一种用于评估环境污染物与核受体结合亲和力的高通量筛选方法

摘要

本方案描述了一种高通量筛选系统，该系统利用特定荧光探针与核受体结合后产生的荧光偏振信号，作为检测环境污染物的读数指标。

摘要

环境中化合物的含量不断升高，导致广泛的污染，并对人类健康构成威胁。然而，尽管这些化合物在环境中普遍存在，关于其毒理学效应的信息却极为有限。因此，迫切需要开发高通量筛选（HTS）方法，以指导毒理学研究。本研究建立了一种基于高通量筛选系统的受体-配体结合实验，用于测定环境污染物对核受体的结合活性。该检测利用微孔板读数仪（即含有多种化学物质的96孔板），通过测量特异性荧光探针的荧光偏振（FP）值来完成。该实验包括四个部分：重组载体的构建与转化、受体蛋白（配体结合结构域）的表达与纯化、受体与探针的结合，以及化学物质与受体的竞争性结合。为演示该实验流程，测定了两种环境污染物——全氟辛烷磺酸（PFOS）和三苯基磷酸酯（TPHP）与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的结合活性。最后，还讨论了该方法的优缺点及其潜在应用。

引言

大量化学物质已在环境和人体中被广泛检出，引发了人们对这些物质对生态环境和人类健康影响的严重关切^1,2,3。尽管这些化学物质在环境中普遍存在，但有关其毒理学效应的信息仍十分有限。因此，亟需开发高通量筛选（HTS）方法，以促进对化学物质毒性的评估。

已有多种高通量筛选（HTS）方法被报道用于化学物质毒性评估，例如Tox21和ToxCast项目中使用的HTS生物测定方法^4,5。这些方法能够快速识别潜在的有毒物质，并提供有关化学物质毒性机制的重要信息。然而，这些HTS生物测定主要依赖基于细胞的系统，可能较为复杂且成本较高。此外，高通量测序方法也已被用于化学物质毒性评估，但实现化学品的高通量评估仍然具有挑战性⁶。先前的研究已开发出基于荧光偏振（FP）的受体-配体竞争性结合测定法，用于测定多种环境污染物（包括全氟和多氟烷基物质（PFAS）^7,8,9、双酚A（BPA）^10,11以及颗粒物（PM）¹²）与核受体（如过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）^7,8,9,10,13、法尼醇X受体（FXR）^11,12和甲状腺受体（TR）^14,15）的结合效力。该方法高效、经济，并可提供机制层面的深入见解。

本研究描述了基于检测小荧光探针荧光偏振（FP）的受体-配体结合实验方案。基于FP的受体-配体结合实验原理如图1所示。当小分子荧光物质被平面偏振光激发时，由于分子快速旋转，发射光高度去偏振。然而，当示踪物与较大的受体结合后，其旋转速度减慢。当示踪物结合于大分子受体时，检测到较高的FP值；而当示踪物处于游离状态时，则观察到较低的FP值。本实验纯化了过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），以实现探针与受体的结合。罗格列酮（Rosi）、全氟辛烷磺酸（PFOS）和三苯基磷酸酯（TPHP）被用于与探针竞争结合受体。Rosi是PPARγ的特异性激动剂，在受体竞争性结合实验中作为阳性对照。此外，既往研究已证实PFOS和TPHP为PPARγ的弱激动剂^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}。此外，它们属于在环境中广泛暴露且在人群样本中检出率相对较高的不同结构类别化合物。这些化合物被用于进一步验证竞争结合实验的广泛适用性。该实验流程包括四个步骤：重组载体的构建与转化、受体蛋白（配体结合域）的表达与纯化、受体-探针结合以及化学物质与受体的竞争性结合。

方案

试剂与仪器的详细信息见材料表。

1. 重组载体的构建与转化

注意：PPARγ 是一种配体依赖性转录因子，具有典型的核受体结构，包含一个调控靶基因的 DNA 结合域和一个由配体激活的配体结合域。在配体激活后，PPARγ 会与另一种核受体——视黄醇 X 受体（RXR）形成异源二聚体，并结合到 PPARγ 的反应元件上，从而调控下游靶基因的转录^9,16。

1. 设计PPARγ-LBD的引物（见表1），并扩增PPARγ-LBD DNA片段（见表2和表3）。
2. 使用限制性内切酶XhoI和BamHI消化，将带有His×6标签的pET28a载体线性化¹⁸。
3. 利用 commercially available 克隆试剂盒将PPARγ-LBD DNA片段克隆至带有His×6标签的pET28a载体中，获得重组质粒pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸。
4. 将重组表达质粒pET28a-PPARγ-LBD-6×His转染至BL21 (DE3) Escherichia coli细胞中以进行蛋白表达¹⁸。
5. 向感受态BL21(DE3)细胞中加入5 µL重组质粒，冰上孵育30分钟，42 °C热激45秒后立即放回冰上。
6. 加入900 µL LB培养基，37 °C振荡培养1小时（160–200 rpm），然后在室温下以约3000 x g离心5分钟。
7. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于100 µL LB培养基中，涂布于固体培养基表面，倒置培养皿于37 °C培养12–16小时。
8. 挑选单菌落进行测序鉴定，并用于后续蛋白表达与纯化。

2. 受体蛋白的表达与纯化

1. 将转化后的BL21 (DE3)细胞接种于200 mL LB培养基中，加入100 µg/mL氨苄青霉素，在37 °C、230 rpm的摇床中孵育1-2小时。
2. 当OD₆₀₀达到0.4-0.6吸光度单位时，加入10 µM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并在16 °C继续孵育16小时。
3. 收集菌体悬浮液，在4 °C条件下以8000 × g离心10分钟。
4. 用20 mL可溶性裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10 mM咪唑，pH 8.0）重悬菌体沉淀，加入200 µL苯甲基磺酰氟（PMSF）和200 µL溶菌酶。使用5 mL移液器充分重悬菌体沉淀，随后进行超声处理，功率30%，持续20分钟。
5. 加入相当于镍柱柱体积5倍的裂解缓冲液以平衡镍柱。重复此步骤两次，然后暂置备用。
6. 将超声处理后的菌体悬浮液在4 °C条件下以8000 × g离心15分钟，收集上清液，获得细菌裂解上清（CL）。
7. 将CL上样至镍柱（用于蛋白吸附），收集穿流液（FT）。
8. 用相当于柱体积5倍的洗涤缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、20 mM咪唑，pH 8.0）洗涤镍柱，收集洗涤液（W1-W6）。
9. 用1 mL洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、250 mM咪唑，pH 8.0）洗脱目标蛋白，收集蛋白洗脱组分（E1-E5）。
10. 取每种组分（CL、FT、W1-W6和E1-E5）各20 µL，通过SDS-PAGE¹⁸分析并用考马斯亮蓝染色。PPARγ-LBD在变性凝胶中迁移为34.9 kDa的蛋白条带。

3. 受体结合实验

注意：在此实验中，使用 C1-BODIPY-C12 作为位点特异性的荧光探针来建立受体-配体结合系统。C1-BODIPY-C12 是 PPARγ 的特异性配体，是一种将 BODIPY 荧光基团插入脂肪酸 C1 位的脂肪酸荧光类似物。

1. 将纯化的人 PPARγ-LBD 用 Tris-HCl 缓冲液（20 mM Tris，100 mM NaCl，pH 8.0）稀释至 1 nM 至 6400 nM 的浓度范围。同时，将 C1-BODIPY-C12 探针用 Tris-HCl 缓冲液稀释至 50 nM 的浓度。
2. 在 96 孔黑色板中，将稀释后的 PPARγ-LBD 溶液（每孔 55 µL）与 C1-BODIPY-C12 探针溶液（每孔 55 µL）混合。室温孵育 5 分钟。
3. 使用微孔板读数仪测量荧光偏振（FP）值。
4. 将 FP 值对受体浓度作图，使用统计与绘图软件，采用希尔斜率方程拟合特异性结合曲线，并计算 K_d 值。

4. 竞争性结合实验

注意：本实验中，受体结合使用了800 nM的人PPARγ-LBD和50 nM的C1-BODIPY-C12探针。罗格列酮（Rosi）、三苯基磷酸酯（TPHP）和全氟辛烷磺酸（PFOS）用于竞争探针与PPARγ的结合。

1. 在 0–200 µM 浓度范围内，用 Tris-HCl 缓冲液稀释三种化合物。
2. 配制受体-探针结合溶液，其中人 PPARγ-LBD 的终浓度为 800 nM，C1-BODIPY-C12 探针的终浓度为 50 nM。
3. 在 96 孔黑色板中，将受体-探针结合溶液（每孔 55 µL）与化合物溶液（每孔 55 µL）混合。室温孵育 5 分钟。
4. 使用微孔板读板仪测定荧光偏振（FP）值。
5. 以配体浓度为横坐标，绘制 FP 值的变化曲线。通过作图与分析软件采用 S 形模型拟合竞争结合曲线，获得各配体的半数抑制浓度（IC₅₀）。

结果

PPARγ-LBD 蛋白的表达与纯化
PPARγ-LBD 在 BL21 (DE3) 菌株中以组氨酸标签蛋白的形式进行异源表达。该蛋白存在于可溶性组分中，纯化后的 PPARγ-LBD 在 SDS-PAGE 上呈现单一蛋白条带，表观分子量约为 34.9 kDa（图 2），与该蛋白预测的分子量一致。

C₁-BODIPY-C₁₂ 探针与 PPARγ-LBD 的结合
在受体结合实验中，使用了 C1-BODIPY-C12（一种可与 PPARγ-LBD 结合的 BODIPY 标记脂肪酸）作为荧光探针，用于研究环境污染物与 hPPARγ-LBD 的结合能力。如图 3A所示，加入 PPARγ-LBD 后，荧光偏振（FP）值从 20 上升至 250，表明 C1-BODIPY-C12 与受体发生了结合。结合曲线在 PPARγ-LBD 浓度达到 800 nM 时趋于饱和，解离常数（K_d）为 253.5 nM ± 10.05 nM。因此，在后续的竞争性结合实验中选用 800 nM 的 PPARγ-LBD。

环境污染物与PPARγ-LBD的竞争性结合
在竞争性配体结合实验中，使用PPARγ特异性激动剂罗格列酮（Rosiglitazone, Rosi）作为阳性对照，以置换荧光探针。如图3B所示，Rosi以剂量依赖方式抑制C1-BODIPY-C12探针与PPARγ-LBD的结合，IC₅₀为6.89 µM，表明该检测方法可行。随后测定TPHP和PFOS与PPARγ-LBD的结合亲和力。如图3C、D所示，TPHP和PFOS也以剂量依赖方式抑制C1-BODIPY-C12探针与PPARγ-LBD的结合，IC₅₀值分别为60.45 µM和37.27 µM。

图1：基于荧光偏振（FP）的受体竞争性结合实验示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：纯化的PPARγ-LBD的SDS-PAGE分析。 M为蛋白质分子量标记物，Cl为细胞裂解液，FT为穿流组分，W1-W6为洗涤液，E1为洗脱组分，E2-E4为纯化的PPARγ-LBD蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：基于荧光偏振（FP）的受体结合曲线及竞争性结合曲线。（A）C₁-BODIPY-C₁₂ 与人 PPARγ-LBD 的基于 FP 的结合曲线。（B-D）罗格列酮（Rosi）、磷酸三苯酯（TPHP）和全氟辛烷磺酸（PFOS）与人 PPARγ-LBD 的基于 FP 的竞争性结合曲线。误差条表示三次独立实验的标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

ID	序列
pET28a-Human PPARG-P1	CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-Human PPARG-P2	GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
PPARγ-LBD 核苷酸序列	AGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTG GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGAGCAA AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG CTCGAGGCCACCCACCC

表1：PPARγ配体结合结构域的引物及核苷酸序列。

实验试剂名称	体积/剂量
pET28a-Human PPARG-P1	1 μL
pET28a-Human PPARG-P2	1 μL
2×phanta Max Master Mix	12.5 μL
cDNA	2 μL
ddH2O	8.5 μL

表2：PCR实验试剂体系。

实验名称	温度	时间
预变性	95 °C	3 min
变性	95 °C	15 s
退火	65 °C	15 s
延伸	72 °C	6 min
保存	12 °C	--

表3：PCR实验反应程序。

讨论

荧光偏振（FP）、表面等离子体共振（SPR）和核磁共振（NMR）是常用于评估蛋白质与化合物之间直接结合相互作用的技术^19,20。FP 已被广泛应用于药物发现和化学筛选中的分子相互作用研究^21,22,23。相比之下，SPR 和 NMR 检测成本较高且耗时较长，因此不太适用于高通量筛选（HTS）应用。本方案描述了一种基于 FP 并结合多孔板检测系统的受体-配体分析方法，可实现化学品的高通量筛选。

为受体结合实验选择合适的探针至关重要。探针应包含两个部分：一个针对核受体的特异性配体和一个荧光基团。通常，此类探针可从商业途径获得，例如本研究中使用的C1-BODIPY-C12探针。C1-BODIPY-C12是一种脂肪酸的荧光类似物，其BODIPY荧光基团连接在脂肪酸的C1位，是PPARγ的特异性配体。如果无法获得商业化的荧光探针，则需通过化学合成方法，将荧光基团连接到已知的特异性配体上。

核受体的经典结构包括一个负责调控靶基因表达的DNA结合域，以及一个通常位于受体C末端的配体结合域（LBD）²⁴。共调节因子结合位点通常位于核受体的转录激活功能域内，可与核共调节因子相互作用²⁵。这些共调节因子能够增强或抑制受体的转录活性，从而调节基因表达。位于受体蛋白特定区域的LBD可在配体结合后调控受体的构象变化，进而激活或抑制其转录活性。由于LBD是一个结构明确的功能域，对识别和结合特定小分子配体至关重要²⁴，因此本研究在受体竞争性结合实验中仅使用了受体的LBD部分。该方法通过表达和纯化PPARγ的配体结合域，降低了实验成本。

本方法所用试剂，包括蛋白纯化缓冲液、C1-BODIPY-C12 探针和 Tris-HCl，均为商业化产品且价格低廉，这是该检测方法的一个显著优势。荧光偏振（FP）检测可在多孔板（96 孔或 384 孔板）中进行，每块板的读取时间仅为 3–5 分钟，显著提高了检测通量和效率。受体-配体结合方法具有高度灵活性，只要获得受体蛋白，即可轻松适用于多种不同受体。这种适应性拓宽了该方法可支持的研究范围。总体而言，这些优势——操作简便、成本效益高、高通量能力、快速处理以及受体适配的灵活性——使该方法成为筛选有毒环境污染物的一种极具前景的选择。

本研究结果表明，全氟辛烷磺酸（PFOS）和磷酸三苯酯（TPHP）能够与PPARγ结合，这与先前的分子对接和报告基因检测结果一致^9,26。此外，本文所述方法已被用于评估多种环境污染物与核受体之间的结合能力。例如，利用基于荧光偏振（FP）的受体-配体竞争性结合实验，已测定19种全氟和多氟烷基物质（PFASs）以及7种双酚A（BPA）化合物与过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ（PPARβ/δ）^7,10的结合能力，12种PFASs与PPARγ^9,13的结合能力，7种BPA化合物和3种细颗粒物（PM_2.5）组分与法尼醇X受体（FXR）^11,12的结合能力，以及8种多溴联苯醚（PBDEs）和6种多氯联苯（PCBs）与甲状腺激素受体（TR）^14,15的结合能力。这些发现凸显了该方法在筛选环境污染物与核受体之间结合相互作用方面的潜力。

既往研究报道了使用凝胶过滤法检测PPARγ结合的荧光偏振（FP）分析方法，该方法至少需要1.5小时才能检测单个化合物的结合情况²³。相比之下，本方法可在10分钟内检测至少12种化合物与PPARγ的结合亲和力。此外，一些市售试剂盒（见材料表）的800 × 20 µL规格价格超过3000美元。这些方法明显昂贵且耗时。本研究对现有方法进行了改进。

该方法的一个潜在局限性在于，荧光探针必须是受体的配体，且荧光探针不直接与环境污染物发生相互作用。因此，必须确保探针与环境污染物在溶液中保持分离。此外，该检测方法反映的是 体外 情境，且无法完全捕捉 体内 相互作用，因为受体为异源二聚体 体内²⁷因此，尽管该方法可作为快速筛选工具，但仍需进一步研究受体激活及相关毒理学机制 体内 是必要的。

另一个缺点是在评估结合亲和力时，荧光偏振（FP）检测中观察到的"右移"现象，可能导致所测亲和力的系统性低估。在以往的研究中，罗格列酮与PPARγ的结合亲和力是通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测²⁸进行评估的，该方法是一种测量配体-受体结合亲和力的高度敏感技术。然而，TR-FRET检测相对耗时且操作繁琐，需要在室温下对反应溶液孵育4小时后才能进行检测。尽管FP检测的灵敏度低于TR-FRET检测，但它更适合用于筛选与核受体结合的环境配体的高通量研究。不过，FP检测可能会遗漏一些弱结合的环境配体。此外，在以往的研究中，全氟辛烷磺酸（PFOS）与PPARγ的结合亲和力是通过平衡透析（EqD）²⁹测定的，这是另一种测量配体-受体结合亲和力的高度敏感方法。然而，EqD依赖于昂贵的分析设备（LC-MS/MS），这限制了其应用，并无法实现高通量筛选。

尽管该荧光偏振（FP）检测存在"右移"现象，可能导致计算出的IC₅₀值普遍偏高，但这并不影响相对亲和力排序或后续风险评估的预测结果。此外，FP检测具有成本低、效率高、可对多种化合物与多个核受体之间的亲和力进行广泛筛选的优点。总体而言，基于FP的高通量筛选环境配体方法有助于快速识别有毒环境污染物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C1-BODIPY-C12 探针	Thermo Fisher Scientific, 中国	102209-82-3	与 PPARγ-LBD 结合并发出荧光。
考马斯亮蓝 R-250	Solarbio, 中国	6104-59-2	对蛋白质条带进行染色。
GraphPad Prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
咪唑	Solarbio, 中国	I8090	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷	Solarbio, 中国	367-93-1	诱导 PPARγ-LBD 的表达
酶标仪	Biotek , 美国	Synergy H1	检测荧光偏振值
NaCl	上海试剂	7647-15-5	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
NaH2PO4 · 2H2O	上海试剂	13472-35-0	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, 中国	SA005005	蛋白纯化。
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA, 美国
全氟辛烷磺酸 (PFOS)	J&K Scientific Ltd, 中国	1763-23-1	待检测的环境污染物
苯甲基磺酰氟 (PMSF)	Solarbio, 中国	P0100	抑制蛋白质降解。
PPARγ-竞争性检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD 配体筛选检测试剂盒	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
罗格列酮 (Rosi)	阿拉丁, 中国	122320-73-4	PPARγ 的激动剂
摇床	智城, 中国	ZWY-211C	用于细菌培养扩增及蛋白表达诱导
磷酸三苯酯 (TPHP)	麦克林, 中国	T819317	待检测的环境污染物
Tris	Solarbio, 中国	T8230	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
胰蛋白胨	OXOID Limited, 中国	LP0042B	用于配制溶菌肉汤 (LB) 培养基。
超声波清洗机	金佰利, 中国	LHO-1	裂解细菌以实现完全破碎
尿素	Solarbio, 中国	U8020	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
酵母提取物	OXOID Limited, 中国	LP0021B	用于配制溶菌肉汤 (LB) 培养基。