基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

摘要

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。

摘要

越来越多的证据表明，mRNA 翻译是细胞内一个高度区室化的过程，特定 mRNA 的亚细胞运输和定位对于确保具有区室特异性功能的蛋白质在适宜的微环境和适当数量下合成至关重要。然而，迄今为止，针对翻译这些 mRNA 的核糖体进行亚细胞分离和表征的技术仍十分有限，因此关于翻译机器的组成如何影响局部 mRNA 翻译调控，仍有许多未知之处。

本文展示了AviTag特异性的定位限制性光照增强生物素标记技术（ALIBi），该方法结合了表位标记、新开发的光遗传激活型分裂生物素连接酶以及亲和纯化技术，可快速且特异性地标记并分离定位于任意特定亚细胞区域的核糖体。首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将AviTag肽段、烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点以及FLAG表位标签融合至一种核糖体蛋白上。在该细胞系中表达与细胞器靶向结构域融合的分裂型生物素连接酶，该酶在正常生物素浓度下处于非活性状态。当补充生物素并施加蓝光照射激活后，该连接酶可对邻近区域的AviTag标记核糖体进行生物素化，从而通过链霉亲和素包被的磁珠实现对生物素化核糖体及其结合蛋白和mRNA的亲和纯化。随后通过TEV蛋白酶切割实现非变性条件下的洗脱，获得的样品可用于后续分析，包括利用RNA测序或质谱蛋白质组学对核心核糖体蛋白、核糖体相关蛋白以及核糖体结合mRNA的表征。

在本实验方案中，我们回顾了将AviTag与核糖体蛋白融合以及将分裂的生物素连接酶靶向至目标细胞器的设计原则。我们展示了ALIBi系统的激活、细胞裂解、亲和纯化及样品洗脱的操作过程。最后，我们讨论了典型实验结果及常见问题的排查方法。

引言

迫切需要能够从特定亚细胞区室中分离生物样本的工具，以更深入地研究亚细胞结构和物质运输如何影响细胞过程。mRNA翻译就是这样一个典型过程：越来越多的证据表明，翻译具有高度区室化特征，特别是许多mRNA会被定位到其编码蛋白将要驻留的细胞器中^1,2。然而，关于翻译机器的亚细胞定位，目前所知仍较少。核糖体起源于核仁和细胞核，在那里由核糖体蛋白（RPs）和核糖体RNA（rRNAs）开始组装。随后，它们被转运至细胞质，完成最后的组装阶段，之后便开始翻译mRNA^3,4。经典的翻译场所包括细胞质和内质网；后者是整合膜蛋白以及靶向膜结合细胞器或胞外分泌蛋白的合成场所⁵。近年来新发现的局部翻译位点还包括线粒体、过氧化物酶体和神经元突起^{6,7,8,9,10,11,12}。有趣的是，越来越多的证据表明，翻译机器的某些特征，如与核糖体相关的蛋白、翻译后修饰、rRNA修饰以及核心核糖体 蛋白的非经典化学计量比，参与调控特定mRNA的翻译以及翻译保真度和速率等参数^{13,14,15,16,17,18,19,20}。例如，已有数百种蛋白被发现可与核糖体相互作用，可能导致亚细胞内核糖体组成的差异¹³。然而，迄今为止，用于分离亚细胞核糖体群体的技术仍十分有限；因此，关于翻译机器组成如何调控局部mRNA翻译，仍有许多未知。发展出适用于哺乳动物模型系统的、灵活多样的亚细胞核糖体分离方法，将有助于在亚细胞水平上深入探究这些翻译机器的特征。

分离含有核糖体的亚细胞组分的最早方法基于连续裂解和离心的原理^21,22。通常，这些方法仅限于特定细胞器，且往往需要较长的处理时间。一种较新的方法基于生物素连接酶BirA，该酶可特异性地将AviTag肽底物生物素化^10,23,24。在核糖体已标记AviTag的细胞中，可通过基因工程将BirA定位于目标细胞器。然而，由于BirA在生理浓度的生物素条件下具有活性，因此必须在生物素耗竭的条件下培养细胞，以避免携带AviTag的核糖体发生组成型和非特异性的生物素化^10,24。这限制了BirA在对生物素耗竭敏感的细胞类型中的应用²⁵。最后，已有研究开发出非特异性生物素化方法，使用经改造的酶如BioID、TurboID和APEX^26,27,28。在诱导后，这些酶会产生一种反应性生物素中间体，可共价修饰酶周围一定半径内的任何赖氨酸残基。非特异性生物素化方法在绘制亚细胞蛋白质组图谱方面非常有用，但在区分位于核糖体附近区域的蛋白质与更紧密靠近核糖体的蛋白质方面提供的信息较为有限。

在此，我们演示了近期开发的一种用于标记和分离亚细胞核糖体群体的方法，称为AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation, ALIBi）。该方法利用一种经改造的分裂型BirA蛋白，该蛋白与光遗传学增强型Magnet（eMag）开关融合图1A在蓝光照射下发生异源二聚化²⁹；以及一个由FLAG表位、烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点和AviTag组成的肽标签（FTA），融合至核糖体蛋白Rpl31上（图1B）。分裂的酶可被基因靶向至特定细胞器，在生理浓度的生物素条件下无活性，且在蓝光照射并添加外源生物素后数分钟内即可重新组装恢复活性。图1C-）。随后进行细胞裂解、亲和纯化，并通过TEV蛋白酶切割实现非变性条件下的酶促洗脱，获得核糖体及共纯化的分子（如mRNA和核糖体相关蛋白），适用于RNA测序和质谱蛋白质组学等下游分析方法。图1A）。因此，该方法不仅能够揭示核糖体的组成，还能鉴定出与核糖体结合的mRNA。在最近一篇描述ALIBi技术首次应用于表征亚细胞核糖体群体的研究文章中，我们成功地将分裂的酶靶向至细胞质、核仁、细胞核、内质网、质膜以及线粒体（表1)³⁰对这些亚细胞区室间翻译机制的比较研究，揭示了内质网和线粒体中翻译过程的新颖且出乎意料的发现，并为未来进一步探究细胞核及核仁中核糖体生物发生因子提供了潜在的研究方向。

本方案详细演示了ALIBi系统的转染与激活、细胞裂解、亲和纯化及样品洗脱的步骤。我们还讨论了如何通过蛋白质印迹法（western blot）验证亲和纯化的成功，并对后续进行RNA测序或质谱（MS）蛋白质组学分析提供了建议（参见补充文件1）。本方案适用于使用小鼠胚胎干细胞（mESCs）的实验，这些细胞在其内源性Rpl31位点处纯合表达与FTA融合的Rpl31蛋白（L31-FTA）；该细胞系可应要求向作者索取。该细胞系的构建策略详见补充文件1以及补充图S1和补充图S2。编码靶向多个细胞器的分裂酶的质粒可在Addgene获取（目录号#235608至235643）。靶向这些细胞器的分裂酶设计原理见补充文件1。本方案假设每个样品来源于在10 cm培养皿中培养的mESCs。我们发现，10 cm培养规模可获得足够用于质谱蛋白质组学分析的材料，而6孔板规模则足以用于蛋白质印迹或RNA测序。

方案

1. 小鼠胚胎干细胞培养

注意：在进行 ALIBi 激活和细胞裂解之前，小鼠胚胎干细胞（mESCs）的操作应遵循细胞培养的标准无菌技术。除非另有说明，完整的小鼠胚胎干细胞应于室温下以 200 × g 离心 3 分钟。除非另有说明，培养基使用前需在水浴中预热至 37 °C。小鼠胚胎干细胞应传代至已过夜明胶包被的新鲜组织培养板中（见步骤 1.1）。

1. 在解冻 L31-FTA 小鼠胚胎干细胞（mESC）的前一天，用 5 mL 的 0.1% 明胶包被 10 cm 培养皿底部。于 37 °C 孵育过夜。
2. 配制 mESC 培养基组分（表 2），经 0.2 µm 滤器过滤。4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
3. 在解冻当天，将用于稀释解冻细胞的 5 mL 培养基和用于接种细胞的 10 mL 培养基预热至室温或 37 °C。
4. 从液氮中取出一支含有约 5 × 10⁶ 个 L31-FTA mESC 的冻存管，立即在 37 °C 水浴中轻轻摇动管底以快速解冻。
5. 根据冻存管容量，将 5 mL 培养基中的 0.5–1 mL 轻柔加入冻存管内容物中混匀，然后将冻存管中的全部内容物转移回 5 mL 培养基中。
6. 通过离心沉淀细胞。吸除上清液。
7. 用 10 mL 培养基重悬细胞沉淀。
8. 吸除 10 cm 培养皿中的明胶溶液，并立即将细胞悬液转移至该培养皿中。于 37 °C 孵育。
9. 每 24 小时（传代当天除外），吸除培养皿中的旧培养基，并更换为 10 mL 新鲜培养基。
10. 当细胞集落融合度达到 70%–80%（通常为接种后 48 小时），吸除旧培养基，并用 10 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗两次。
11. 吸除 DPBS 后，向培养皿中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶（表 2）。于 37 °C 孵育 5 分钟。
12. 向培养皿中加入 4 mL 冷的 mESC 培养基以中和胰蛋白酶。立即使用 5 或 10 mL 血清移液管在培养皿中反复吹打 15 次，使集落解离为单细胞悬液。
13. 将细胞悬液转移至锥形离心管中。可选：取部分细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。
14. 通过离心沉淀细胞。吸除上清液。
15. 用新鲜培养基重悬细胞沉淀。将 5 × 10⁶ 个细胞（通常按 1:6 的传代比例）接种至新的明胶包被的 10 cm 培养皿中，并于 37 °C 孵育。根据需要重复步骤 1.9–1.15，直至准备进行转染。
16. 为制备冻存细胞储备液，使用胰蛋白酶消化一皿 mESC（如步骤 1.10–1.14 所述）。将细胞沉淀重悬于冻存培养基中（每 5 × 10⁶ 个细胞使用 250–500 µL），分装至冻存管中，置于细胞冻存盒中于 -80 °C 缓慢冷冻过夜，随后转移至液氮中长期保存。

2. 转染

注意：应在小鼠胚胎干细胞（mESCs）准备传代的当天进行转染。质粒可能在转染后3-5小时即开始表达。一旦开始表达，建议在避光条件下操作细胞，并尽量减少细胞暴露于低于37 °C的环境，以防止过早激活，因为先前的研究表明，Magnet光遗传学结构域不仅在蓝光照射下发生二聚，也在低温暴露时发生二聚³¹。将培养板置于专用的培养箱中，或在共用培养箱中用铝箔遮蔽某一层架以隔绝光线。当在培养箱外操作细胞时，应提前关闭或遮挡所有室内光源和窗户，并使用红光头灯进行观察。不要将培养箱门长时间打开。每次仅取出少量培养板，并在操作时将培养板放置于隔热表面（例如洁净的泡沫塑料盒盖）上，以尽量减少与室温工作台面的接触。使用前确保培养基充分预热。切勿在发光显微镜下观察培养板。

1. 转染前一天，用明胶包被一个10 cm培养皿。
2. 转染当天，吸除培养皿中的明胶，并加入7.5 mL培养基，在37 °C预热。同时将低血清培养基在37 °C预热，用于重悬细胞。
3. 将18.75 µL转染试剂加入250 µL低血清培养基中稀释。轻轻敲击混匀，室温孵育5分钟。
4. 若共表达编码N端和C端片段的两个质粒，则向250 µL低血清培养基中加入每种质粒各3.75 µg；若仅表达一个质粒（例如GFP阴性对照或全长BirA阳性对照），则加入7.5 µg单一质粒。
5. 将质粒/低血清培养基混合物加入转染试剂/低血清培养基混合物中，轻弹或颠倒混匀。室温孵育15分钟。
6. 在此期间，对mESC进行胰酶消化并离心收集（步骤1.10–1.14）。用预热的低血清培养基重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至10 × 10⁶ 个细胞/mL。
7. 将7.5 × 10⁶（750 µL）重悬的细胞加入质粒/转染试剂/低血清培养基混合液中。颠倒离心管混匀，室温孵育10分钟，期间偶尔颠倒离心管以保持细胞悬浮状态。
8. 再次短暂颠倒离心管，将mESC/质粒/转染试剂/低血清培养基混合物加入含有预热培养基的培养皿中。轻轻摇动培养皿，使细胞均匀分布。
9. 将培养皿置于37 °C孵育3–5小时，使细胞在此期间充分贴壁。
   注意：从此时起，建议采取前述措施避免光照及低于37 °C的温度暴露。
10. 轻柔吸除旧培养基，加入新鲜预热的培养基，沿培养皿侧壁吹加，避免冲起细胞。继续在37 °C孵育。
11. 若计划在转染后24小时进行激活/裂解，则进入第3节操作；若计划在转染后48小时进行激活/裂解，则在转染细胞接种后约24小时更换培养基。

3. ALIBi 激活与细胞裂解

注意：在洗脱开始前（步骤 5.4），始终将细胞/样品置于避光条件下操作。细胞在冰上预冷后（步骤 3.15），应始终保持样品低温，并仅使用预冷的试剂，直至洗脱开始。确保工作台面、设备、试剂和塑料器皿无 RNA 酶污染，建议使用新开封的物品，并用 RNA 酶去污染溶液和 70% 乙醇擦拭或冲洗硬质表面。在操作样品或设备时始终佩戴手套。对于拟用于质谱蛋白质组学分析的样品，还需尽量减少角蛋白污染，保持工作区域无尘；遮盖裸露皮肤，并将长发束起。

1. 将离心机预冷至 4 °C。
2. 关闭光源，将转染后的培养板转移至临时的 37 °C 培养箱中，以避免在将透射蓝光仪放入主培养箱后，培养板暴露于主培养箱内的温度波动中。
3. 用 70% 乙醇擦拭蓝光透射仪表面，并接通电源。将透射蓝光仪放入主培养箱中，在继续后续操作的同时，让培养箱条件重新平衡。
4. 将用于添加生物素和环己酰亚胺（CHX）的培养基分装物（每 10 cm 培养板使用 10 mL 培养基）预热至 37 °C。若需运行不额外添加生物素的对照样品，也应单独预热一份仅添加 CHX 的培养基分装物。
   注意：某些缓冲液组分可在使用前一天配制，并在 4 °C 下过夜保存（见表 2）。请注意，用于 Western blot 或质谱蛋白质组学实验的裂解缓冲液和洗涤缓冲液配方，与用于 RNA 测序实验的配方有所不同。
5. 将用于添加 CHX 的 DPBS 分装物（每 10 cm 培养板 20 mL）冷却。
6. 配制 RNase 去除缓冲液、盐洗缓冲液、裂解缓冲液和洗涤缓冲液（见表 2）。对于含有甘油、Triton X-100 等高密度/高黏度组分的缓冲液，应使用移液器吹打混匀，确保成分均匀。使用前将缓冲液置于冰上预冷。
   注意：在珠子洗涤步骤中，将含有珠子的离心管在掌上离心机中短暂离心，使内容物沉降至管底。将离心管置于磁力架上 1 分钟，或直至珠子完全迁移至管壁一侧。小心吸除上清液，避免接触珠子沉淀。在珠子沉淀未干燥的情况下，立即加入下一步所用缓冲液。为重悬珠子沉淀，可轻柔吹打，或在磁力架上用手指轻轻滚动封闭的离心管，使珠子在磁铁作用下快速向多个方向移动。最后，将重悬后的珠子上下颠倒数次，确保管壁内侧被充分洗涤。
7. 通过轻柔吹打或轻轻摇动，重悬链霉亲和素磁珠原液。每 10 cm mESC 培养板，向低吸附蛋白管中转移450 µL 磁珠。
8. 根据上述关于磁珠洗涤的注意事项，弃去磁珠储存缓冲液，并用 900 µL RNase 去除缓冲液洗涤磁珠两次。
   注意：应立即进入下一步操作；磁珠在 RNase 去除缓冲液中停留时间过长可能会降低其结合能力。
9. 用 900 µL 盐洗缓冲液洗涤磁珠一次。
10. 用 900 µL Wash I 缓冲液洗涤磁珠两次。在第二次 Wash I 缓冲液重悬磁珠后，将磁珠保存在 Wash I 缓冲液中，并置于 4 °C，同时进行激活和细胞裂解操作。
11. 根据需要，向预热的培养基分装物中加入生物素（终浓度 50 µM；50 mM 储液 1:1,000 稀释）和 CHX（终浓度 100 µg/mL；100 mg/mL 储液 1:1,000 稀释）。保持在 37 °C 直至使用。
12. 向冷的 DPBS 分装物中加入 CHX（终浓度 100 µg/mL；100 mg/mL 储液 1:1,000 稀释），并保持低温直至使用。
    注意：接下来的两个步骤描述了通过补充生物素和蓝光照射来激活 ALIBi 的过程。理想的激活时间应足够长，以在后续检测中获得足够的核糖体生物素化水平，但又应足够短，以保持良好的时空分辨率。理想的激活时间可能因细胞类型、实验规模、分裂酶的表达水平、目标细胞器附近核糖体的丰度以及分析技术的灵敏度等参数而异。我们建议以 15 分钟作为起始点，这也是我们在代表性结果（图 2）及配套研究³⁰中所采用的激活时间。
13. 吸除转染培养板中的培养基。立即每板加入 10 mL 含 CHX ± 生物素的预热培养基。
14. 对于不进行光照的阴性对照板，将其放入避光培养箱中。对于需要光照的培养板，直接将其放置在透射蓝光仪上方，打开光源，孵育 15 分钟。
15. 光照结束后，立即每板用 10 mL 含 CHX 的冷 DPBS 洗涤两次。洗涤期间及洗涤后将培养板置于冰上。吸除第二次洗涤液后，倾斜培养板并吸除残留的 DPBS。
16. 将每块培养板尽可能保持水平地置于冰上，加入 2 mL 冰冷的裂解缓冲液进行裂解。在冰上孵育 5 分钟，期间轻敲培养板 2–3 次，以帮助细胞脱落。
    注意：若在此期间用铝箔遮光并保持在冰上，可将培养板从细胞培养区域转移至其他黑暗空间。
17. 使用微量移液器在培养板表面反复吹打裂解液，以脱离残留细胞，注意避免产生气泡，随后将裂解液转移至预冷并标记好的低吸附蛋白管中。
    注意：可选步骤：对于某些难以裂解的细胞器（如细胞核和核仁），超声处理可能有助于裂解。
18. 对于难以裂解的细胞器，将实验中所有样品在 4 °C 下以 3 瓦功率超声处理 45 秒。若超声仪设计要求将探头插入开放的样品管中，应先将裂解液从培养板转移至较大体积的离心管中，以防止超声过程中溢出；超声后再转移至 2 mL 离心管中。
19. 将裂解液在冰上孵育 15 分钟。
20. 在 4 °C 下以 17,000 × g 离心 3 分钟。将上清液（澄清裂解液）转移至预冷的低吸附蛋白管中，注意不要扰动细胞碎片沉淀。
    注意：若计划进行 RNA 测序分析，此时可取一份澄清裂解液作为总 RNA 组分（详见补充文件 1中“RNA 测序建议”步骤 1.1）。
    注意：若所有样品的细胞数量、转染/培养条件和裂解条件保持一致，通常可认为各样品裂解液浓度相近，无需测定总蛋白浓度，可直接进行后续操作。此做法有助于最小化激活与亲和纯化之间的时间间隔。

4. 亲和纯化

1. 使用磁力架收集洗涤后的链霉亲和素磁珠，吸除洗涤缓冲液 I。
2. 将 1,200 µL 澄清裂解液转移至含有洗涤后磁珠的离心管中，轻轻吹打重悬磁珠。将剩余的澄清裂解液储存于 -80 °C。
3. 将裂解液与磁珠在 4 °C 避光条件下于旋转仪上孵育 1 小时。
4. 在孵育期间，配制 TEV 洗脱缓冲液（表 2）。

5. 洗脱

1. 根据第3节中关于珠子洗涤的说明，将珠子在磁力架上离心沉淀，并将上清液转移至预冷的低吸附蛋白管中。将上清液于 -80 °C 保存。
2. 用 900 µL 洗涤缓冲液 I 洗涤珠子 2 次。
3. 用 900 µL 洗涤缓冲液 II 洗涤珠子 1 次。
   注意：完成此步骤后，样品无需再避光操作。
4. 向珠子中加入 450 µL TEV 洗脱缓冲液。
5. 将珠子在室温下于旋转仪上孵育 1 小时。对于使用少量 TEV 洗脱缓冲液的小规模实验，可将离心管置于摇床中以 1,000–2,000 rpm 摇动孵育。
6. 将珠子置于磁力架上沉淀，将洗脱液转移至低吸附蛋白管中。若计划进行蛋白质组学分析或 Western blot，将洗脱液于 -80 °C 保存；若计划进行 RNA-seq 分析，请参见补充文件 1“RNA 测序建议”中的步骤 1.2 以获取洗脱液保存说明。
7. 可选：为初步判断亲和纯化是否获得了可观的 rRNA/mRNA（表明核糖体已被成功分离），可使用 TEV 洗脱缓冲液作为空白对照，在微量分光光度计上分析洗脱液。
   注意：含有激活系统的细胞所产生的洗脱液在 260 nm 处的吸光度应高于缺乏分裂酶、蓝光/生物素或 L31-FTA 的细胞所产生的洗脱液。

6. 蛋白质印迹

注意：在裂解液和流穿样品加入Laemmli缓冲液变性之前，建议继续避免光照。我们使用预制胶、市售的转膜缓冲液和电泳缓冲液，以及半干式转膜系统（参见材料表）。SDS-PAGE和蛋白质印迹实验按照这些组分的生产商说明书进行操作，除非下文另有说明。

1. 向裂解液、流穿液和/或洗脱液样品中加入6x Laemmli缓冲液，使终浓度为1x Laemmli缓冲液。在95 °C的加热块或PCR仪中加热10分钟。若管盖或管壁出现冷凝液，短暂离心收集。
2. 根据凝胶电泳槽制造商的说明，使用电泳缓冲液安装凝胶。上样样品及蛋白分子量标记（ladder）。
3. 以125 V电压电泳45–75分钟，直至染料前沿接近凝胶底部。在此期间，配制PBST和封闭缓冲液（表2）。
4. 按照转膜系统制造商的说明进行半干转膜。
   注意：在所有膜洗涤/孵育步骤中，确保膜完全浸没，并将膜托盘置于摇床或倾斜摇床上。对于10 × 15 cm的托盘，需使用25–50 mL缓冲液。
5. 从转膜夹心中取出膜后，立即进行下一步操作，以防止膜干燥。
   注意：可选步骤：膜上出现干燥区域可能导致封闭或探针结合不均，尤其是像链霉亲和素-辣根过氧化物酶这类孵育时间较短的探针。为避免此问题，我们在转膜后将膜先用100%甲醇重新润湿30秒，再用水处理5分钟。该操作类似于转膜后PVDF膜干燥时常规推荐的再润湿方法^32,33。
6. 在室温下用PBST洗涤膜，每次10分钟，共洗3次。
7. 根据表3中每种Western blot探针的指定条件，进行封闭、洗涤、探针孵育和二抗孵育。
8. 完成第6.7步的最终洗涤后，按制造商说明混合ECL底物组分，并均匀覆盖于膜上。使用化学发光凝胶成像系统采集图像。

结果

Western blot（方案第6部分）是初步评估实验是否成功最便捷的方法。当使用链霉亲和素-HRP探针检测膜时，所有系统组分均存在的细胞裂解液中应出现一条对应于生物素标记的L31-FTA的条带（图2A，第20泳道）。如果细胞转染了全长BirA作为阳性对照，则同一条带通常会更明显（图2A，第1–4泳道）。当缺失一个或多个系统组分时，该条带应变弱或消失（图2A，其余所有泳道）。由于哺乳动物细胞内源性含有多种分子量在70–80 kDa和120–130 kDa范围内的生物素化羧化酶蛋白^34,35，因此在所有裂解液样本中通常均可观察到这些分子量的条带。此外，也可使用抗V5抗体探针膜以确认分裂BirA片段的表达。

通过蛋白质印迹（Western blot）检测裂解液、穿流液和洗脱液样品，可以评估亲和...

讨论

与现有的研究亚细胞翻译的技术相比，ALIBi 具有多项优势，并在核糖体生物学及其他领域具有潜在的未来应用价值。该方案所需时间与连续裂解和离心法相当或更短^21,22，且原则上可应用于任何可通过定位于特定亚细胞区域的肽序列进行遗传靶向的亚细胞区室。与组成型活性的 BirA^10,24 相比，该方法无需将细胞培养在生物素耗竭的培养基中。先前报道的胎牛血清中生物素浓度范围为 0.04 µM 至 0.2 µM^25,42,43；因此，我们所使用的含有 15% 胎牛血清且不含其他生物素组分的 mESC 培养基，其生物素浓度估计为 0.006–0.03 µM。与非特异性的邻近生物素标记方法²⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
-80 °C 储存			用于细胞培养
水中0.1%明胶	MilliporeSigma	ES-006-B	用于细胞培养
0.2 µm 滤器单元	Fisher	04-977-158	用于细胞培养
0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10倍浓缩液）	ThermoFisher	15400-054	用于细胞培养
1 M MgCl2	ThermoFisher	AM9010	用于裂解 & 亲和纯化
1 M Tris pH 7.5	ThermoFisher	15567027	用于裂解 & 亲和纯化
1 M Tris pH 8	ThermoFisher	AM9855G	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
1.5 和 2 mL 微量离心管，已高压灭菌			用于转染
1.5、2 mL 和 5 mL 蛋白低吸附微量离心管	Eppendorf	022431081, 022431102, 0030108302	用于裂解 & 亲和纯化
10 cm 组织培养板			用于细胞培养
10 M NaOH	MilliporeSigma	72068-100ML	用于裂解 & 亲和纯化
10x Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液浓缩液	Bio-Rad	1610772	用于蛋白质印迹
37 °C 组织培养箱 × 2			用于细胞培养。其中一个用作细胞培养及转染细胞光照的主要培养箱。在ALIBi激活当天，需要在第二个培养箱中临时放置转染细胞，以便在主培养箱中设置透射式照明装置。
37 °C 水浴锅			用于细胞培养
5 M NaCl	ThermoFisher	AM9010	用于裂解 & 亲和纯化
50 mM 生物素	ThermoFisher	B20656	用于裂解 & 亲和纯化
6x Laemmli缓冲液	FIsher	50-196-784	用于蛋白质印迹实验
70% 乙醇			用于消毒
乙腈	Fisher	A955	可选：用于质谱样品制备
AcTEV蛋白酶试剂盒	ThermoFisher	12575015	用于裂解 & 亲和纯化
ALIBi C-片段质粒	Addgene	#235615, 235636 – 235641	转染需要中提规模制备
ALIBi N-片段质粒	Addgene	#235614, 235635, 235642, 235643	转染需要采用中量提质粒规模
铝箔			用于裂解 & 亲和纯化
碳酸氢铵	MilliporeSigma	5.3305	可选：用于质谱样品制备
抗FLAG抗体	MilliporeSigma	F3165	用于蛋白质印迹实验
抗GAPDH抗体	细胞信号传导	5174	用于蛋白质印迹
抗小鼠二抗	GE Healthcare	NA931V	用于蛋白质印迹
抗兔二抗	GE Healthcare	NA934V	用于蛋白质印迹分析
抗Rpl12抗体	Abcam	ab175219	用于蛋白质印迹分析
抗Rpl31抗体	Abcam	ab103991	用于蛋白质印迹分析
抗Rpl5抗体	ProteinTech	15430-1-AP	用于蛋白质印迹分析
抗V5抗体	ThermoFisher	R960-25	用于蛋白质印迹分析
apyrase	NEB	M0398L	用于裂解 & 亲和纯化
β-巯基乙醇（55 mM）	ThermoFisher	21985-023	用于细胞培养
蓝光透射仪	克莱尔研究化学品	DR46B（小）或 DR196（大）	用于裂解 & 亲和纯化
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher	BP1600-100	用于蛋白质印迹
C18 小柱（OMIX C18 小柱）	安捷伦	A57003100	可选：用于质谱样品制备
细胞冻存容器			用于细胞培养
适配15 mL和/或50 mL锥形管的离心机			用于细胞培养
适用于1.5-2 mL微量离心管的离心机			用于裂解 & 亲和纯化。应具备冷藏至4°C及最高转速达17,000 g的能力。理想情况下，该设备应置于可临时遮光的房间内，以便在转移离心管时避免光照。
Clarity ECL 试剂盒	Bio-Rad	170-5061	用于蛋白质印迹实验
Criterion 电泳胶槽	Bio-Rad	1656001	用于蛋白质印迹
Criterion TGX 预制胶，4-20%	伯乐（Bio-Rad）	5671095	用于蛋白质印迹。提供其他孔径尺寸和排列方式
环己酰亚胺	MilliporeSigma	C7698-5G	用于裂解 & 亲和纯化
脱氧胆酸盐	MilliporeSigma	S1827	用于裂解 & 亲和纯化
二硫苏糖醇	ThermoFisher	PIA39255	可选：用于质谱样品制备
不含钙、不含镁的DPBS	ThermoFisher	14190-250	用于细胞培养
ES认证的FBS	MilliporeSigma	ES-009-B	用于细胞培养
乙醇	金盾	412828	用于蛋白质印迹
乙醇	MilliporeSigma	459828	可选：用于质谱样品制备
甲酸	MilliporeSigma	A117	可选：用于质谱样品制备
片段大小分析仪及耗材		Agilent	可选：用于RNA测序文库制备。Agilent 2100 Bioanalyzer
冻存液	ThermoFisher	12648-010	用于细胞培养
化学发光凝胶成像系统			用于蛋白质印迹实验
凝胶上样提示			用于蛋白质印迹
凝胶电泳槽电源			用于蛋白质印迹
甘油	MilliporeSigma	G5516-100ML	用于裂解 & 亲和纯化
异硫氰酸胍-苯酚试剂（TRIzol）	ThermoFisher	15596-018	可选：用于RNA测序文库构建
用于大样本量的胍-苯酚试剂（TRIzol LS）	ThermoFisher	10296010	可选：用于RNA测序文库构建
胍-苯酚RNA提取试剂盒（DirectZol试剂盒）	Zymo	R2060	可选：用于RNA测序文库构建
HALT蛋白酶抑制剂	ThermoFisher	78425	用于裂解 & 亲和纯化
血细胞计数板			用于细胞培养
七氟丁酸	ThermoFisher	52411	可选：用于质谱样品制备
高pH分级分离试剂盒	ThermoFisher	84868	可选：用于质谱样品制备
羟胺	MilliporeSigma	467804	可选：用于质谱样品制备
IGEPAL CA-630	MilliporeSigma	I8896	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
引导RNA评分算法的实现	Benchling	https://www.benchling.com/	可选：用于选择将 FTA 序列插入内源性核糖体蛋白位点的向导 RNA。用户友好的界面，实现了 Doench, J.G. 等人提出的向导 RNA 评分算法，以最大化 CRISPR-Cas9 的活性并最小化脱靶效应。Nature Biotechnology. 34 (2), 184–191，doi: 10.1038/nbt.3437 (2016)。
脱脂速溶奶粉	Safeway	116100001	用于蛋白质印迹
绝缘表面，例如泡沫塑料盒盖			用于转染
碘乙酰胺	ThermoFisher	A39271	可选：用于质谱样品制备
敲除DMEM	ThermoFisher	10829-018	用于细胞培养
L-谷氨酰胺（100倍）	MilliporeSigma	TMS-002-C	用于细胞培养
L31-FTA 小鼠胚胎干细胞			如有需要，可向 Barna 实验室申请，邮箱：mbarna@stanford.edu
4-10倍放大倍数的光学显微镜			用于细胞培养
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668-019	用于转染
液氮储存			用于细胞培养
LysC	和光	125-05061	可选：用于质谱样品制备
适用于1.5–2 mL离心管的磁力架	ThermoFisher	CS15000	用于裂解 & 亲和纯化
甲醇	VWR	EM-MX0475-1	用于蛋白质印迹
微型离心管旋转仪			用于裂解 & 亲和纯化
微量移液器及无菌或经高压灭菌的微量移液器吸头			用于细胞培养
96孔板用微型封膜	Bio-Rad	MSB1001	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
微量分光光度计	ThermoFisher	NanoDrop 2000	可选
质粒大提试剂盒（Plasmid Plus Midi Kit）	Qiagen	12945	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
mLIF（10,000 U/µL)	双子座	400-495 10^7	用于细胞培养
多重索引试剂盒（NEBNext 多重寡核苷酸用于 Illumina（索引引物集 1 和 2））	NEB	E7335S, E7500S	可选：用于RNA测序文库构建
MyOne C1 链霉亲和素 Dynabeads	ThermoFisher	65002	用于裂解 & 亲和纯化
无称量DTT	ThermoFisher	PIA39255	用于裂解 & 亲和纯化
非必需氨基酸（100倍）	MilliporeSigma	TMS-001-C	用于细胞培养
非表达型质粒骨架（TOPO载体试剂盒）	ThermoFisher	450031	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
轨道式或倾斜式摇床			用于蛋白质印迹实验
PBS 粉末	Fisher	BP661-10L	用于蛋白质印迹分析
pCAGEN	Addgene	11160	可选：用于设计额外的细胞器靶向 ALIBi 分裂酶构建体
PCR扩增仪管			用于蛋白质印迹
青霉素/链霉素（100倍）	ThermoFisher	15140163	用于细胞培养
pH 试纸	Fisher	8881-1	可选：用于质谱样品制备
用于膜孵育的塑料托盘			用于蛋白质印迹
适用于1.5-2 mL离心管的掌上离心机			用于裂解 & 亲和纯化
用于PCR管的掌上离心机			用于蛋白质印迹实验
poly(A) mRNA 分离试剂盒（NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块）	NEB	E7490	可选：用于RNA测序文库制备
适用于基因分型的聚合酶预混液（MyTaq Hot Start Red Mix）	BioLine	BIO-25048	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
蛋白分子量标准	ThermoFisher	26617	用于蛋白质印迹实验
蛋白沉淀试剂盒（ProteoExtract 试剂盒）	MilliporeSigma	539180	可选：用于质谱样品制备
蛋白酶K	MilliporeSigma	3115879001	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
纯化水			用于蛋白质印迹，即来自 Milli-Q（MilliporeSigma）过滤系统
嘌呤霉素	MilliporeSigma	P8833	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
PX459	Addgene	62988	可选：用于将 FTA 插入内源性核糖体蛋白基因座
红光头灯			用于转染
低血清培养基（OptiMEM）	ThermoFisher	11058021	用于转染
RNA 柱试剂盒（RNA Clean & Concentrator-5 试剂盒	Zymo	R1016	可选：用于RNA测序文库构建
RNA文库制备试剂盒（NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep kit）	NEB	E7760S	可选：用于RNA测序文库制备
RNA防粘连1.5 mL微量离心管	ThermoFisher	AM12450	可选：用于RNA测序文库制备
RNAseZap	ThermoFisher	AM9784	用于裂解 & 亲和纯化
含5倍浓缩转膜缓冲液、PVDF膜和印迹叠层的半干转印试剂盒	Bio-Rad	1704272	用于蛋白质印迹
半干式转移系统	Bio-Rad	1704150	用于蛋白质印迹分析
适用于1.5-2 mL微量离心管的摇床			用于裂解 & 亲和纯化。应具备达到 1000–2000 rpm 的转速能力
超声波破碎仪（Microson Ultrasonic Cell Disruptor XL）	Misonix	XL-2000	用于裂解 & 亲和纯化
无菌 15 mL 和 50 mL 离心管			用于细胞培养
无菌冻存管，容量 1.5–2 mL			用于细胞培养
无菌血清移液器及移液管			用于细胞培养
链霉亲和素-HRP	ThermoFisher	N100	用于蛋白质印迹
SUPERase RNA酶抑制剂	ThermoFisher	AM2696	用于裂解 & 亲和纯化
SuperSignal West Femto 最高灵敏度底物试剂盒	ThermoFisher	34095	用于蛋白质印迹
PCR仪或加热块			用于蛋白质印迹实验
硫脲	MilliporeSigma	T8656	可选：用于质谱样品制备
组织培养罩			用于细胞培养
可遮光的房间内的组织培养空间和实验台空间			用于裂解 & 亲和纯化
TMT 6plex 标记	ThermoFisher	90066	可选：用于质谱样品制备
三乙基碳酸氢铵	ThermoFisher	T7408	可选：用于质谱样品制备
Triton X-100	MilliporeSigma	T8787-250ML	用于裂解 & 亲和纯化
台盼蓝（0.4%）	Life Technologies	15250-061	用于细胞培养
胰蛋白酶	ThermoFisher	90057	可选：用于质谱样品制备
Turbo DNA酶	ThermoFisher	AM2238	用于裂解 & 亲和纯化。可选：用于RNA测序文库构建
Tween-20	MilliporeSigma	P9416	用于蛋白质印迹
超纯水	ThermoFisher	10977023	用于裂解 & 亲和纯化
尿素	MilliporeSigma	U6504	可选：用于质谱样品制备