体处理方案进行植物原生质体转染在科研应用中具有广阔前景。研究人员能够探索更大规模的基因文库，以更快的速度筛选特定基因功能，并更全面地研究与植物胁迫相关的复杂遗传相互作用¹⁴。利用96孔板并结合荧光筛选的自动化方法具备良好的可扩展性，可实现高通量实验，使科学家能够快速生成数据和见解，从而推动植物生物技术的进步¹¹。然而，随着通量的提高，产生的数据点可能达到数百甚至数千个，因此必须加强质量控制，以排除可能干扰结果的各种误差来源¹⁵。在多个科学领域中已被确认为影响因素之一的是边缘效应。一些缓解策略建议选用特定类型的酶标板，或在孔间空隙及最外层孔中加入水以对抗该现象^16,17。然而，这些策略会增加操作时间，且当特定一次性耗材不可获得时，唯一的选择只能是降低标准或推迟实验。相比之下，采用通过区组设计来校正该效应的策略，则无需牺牲通量，也不会延误实验进程。

本研究针对原生质体实验中固有的变异性问题，提出了一种去黄化玉米叶片原生质体实验方案及两种自动化方法，如图1所示。该方案通过自动化标准原生质体方法中的多个步骤、转染所用容器中质粒材料的分配以及转染过程本身，以减少实验偏差。这些方法以去黄化玉米叶片原生质体平台为例进行演示，因为该平台具有特征明确、操作简便且效率高的优点。文中详述的所有步骤均可直接应用于采用相似或相同缓冲液体系的原生质体转染实验方案中。然而，在采用这些技术之前，应特别注意不同原生质体来源组织及物种所具有的独特性质。通过自动化改进，本方法简化了单个实验的材料准备流程，并显著提高了实验通量，从逐个顺序转染提升至可同时处理96个转染反应。本研究还将阐明采用随机不完全区组设计以校正微孔板位置偏差的合理性。

方案

1. 转染板的制备

1. 甲板布局创建：为了创建DNA板随机化方法，打开液体处理仪软件。从菜单栏点击新建方法按钮以创建新方法。在起始行和结束行之间，通过左侧面板上的仪器设置按钮添加仪器设置行。
   注意：与本自动化方案配套的相关截图可在补充图1、补充图2和补充图3中找到。
2. 点击仪器设置行，从耗材类别菜单中找到正确的实验耗材，并将其拖放到甲板布局中，如补充图1所示。
   注意：如果该耗材此前未定义，则需根据制造商的规格将其编程至液体处理仪中，但此类操作不在本方案的范围之内。
3. 文件导入转移：在步骤调色板中点击从文件转移按钮，并将从文件转移行放置在仪器设置行下方。确保吸头选择与更换方式如补充图3所示。
4. 勾选文件包含标题行，并确认列信息正确无误。
5. 点击源区域以激活该区域，然后从甲板布局中选择源板，定义目标板，并输入需移液的DNA量。
6. 点击自定义按钮，以详细设定移液技术，例如吸头触碰管壁的操作。
7. 指定需转移的质粒DNA量。本方案中每转染（每孔）使用20 µL浓度为1 µg/µL的质粒DNA。
   注意：在原生质体转染前转移至转染板的质粒DNA量取决于所使用的原生质体平台。
8. 创建一个从文件转移的.csv文档。
   1. 该文档包含两列。准备第一列，即“From”列，用于指示储存质粒DNA在试管架中的位置。例如，样本1对应A01孔。由于该转移操作重复三次（三个重复），因此在From列中应有三行均标注为A01。
   2. 准备第二列，即“To”列，用于指定质粒构建体在96孔板中的目标孔位。例如，样本1（A01）可对应B02、D04和H07孔。将此文件保存为.csv格式，以便与液体处理仪软件兼容。
9. 运行方案前，请检查甲板位置是否已正确装载，耗材是否已正确定义，随机化文档是否包含了试管架中所有样本DNA的孔位信息，以及管中是否有足够的质粒样本以完成整个方案。
10. 展开“从文件转移”步骤的文件属性菜单，选择已创建的.csv文件，并运行方案。
11. 方案成功完成后，用铝箔封膜覆盖转染板。将转染板储存于-20 °C，直至使用。在步骤3.3中，将把分离得到的去黄化玉米叶片原生质体加入此转染板中。

2. 黄化玉米叶片原生质体的分离

1. 开始分离黄化玉米叶片原生质体时，应选用适合原生质体分离的遗传背景材料，例如本实验所用的NP222¹⁸。实验开始前仅需配制三种缓冲液，即MMg、W5和WI缓冲液（见表1），并置于4 °C保存。消化液和PEG溶液应在实验当天配制，以获得最佳效果。
2. 将25粒种子进行表面灭菌：先将其浸入25%商用漂白剂溶液中，在旋转平台摇床上室温振荡约15至20分钟。
3. 振荡结束后，用无菌水（去离子水）彻底冲洗种子，重复冲洗5次。随后将种子在无菌水中室温浸泡过夜。
4. 次日将种子播种于湿润且经高压灭菌的土壤中。加入干燥的黏土颗粒以吸收土壤中多余水分，防止真菌污染。
5. 将玉米幼苗置于28 °C、16小时光照的培养室中（相对湿度（RH）为30%）生长约3天，直至胚芽鞘高出土壤1–2 cm，然后转移至相同温度和相对湿度的暗室中继续培养5–7天。
6. 在第一叶环上方剪取第一片真叶组织用于后续操作。
7. 将叶片组织短暂浸入含25%商用漂白剂和250 µL 20% Tween 20的溶液中进行表面灭菌1分钟，随后用去离子水彻底冲洗5次。
8. 用无绒纸巾轻轻吸干玉米叶片组织表面水分，使用锋利刀片切除每片叶尖和叶基部约1.5 cm的部分。
9. 将剩余叶片组织切成窄条状（宽度0.5 mm – 1 mm）的横向切片，并放入100 × 25 mm的培养皿中。
10. 将25 mL消化液经0.22 µm注射器滤器过滤除菌后，直接加入含有切片组织的培养皿中。
11. 在真空干燥器中，于室温下施加约-75 mbar的真空压力，对叶片组织进行30分钟的真空渗透。
    注意：多数学术和私人实验室的真空系统压力足以满足此步骤要求。
12. 将培养皿置于旋转平台摇床上，于25 °C避光条件下以60 RPM振荡2.5至3小时。在消化结束前10分钟，将转速提高至90 RPM。
13. 将消化液及未完全消化的植物材料通过置于50 mL离心管上方的40 µm筛网漏斗进行过滤收集。
14. 将50 mL离心管中的溶液在150 × g 条件下离心4分钟，使原生质体沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于10–15 mL MMg缓冲液中。
15. 重复一次离心操作并弃去上清液，将沉淀重悬于5–10 mL新鲜MMg缓冲液中。
16. 使用血细胞计数板仔细测定所分离原生质体的密度，并将其调整至约5 × 10⁵ 个原生质体/mL。
17. 转染前将原生质体样品置于冰上静置约30分钟。在此期间配制PEG溶液，将其完全溶解于溶液中，并置于37 °C水浴中保温直至转染使用。

3. 自动化原生质体转染

注意：步骤 3.6 至 3.15 完全由自动化液体处理仪执行，仅在步骤 3.10 和 3.13 处有两个用户暂停步骤，需要手动离心。与该自动化流程对应的截图详见补充材料中的补充图 1、补充图 3、补充图 4和补充图 5。

1. 根据以下步骤中所述的原生质体转染方法，准备液体处理仪的板位布局。准备以下材料：目的板（此处为96孔黑色透明底微孔板，用于荧光检测）、一盒25–250 µL宽口自动化吸头（用于PEG吸取步骤）、五盒25–250 µL自动化移液吸头（用于其余液体处理步骤）、三个塑料槽作为试剂储液槽、一个空的96孔板用于废液收集，以及剩余的转染缓冲液洗涤液W5和WI。
2. 转染程序开始前，立即通过0.22 µm无菌一次性真空滤器将PEG溶液过滤除菌，收集至新的50 mL离心管中。
3. 从悬浮于MMg缓冲液中的原生质体中，取100 µL（约含50,000个原生质体）加入预先制备并解冻的转染板的每个孔中。操作时，将含有原生质体的缓冲液倒入无菌的10 mL槽式储液槽中，并使用多通道移液器进行加样。在此手动转移过程中，需持续轻柔振荡储液槽，以防止原生质体沉降。
4. 将PEG溶液倒入相应的槽中，然后根据仪器台面布局，将已制备好的转染板（按步骤1制备，含有原生质体和质粒DNA）放置到指定位置。
5. 为了建立原生质体转染方法，打开液体处理仪软件并执行以下步骤。
   1. 在工作台间移动耗材：使用“移动耗材”命令，将加样头装载台上的空加样头盒替换为新的加样头盒。选择 从 和 至 来自的甲板 配置 视图
   2. 对于大于 200 µL 的体积：在转移过程中无需更换吸头。在第一次转移步骤时装载吸头，并在最后一次转移步骤后卸载吸头，这要求为每一步转移正确设置装载/卸载选项，如 补充图3.
6. 创建板布局：与转染板的创建方法类似，为创建DNA自动化转染方法，请打开液体处理仪软件。点击 新方法 从菜单栏中点击按钮以创建新方法。添加 仪器设置 起点线与终点线之间的连线，通过按压 仪器设置 左侧面板上的按钮。根据所示的板布局创建一个板布局。 补充图1.
7. 细胞/DNA 混合：在添加PEG之前，增加一步将原生质体与DNA混合的操作，使用 设备操作 按钮并设置设备（振荡自动实验室耗材定位器或ALP）、振荡速度（1500 rpm）和振荡时间（10 s）。
8. PEG添加与混匀：为启动转染，使用96通道移液器从PEG储液槽中添加110 µL PEG。确保根据指定的仪器板布局正确编程源位置和目标位置。设置转移步骤，使移液器在储液槽底部上方1 mm处吸取PEG，并将PEG注入含有原生质体/DNA混合物的96孔板孔内，液滴落点距孔底3 mm。PEG添加完成后，通过复制并粘贴先前设定的程序步骤，增加另一个振荡步骤。
9. PEG 孵育：通过选择添加一个暂停步骤 暂停 按钮，选择摇床，并输入预定的孵育时间（从加入 PEG 时开始计时）。
   注意：除非出现光幕中断或导致错误信息的干扰，暂停计时器将持续运行。若需对载板进行操作，务必在离开前清除这些错误信息。
10. W5缓冲液添加与混匀：使用三行200 µL的转移操作，共向转染板中加入600 µL W5缓冲液，以终止PEG孵育反应。加入W5缓冲液后，轻轻振荡，并设置用户暂停，以便对转染板进行离心处理。
11. 用户暂停 1：将原生质体转染板在 100 x g 4 分钟。将转染板（此时原生质体已沉淀）放回指定的板位。通过点击添加用户暂停 暂停 按钮，但这次带有 暂停整个系统并显示消息 选项已选中。
    注意：必须先清除暂停消息弹窗，液体处理仪才会继续执行后续的实验步骤。
12. 吸除上清液：加入两行“转移”指令以移除400 µL上清液，并转移至废液板中。为避免在去除上清液时吸出细胞，将移液头距底部的距离设置为6 mm。
13. WI缓冲液添加/混匀 将“转移”步骤添加三行，用于将580 µL WI缓冲液转移至转染板中。通过复制并粘贴先前编程的步骤，在WI缓冲液添加后增加一个振荡步骤。继续至下一个用户暂停步骤。
14. 用户暂停 2：将原生质体转染板在 100 x g 孵育4分钟。将转染板（此时原生质体已沉淀）放回指定的仪器托盘位置。
15. 去除上清液：加入四行“转移”操作以去除680 µL上清液，并转移至废液板中。为避免在去除上清液过程中吸出细胞，将移液头距底部的距离设为6 mm。
16. 将原生质体转移至微孔板：本方案的最终转移步骤包括两次150 µL的转移操作。每次转移前，需在转染板底部上方2 mm处以50 µL/s的速度反复吸液，并在3 mm处排液。随后，使用同一枪头将原生质体转移至目标微孔板。
    注意：在将缓冲液转移至微孔板之前，吸取并分配位于沉淀上方的缓冲液体积时，会扰动转染板底部可能残留的原生质体沉淀，以确保无样品损失。由于随机化处理已在转染板制备过程中完成，自动化流程至此结束。
17. 将微孔板置于室温避光条件下孵育24至48小时，然后进行第一次荧光检测。

结果

为了获得支持边缘效应可能影响响应测量结果的观测数据，开展了一项预实验以验证这些推测。在本研究中，将上述方法应用于三个仅含单一处理水平的96孔板重复实验。所有原生质体均转染pSYN11250¹⁹质粒，该质粒组成型表达ZsGreen，旨在揭示位于孔板边缘区域的单元与第二圈及中心区域相比，其响应水平是否存在系统性差异。孔板最外圈的36个孔定义为区组1，从外缘向内第二圈的28个孔定义为区组2，中心区域的32个孔定义为区组3——见图2A右下角面板。该布局可容纳28个处理水平，作为随机完全区组设计（RCBD），或容纳32个处理水平，作为随机不完全区组设计（RIBD）。在图2A中，针对每个重复（rep），各孔的原始数据点均以该孔板自身的均值进行归一化处理。在实验的三个重复中，孔板边缘区域的响应值平均比最小值高出1-1.5倍。图2B展示了每个重复中各区组均值相对于整个孔板均值的百分比。表2列出了拟合以区组为固定效应的线性模型所得的单因素方差分析表。由于区组设计中涉及限制性随机化，基于假设检验对区组因子进行推断至多被视为近似有效，最坏情况下则无效。然而，拟合包含固定区组因子的模型有助于评估区组划分方案是否有益。Mn_Sq（区组）表示各区组均值相对于总体均值的平均平方偏差；Mn_Sq（误差）表示各个观测值相对于其对应组均值的平均平方偏差，在本例中由于模型中无处理因子，组均值即为总体均值。当Mn_Sq（区组）大于Mn_Sq（误差），即F比值大于1时，与完全随机设计（CRD）相比，均方误差的大小已有效降低，从而提高了比较目标处理效应的统计功效，并缩小了估计处理对比的置信区间宽度。图2B显示F比值远超过1，且在所有三个重复孔板中，测得的响应值随着向中心移动而呈下降趋势。在三个重复中，至少有一个区组的95%置信区间在显著性水平0.05下未覆盖观测到的孔板均值。因此，可以得出结论：该区组划分方案显著提高了这些估计的精确度。若未能校正空间干扰变异的影响，不仅会导致估计精度降低，还可能因处理效应与边缘效应混杂而产生虚假结果。

尽管去黄化玉米原生质体分离与转染方案已有自20世纪90年代初以来的长期研究历史，本方案在传统流程基础上引入了一些额外改进，以更好地实现可重复的大规模原生质体分离，满足高通量原生质体转染的需求²⁰。在酶解前对种子和叶片组织进行表面灭菌，可减少真菌污染，且无需使用无菌培养基。使用土壤栽培也有助于降低实验成本，相较于使用专用生长培养基或购买无菌一次性容器更具经济性。本方案在多个步骤中均可根据通量需求进行规模调整。约2 g的第一片叶片组织可分离获得5 × 10⁶ 至 10 × 10⁶ 个原生质体。由于每块96孔板转染需使用5 × 10⁶ 个原生质体，因此按本方案操作可支持两次转染实验。此外，本方案采用MMg缓冲液作为洗涤液，取代传统的W5溶液。该改进最初源于拟南芥（Arabidopsis）根部原生质体相关文献，旨在减少原生质体转染过程中所需使用的缓冲液种类²¹，并在2022年已被应用于去黄化玉米叶片原生质体实验中²²。进一步优化任何原生质体分离与转染方案的方向，应是简化并减少所用缓冲液的数量。目前，本方案在经典的消化缓冲液、W5缓冲液、MMg缓冲液和WI缓冲液之间进行切换。若能进一步简化缓冲体系，将极大提升原生质体实验的可重复性，并降低实验间由操作人员或批次差异带来的变异性。值得注意的是，本方案另一创新之处在于聚乙二醇（PEG）转染后不完全去除缓冲液。实现自动化的可行性在于，本研究中所用的去黄化玉米原生质体及其他我们测试过的材料均能耐受稀释作为反应终止手段，而无需彻底更换不同缓冲液¹¹。如本研究中使用的GFP转染对照所示，报告基因表达结果表明，原生质体可耐受高达5%的PEG浓度，且对荧光强度无负面影响（补充图6）。该数值超过本方案完成后预期PEG浓度的两倍以上。

图1：原生质体分离与转染流程的示意图。 已引入自动化的步骤以虚线红框和相应的蓝色方框标示。红色圆圈内的数字对应文中描述的三种方法。图片由BioRender.com生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：边缘效应及不同重复布局缓解策略的影响。（A）地形图显示了转染pSYN11250质粒的96孔板中，相对于3次独立重复（Rep）实验的孔板均值，荧光强度的倍数变化。图中还展示了这些实验的平均值及区组设计，区组由覆盖在上方的不同颜色虚线表示。（B）条形图从左至右依次显示第1、2、3块重复板的各区组均值占整块板均值的百分比。半透明圆圈代表除以板均值后的原始数据点。误差线为0.05水平下的95%置信区间，中间短横线表示均值。棕色、金色和灰色分别表示板的边缘、第二圈行和内部区域。红色虚线位于100%，代表整块板的均值。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液	试剂
消化液	1.5% Cellulase Rs
	0.3% Macroenzyme
	0.6 M 甘露醇
	10 mM MES (pH 5.7)
	1 mM CaCl2
	0.1% (w/v) BSA
	0.5 nM β-巯基乙醇 或 0.5 mM DTT
Mmg	0.6 M 甘露醇
	15 mM MgCl2
	4 mM MES, pH 5.7
W5	154 mM NaCl
	125 mM CaCl2
	5 mM KCl
	2 mM MES, pH 5.7
WI	0.6 M 甘露醇
	4 mM MES, pH 5.7
	4 mM KCl
PEG	30% PEG (w/v)
	0.6 M 甘露醇
	100 mM CaCl2

表1：用于分离和转染黄化玉米原生质体的缓冲溶液。

重复	来源	自由度	平方和	均方	F 值	Pr (>F)
重复 1	区组	2	0.26	0.13	10.64	<0.001
	残差	93	1.135	0.012
重复 2	区组	2	0.507	0.25	21.41	<0.001
	残差	93	1.102	0.012
重复 3	区组	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	残差	93	1.861	0.02

表2：96孔pSYN11250转染实验三个重复的单因素方差分析表。 对于每个重复平板：源列表示变异来源，Df表示自由度，Sum Sq表示平方和，Mn Sq表示均方（平方和/自由度），F值表示Mn_Sq（区组）与Mn_Sq（误差）的比值，Pr(>F)表示全局F检验的p值。

补充图1：软件仪表板的截图。 用于创建新方法的选择类别，以及用于随机化和转染方案的卡片布局。请点击此处下载该文件。

补充图2：转染板制备实验方案中的关键步骤。 在创建转染板制备实验方案过程中截取的屏幕图像。每个图版的编号和标题对应于实验方案中的相应步骤。请点击此处下载该文件。

补充图3：创建转染方案过程中移液器耗材操作和吸头加载的截图。这些步骤在方案中会多次出现，为避免重复描述，此处展示具有代表性的步骤。请点击此处下载该文件。

补充图4：通过用户暂停1实现细胞与DNA的混合。 在创建转染方案过程中截取的屏幕图像。每个面板的编号和标题对应方案正文中的步骤。请点击此处下载该文件。

补充图5：通过将样品转移至微孔板，完成用户暂停1后的上清液去除。 在创建转染方案过程中截取的屏幕图像。每个面板的编号和标题对应方案正文中的相应步骤。请点击此处下载该文件。

补充图6：在WI缓冲液中用不同浓度PEG处理的ZsGreen转染的黄化玉米叶片原生质体时间过程。柱状图显示了在24、48和72小时用微孔板读数仪测量的原生质体相对荧光强度。误差线 = 标准差（SD），n = 4。请点击此处下载该文件。

讨论

本文描述了一种利用自动化转染系统实现转染板制备及去黄化玉米叶片原生质体分离的实验方案。为顺利完成本方案中的转染板制备步骤，需使用配备八通道移液模块的自动化液体处理机器人。对于转染实验步骤， 建议使用96孔板适配器，以实现对96孔板的完全且均匀的转染。虽然也可使用8通道适配器完成转染操作，但需特别注意吸液和加液步骤所需的时间，以及在各列之间更换吸头所耗费的时间。已有充分文献证实，聚乙二醇（PEG）孵育时间的差异会显著影响转染效率和蛋白表达水平，因此必须特别关注这些影响因素，以避免样品处理过程中出现不一致性。¹³在启动液体处理仪程序之前，有必要仔细考虑程序的各个步骤，以及某些操作是否可以同时进行。本程序使用一种设备，该设备从甲板上的一个位置为96孔板加载吸头。本程序所用的液体处理仪具备一项功能，即机器人可在孵育期或用户暂停步骤期间更换吸头盒，从而避免为程序增加额外时间。在决定购买液体处理仪时，应充分考虑其功能以及可能带来的时间节省便利性。

尽管本实验方案最初是为使用Beckman Coulter NXp和Biomek FX设备而设计，但也可适配于任何类似的液体处理设备。所有液体处理设备均具备某种方式用于指定如何将液体从一个位置转移至另一位置以及转移的体积。在本方案中，这些设备采用“从文件转移”（Transfer from File）的指令行命令。只要实验耗材被正确定义，用户即可在任意容器之间进行转移操作。在特殊情况下，例如当管架或适配器无法商业获取时，可采用3D打印方式制备此类连接件。在典型的原生质体转染实验中，以1 µg/µL的浓度使用20 µg DNA是多种原生质体平台的标准转染材料用量¹³_。 在构建转染板的过程中，为加强预防措施，建议使用0.2 - 20 µL带滤芯的吸头，以最大限度降低转移过程中质粒气溶胶污染的风险。去除人为操作环节可减少随时间产生的实验变异，提高高通量实验的可重复性。此外，转染板可提前较长时间制备完成，从而减轻实验当天转染研究人员的工作压力。然而，应注意避免将含有质粒DNA的转染板长期存放于4 °C冰箱中，以防样品蒸发。样品应储存于-20 °C冰箱中，并在转染前转移至4 °C冰箱解冻。一旦完成该转染板制备方案的程序设定，只需提供新的“转移来源文件”（Transfer From File）.csv文件，并将样品、耗材和试剂放置在相同的仪器平台位置，即可轻松重复执行该流程。

对于自动转染程序（步骤3），需准备过量的PEG溶液，以确保从槽中均匀吸取黏稠液体，通常需额外准备40 mL以补偿死体积。若仅使用转染所需的确切体积，可能导致移液器吸入空气，并造成96通道头各通道吸取的PEG体积不均。该溶液也可提前配制，但建议在转染当天配制。PEG溶液可通过注射器滤器进行灭菌，但由于其黏稠性，操作可能较为困难；使用真空过滤装置速度更快，可减轻与此操作相关的困扰或不适。与PEG溶液类似，其他转染缓冲液（W5、WI）也需准备过量，以确保96通道头移液的一致性。缓冲液（W5和WI）可提前大量配制，供后续液体处理仪运行使用。尽管试剂成本不高，但缓冲液的消耗量较大。随着每日运行次数的增加，建议采用可减少每次运行结束后多余废液量的替代储液槽。在液体处理仪程序运行期间，可在程序启动前、15分钟孵育期间或程序中的用户暂停步骤，将W5和WI加入相应的储液槽中。在孵育期间添加缓冲液时，需注意安全装置（如光幕）的影响。务必清除软件中的任何警告信息，以防止程序意外中断。

本方案在先前已报道的原生质体自动化处理方案基础上，提供了一种可靠、可重复且广泛适用的改进方法^12,13。该方法可适配于种类繁多的原生质体实验流程，因为许多流程均依赖于相同的缓冲液操作步骤。在自动化转染板制备过程中，通过RICBD设计减轻边缘效应，可同时降低操作强度和实验变异性，并对边缘效应实现具有统计学意义的校正。采用96孔板进行原生质体转染，可确保所有96个孔同时进行反应，从而彻底消除聚乙二醇（PEG）孵育时间差异所导致的任何变异。尽管本方案旨在实现转染步骤的完全自动化，但目前仍需用户暂停程序并由转染实验人员进行人工干预。近年来，已出现多种耐不平衡设计且兼容自动化的离心机设备。借助此类设备，有望实现整个方法的全程自动化，无需人工参与。此外，其他一些方案通过让原生质体在转染后自然沉降至孔底来避免离心步骤^12,13。然而，这种方法会延长转染操作的总时长，并导致原生质体在转入WI培养基过夜培养前，在W5缓冲液中孵育时间过长。

在转染方法的多个步骤中，描述了处理超过 200 µL 体积的操作，此时液体操作必须通过多次转移完成。然而，根据液体处理仪的型号和使用年限，该步骤可以且应作为单一体积操作来完成。对于较老型号的液体处理仪（例如本文所述型号），使用 96 孔头所能吸取的最大体积为 200 µL。在效率和准确性方面，对该方法的一个明显改进是减少转移次数，以最大限度降低洒漏、滴液或污染的潜在风险。有关液体处理方案优化的其他考虑因素，已在相关技术及其在生物技术领域应用的综述中进行了阐述²³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(2)β-巯基乙醇	Sigma	M6250
2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物	Sigma	69892
50 mL 带平盖离心管，无菌	Fisher	22-010-064
96孔光学平底黑色聚合物底板，带盖，细胞培养级，无菌，聚苯乙烯，每孔0.4 mL	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX 机器人吸头，非无菌，宽孔	Fisher	14-222-096
Axygen 机器人用 30 μL 带滤芯吸头，无菌，带架	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion 圆形真空干燥器	Fisher	08-648-10
Bemis 2 英寸 × 250 英尺卷装实验室用Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	贝克曼库尔特	902508
二水合氯化钙	Sigma	C5080
Chemglass生命科学一次性血细胞计数板	Fisher	50-131-1352
Clorox 杀菌漂白剂，浓缩型	Fisher	NC1871274
康宁微孔板铝封膜	Fisher	07-200-684
Corning 96 孔检测板，2 mL，96 孔标准板	Fisher	07-200-701
DL-二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	10197777001
D-甘露醇	Sigma	M9546
Fisherbrand 60 mL 塑料注射器	Fisher	14-955-461
Fisherbrand 无菌细胞筛，40 μm	Fisher	22-363-547
Fisherbrand 培养皿，透明盖，可叠放，100 mm × 25 mm，每箱325个	Fisher	FB0875711
六水合氯化镁	Sigma	M2670
Millex 注射器驱动滤器，无菌，33 mm，PES，0.22 μm	Fisher	SLGPR33RS
无菌一次性针筒式滤器，33 mm，PVDF，孔径0.45 μm	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip 无菌一次性真空滤器 50 mL PES	Fisher	SCGP00525
聚乙二醇 4000	Sigma	81240
Redi-Earth 育苗块 &和幼苗培养基	Wyatt Quarles	GP92747
常规单刃剃须刀片 钢制背板 0.009英寸半径	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
氯化钠	Sigma	S7653
托盘插件 - 36 孔 - 6×6 嵌套式	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 真空泵，100-120 V，50/60 Hz，美标插头	VWR	97058-164