方法文章

基于生物信息学的艾蒿花粉过敏原Art v 1蛋白B细胞和Th细胞表位预测分析

DOI：

10.3791/66517

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2023年12月22日

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1School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, 2Preparation Center, General Hospital of Ningxia Medical University, 3Department of Pharmacy, General Hospital of Ningxia Medical University, 4Institute of Neurological Diseases, Shizuishan First People's Hospital, 5Department of Pharmacy, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种生物信息学相关性分析方案，用于预测蒿属花粉主要过敏原Art v 1蛋白的理化性质、二级结构以及B细胞和辅助T细胞表位，为后续蒿属花粉过敏性疾病疫苗的研发及疾病治疗提供理论依据。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为分析艾蒿花粉过敏原Art v 1蛋白的序列特征并预测其B细胞和Th（辅助性T细胞）表位，通过参考GenBank获取Art v 1蛋白的基因序列和氨基酸序列。利用ExPASy的Prot Param、TMHMM、DNAstar Protean、Swiss-Model、UCLA-DOE LAB SAVES v6.0以及IEDB对该蛋白的理化性质、跨膜区、二级结构、三级结构以及B细胞和Th细胞表位进行分析与预测。

Art v 1 蛋白由 132 个氨基酸残基组成，相对分子质量为 13404.26，分子式为 C584H903N157O181S12，等电点（pI）为 7.49，脂溶性指数为 41.59，亲水性指数为 -0.454，属于亲水性蛋白。其不稳定指数（II）为 78.11，被归类为不稳定蛋白。该蛋白的 N 端具有一个 α-螺旋跨膜区，位于第 5 至 27 位氨基酸残基序列，第 1 至 24 位为信号肽序列。蛋白结构中包含无规卷曲、β-转角、α-螺旋和 β-折叠，还含有亲水区、柔性区和表面可及区等结构特征。

三级结构的预测结果与二级结构的分析结果一致。预测出五个主要的B细胞表位，分别为Art v 1 71-87、Art v 1 33-49、Art v 1 104-120、Art v 1 95-111和Art v 1 86-102。存在五个Th细胞优势表位，分别为Art v 1 2-16、Art v 1 3-17、Art v 1 4-18、Art v 1 5-19和Art v 1 6-20。由于存在B细胞和Th细胞表位，预测Art v 1蛋白具有良好的抗原性。

引言

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蒿属（Artemisia）是菊科植物，广泛分布于中国内蒙古、甘肃及其他地区1。由蒿花粉引发的多种过敏性疾病通常属于I型过敏反应，系特应性个体反复接触花粉变应原后产生生物活性介质所致，可引起鼻黏膜、结膜和支气管的卡他性炎症，甚至诱发哮喘发作2。世界卫生组织/国际免疫学会联合会（WHO/IUIS）变应原命名委员会3目前正式认定的蒿属变应原有七种，分别为Art v 1-Art v 6和Art AN 7。其中Art v 1蛋白是导致蒿花粉过敏的主要变应原之一，其分子量为24–28 kDa，可被95%的蒿花粉过敏个体识别4。该蛋白由N端的β-防御素样结构域和C端的富含脯氨酸尾部组成。防御素是一类在多种真核生物中表达的内源性抗菌多肽5。

目前，变应原免疫治疗（allergen immunotherapy, AIT）是除避免接触变应原外，唯一能够改变过敏性疾病自然病程的病因学治疗方法6。近年来过敏性疾病的患病率不断上升，凸显了针对变应原分子开展基础与临床研究及其在过敏诊断和治疗中潜在应用的重要性。许多用于AIT的变应原属于重组蛋白，其物理、化学和免疫学特性适合制备低致敏性的变应原疫苗。因此，AIT被认为是有效预防和治疗过敏性疾病的主要手段，因为过敏疫苗相对易于生产且成本较低7。然而，以往疫苗的研发完全依赖于分子生物学和免疫学实验。此外，表位鉴定对疫苗开发至关重要，目前鉴定表位最可靠的方法是X射线晶体衍射和核磁共振（NMR）技术，但这些方法耗时且昂贵8。因此，具有低成本和高效率优势的计算方法和工具被用于表位的预测。

本文描述了一种生物信息学相关性分析方法，用于预测蒿属花粉主要过敏原Art v 1蛋白的理化性质、二级结构、三级结构 以及B细胞/Th细胞表位。这将为后续蒿属花粉过敏性疾病疫苗的研发及疾病治疗提供理论依据。

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方案

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1. Art v 1 蛋白的物理和化学性质

  1. 在 GeneBank（材料表）中输入 AF493943.1，以获取 Art v 1 蛋白的氨基酸序列（补充文件 1-补充图 S1）。
    注意：Art v 1 蛋白包含 132 个氨基酸，由 624 bp 的基因序列编码。其氨基酸序列（AAO24900.1）为 MAKCSYVFCAVLLIFIVAIGEMEAAGSKLCEKTSKTYSG
    KCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYF
    DCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPPADGGSPP
    PPADGGSPPVDGGSPPPPSTH。
  2. 启动 Expasy ProtParam 工具（材料表），输入步骤 1.1 中提到的 Art v 1 蛋白氨基酸序列。点击 Compute parameters 按钮，以显示氨基酸组成、原子数目、分子式、相对分子质量、正负电荷数、等电点以及不稳定指数（补充文件 1-补充图 S2）。
    注意：不稳定指数 <40 表示该蛋白稳定；若数值 > 40，则表示该蛋白不稳定9。

2. Art v 1 蛋白质跨膜区与信号肽的预测

  1. 将上述 Art v 1 蛋白的氨基酸序列输入在线软件 TMHMM Server v.2.0（材料表）中。选择详细输出并包含图形作为输出格式，点击提交以显示膜结构，并获得跨膜蛋白的理化特性（补充文件1-补充图S3）。
  2. 将上述 Art v 1 蛋白的氨基酸序列输入 SignalP 5.0 Server 在线工具（材料表）中。选择真核生物作为生物类群，选择长格式输出作为输出格式，然后点击提交并填写电子邮件地址，以接收预测的蛋白信号肽结果（补充文件1-补充图S4）。

3. Art v 1 蛋白质的二级结构预测

  1. 为分析 Art v 1 蛋白的亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原指数，将 AF493943.1 输入 GeneBank（材料表），点击蛋白 ID AAO24900.1 | FASTA。复制 FASTA 序列至新的文本文件，并将文件类型修改为 FASTA（补充文件 1-补充图 5）。随后启动软件 DNAstar protean 模块，打开该 FASTA 文件以显示 Art v 1 蛋白的二级结构（补充文件 1-补充图 S6）。

4. Art v 1 蛋白的三级结构预测与构象评估

  1. 为了预测 Art v 1 蛋白的三级结构模型，将上述 Art v 1 蛋白的氨基酸序列输入 Swiss-Model 在线软件（材料表），点击搜索模板，选择相似度最高的蛋白2kpy.1.A作为模板，点击构建模型 | 模型 01，并下载 PDB 格式的文件（补充文件 1-补充图 S7）。
  2. 为评估第 4.1 步中显示的同源建模构象，打开 UCLA-DOE LAB SAVES v6.0 在线软件（材料表），点击选择文件以上传第 4.1 步中的 PDB 格式文件，然后依次点击| 运行程序 | Procheck | 结果 | Ramachandran 图（补充文件 1-补充图 S8）。

5. Art v 1 蛋白的 B 细胞表位预测

  1. 为了预测 Art v 1 蛋白的 B 细胞表位，打开 IEDB 分析资源在线工具的网站（材料表），点击抗原序列特性，输入上述 Art v 1 蛋白的氨基酸序列，选择方法Bepipred 线性表位预测 2.0，最后点击提交（补充文件 1-补充图 S9）。
  2. 打开 ABCpred 在线工具的网站（材料表），输入上述 Art v 1 蛋白的氨基酸序列，将阈值设为0.51，将用于预测的窗口长度设为16，将重叠过滤器设为开启，然后点击提交序列（补充文件 1-补充图 S10）。

6. Art v 1 蛋白的 Th 细胞表位预测

  1. 为了预测 Art v 1 蛋白的 Th 细胞表位，打开 IEDB 分析资源在线工具的网站（材料表），点击 MHC II 结合，输入上述 Art v 1 蛋白氨基酸序列。选择 NetMHCIIpan 4.1 EL（推荐的表位预测工具-2023.09） 作为 预测方法，人类 作为 物种/位点，DRB1*01:01 作为 HLA-DR，等位基因，15 作为 长度，按以下方式对肽段进行排序 百分位排名，然后点击 提交 (补充文件1-补充图S11).

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结果

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使用 ExPASy 的 Prot Param Tool 在线软件对蛋白质进行理化性质和功能表征10。开放阅读框长度为 624 bp，编码 132 个氨基酸，所编码的蛋白质共包含 1,837 个原子，相对分子质量为 13,404.26。分子式为 C584H903N157O181S12，其中含量最高的三种氨基酸分别为脯氨酸（Pro，15.9%）、丙氨酸（Ala，12.1%）和甘氨酸（Gly，11.4%），其余氨基酸含量均低于 10%。等电点（pI）值为 7.49，带负电荷的残基总数（Asp + Glu）为 13，带正电荷的残基总数（Arg + Lys）为 14。脂溶性指数为 41.59，亲水性指数为 -0.454，属于亲水性蛋白质。不稳定指数（ii）为 78.11，归类为不稳定蛋白质。

采用 TMHMM Server V.2.0 在线软件对 Art v 1 蛋白的跨膜区进行分析。结果显示，跨膜螺旋中氨基酸残基的预期数量为 19.3...

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讨论

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蒿属植物是中国最重要的室外过敏原之一，其花粉颗粒较小，直径为19-25 µm，易于随风扩散并产生大量花粉。此外，患者过敏症状的严重程度与空气中花粉含量相关5。Art v 1被视为蒿属花粉过敏的标志性过敏原，超过95%的蒿属过敏患者对Art v 1敏感。在中国，约81%的蒿属过敏患者对Art v 1呈可溶性免疫球蛋白E（sIgE）阳性14。

本研究主要通过生物信息学技术分析了艾草花粉蛋白 Art v 1 的基本特性。在对该蛋白的二级结构和跨膜结构区域进行预测与分析时发现，Art v 1 蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白。其结构中存在 α-螺旋和 β-折叠结构，由于氢键的存在，这些结构较为稳定，不易发生形变。此外，螺旋和折叠结构域通常位于蛋白内部，不易与受体接触。这两个结构域构成了蛋白的核心结构，通常不参与抗原表位的呈递15。其中，β-转角和无规卷曲一般位于蛋白表面，更易形成表位16。

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作由宁夏回族自治区自然科学基金（2022AAC03601 和 2023AAC02087）以及宁夏医科大学科研基金（XM2019052）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABCpred印度英德普拉萨信息技术研究所https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html
DNAstar Protean 软件DNASTAR 公司版本 7.1
Expasy ProtParam 工具瑞士生物信息学研究所（SIB）https://web.expasy.org/protparam/
GeneBank美国国家生物技术信息中心https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
IEDB 分析资源美国国家过敏与传染病研究所http://www.iedb.org/
SignaIP-5.0 服务器丹麦技术大学健康技术系https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
Swiss-Model 在线软件BIOZENTRUMhttps://swissmodel.expasy.org/interactive
TMHMM 服务器丹麦技术大学健康技术系版本 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
UCLA - DOE 实验室 SAVES美国能源部科学办公室版本 6.0https://saves.mbi.ucla.edu/

参考文献

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