比较经腹膜后腹膜入路与经皮穿刺法在兔腰椎间盘退变模型中的应用

摘要

本方案比较了在兔椎间盘退变（IVDD）模型中经皮穿刺与经后腹膜穿刺的方法。两种方法均可诱导IVDD，但经后腹膜途径导致更广泛的改变且死亡率更低。

摘要

本研究比较了两种在兔模型中诱导椎间盘退变（IVDD）方法的有效性：经皮穿刺法与经后腹膜穿刺法穿刺纤维环。15只健康的雄性新西兰白兔被随机分为三组：假手术组、经皮穿刺组和经后腹膜穿刺组。通过包括死亡率、形态学与组织学评估、影像学检查以及生物标志物分析在内的综合评估，对两种方法进行了准确而详细的比较。结果表明，两种穿刺技术均能成功在兔模型中诱导出IVDD。然而，与经皮穿刺法相比，经后腹膜穿刺法在椎间盘中诱导出更显著的退行性改变，同时显著降低了动物死亡率。这些发现凸显了经后腹膜穿刺法在IVDD建模中的优势。本研究为建立IVDD模型提供了有价值的参考，并为未来探索腰痛有效治疗策略奠定了基础，最终有助于改善患者的临床预后。

引言

在过去几十年中，腰痛（LBP）已成为影响生活质量的最重要肌肉骨骼系统疾病¹。腰痛日益成为重要的公共卫生问题，因劳动力损失和额外的医疗支出给社会带来巨大的经济负担^2,3。仅在美国，与腰痛相关的直接和间接成本每年超过1000亿美元，包括医疗支出、收入损失和劳动力损失⁴。腰痛通常由椎间盘退变（IVDD）引起^5,6,7,8。鉴于腰痛的高发病率及其巨大的经济影响，准确建立椎间盘退变模型对于探索治疗策略至关重要。

为了理解椎间盘退变（IVDD）的病理生理机制并评估治疗策略，研究人员已开发并使用了多种临床前体内动物模型⁹。在这些模型中，诱导椎间盘退变的方法包括手术或化学性椎间盘损伤、非侵入性机械应力、基因修饰以及自然发生过程¹⁰。其中，手术损伤占IVDD诱导方法的64.9%，而针刺损伤是主要的手术技术¹¹。针刺模型具有建模简便、对实验动物损伤小的特点。常用的针刺方法包括开放性经腹膜后入路至腰椎椎间盘间隙和经皮后外侧穿刺。进针深度可通过影像学监测或针具长度确定。值得注意的是，与开放性手术方法相比，经皮穿刺可能减少医源性组织损伤，而经腹膜后入路则具备直视操作的优势——这些特征在以往文献中尚未进行定量比较。尽管已有研究探讨了使用不同直径针具¹²以及穿刺不同椎间盘¹⁰对IVDD诱导的影响，但针对不同针刺入路的比较研究仍较为有限。所选用的兔模型因其解剖结构与人类椎间盘相似，且在体型和结构方面优于啮齿类模型，特别适用于需要成本较低、可频繁进行影像学评估的长期纵向研究的研究人员¹³。

本研究采用两种方法建立腰椎间盘退变（IVDD）的兔模型：开放性腹膜后入路穿刺腰椎间盘间隙和经皮后外侧穿刺。分析了一系列全面的评估指标，包括形态学、组织学和影像学变化。

方案

动物实验程序严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》，并经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理审批编号：2021-23）。实验选用15只健康的4月龄清洁级新西兰大白兔（体重2.25 kg ± 0.25 kg），其中雄性7只，雌性8只。动物在室温23 °C ± 3 °C、相对湿度约60% ± 10%的环境中饲养，适应一周，期间自由饮水和进食。实验前将15只兔子随机分为三组：假手术组（A组）、经皮纤维环穿刺组（B组）和经腹膜后间隙纤维环穿刺组（C组），每组5只。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.

1. 建立兔椎间盘退变模型 通过 经皮纤维环穿刺

注意：兔椎间盘退变模型采用经皮纤维环穿刺法建立。该操作参照Luo TD等¹⁴描述的穿刺建模方法，并在X射线引导下进行（图1）。

1. 准备兔子。
   1. 手术前禁食兔子24小时，但可自由饮水。
   2. 给予麻醉 通过 经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1.3 mL/kg），操作遵循机构批准的实验方案。
   3. 通过检查动物是否无活动、肌肉松弛、角膜反射消失以及无疼痛反应来确认麻醉成功。
2. 固定并标记兔子的位置。
   1. 将兔子俯卧位固定在固定板上。
   2. 剃除手术区域毛发并进行消毒准备，然后触诊骨性标志。
   3. 触诊兔子腰部背部的骨性标志。找到兔子的最下一根肋骨，其通常对应于L1棘突上方的椎骨。
   4. 找到该椎骨下方的棘突，以确定第一腰椎（L1）棘突。
   5. 找到髂嵴的最高点，大约与第6腰椎（L6）平齐。
   6. 从L1棘突向下追踪，依次识别至L7的各个棘突。
   7. 使用记号笔在兔子背部清晰标记L1棘突。
   8. 移动到下一个棘突，并标记为L2。
   9. 继续依次标记后续的棘突为 L3、L4、L5、L6 和 L7。确保每个标记清晰可辨且按顺序排列，以便准确认定。
3. 定位并标记穿刺部位。
   1. 触诊横突，定位 L5 与 L6 远端末端之间的中点。
   2. 标记该点，并准备在该点上方约1 cm处插入穿刺针。
4. 插入穿刺针。
   1. 将穿刺针水平持握，朝地面方向插入，刺破皮肤。
   2. 将针推进至L4椎体，并在X射线引导下确认位置正确。
   3. 将针头略微向头侧倾斜，与L4-5椎间盘呈约20°角。穿刺椎间盘，并在X线检查下确认穿刺位置的准确性。
5. 进行椎间盘穿刺。
   1. 在必要时借助X射线引导，精确穿刺纤维环。
   2. 重复穿刺过程，对L2-3和L3-4椎间盘分别穿刺一次。
   3. 保持每张纸片约5 mm的穿刺深度，留置时间为5秒。
6. 术后护理
   1. 消毒穿刺部位并包扎。
   2. 将青霉素以每只兔子每日40,000 U的剂量，连续3天肌内注射至臀大肌。
      注意：若针头遇到坚硬组织，应调整进针方式。使用X射线引导以实现精确穿刺。密切监测兔子的恢复情况，并给予适当的护理。

2. 建立兔椎间盘退变模型 通过 经后腹膜间隙纤维环穿刺

注意：采用经后腹膜间隙穿刺纤维环法建立兔椎间盘退变模型¹²（图2）。

1. 术前禁食兔子 24 小时，可自由饮水。
2. 通过耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥钠（1.3 mL/kg）对兔子进行麻醉（遵循机构批准的方案）。
3. 确认兔子无活动、肌肉松弛、角膜反射消失且对压迫无疼痛反应，以确保麻醉成功。
4. 将兔子俯卧位固定于固定板上。
5. 剃毛并准备手术区域。
6. 触诊骨性标志，用记号笔在兔子腰背部标记 L1-L7 腰椎棘突。
7. 再次触诊兔子横突，以确定手术切口位置。
8. 铺无菌巾，并对局部皮肤进行消毒，确保无菌条件。
9. 采用后路腹膜外入路，逐层分离筋膜和肌肉，暴露腰椎间盘的侧面。
10. 用穿刺针穿刺纤维环，深度约 5 mm，留置时间为 5 s。
11. 依次穿刺 L3-4、L4-5 和 L5-6 椎间盘，确保每个椎间盘仅穿刺一次。
12. 使用直径为 0.25 mm 的缝合线逐层缝合组织。
13. 造模完成后对穿刺部位进行消毒并包扎。
14. 每日肌肉注射青霉素 40,000 U/只，连续注射三天。
    注：使用规格为 800,000 单位/瓶、兽药批准文号为 140051251 的青霉素。

3. IVDD 模型的选择与结局评估

1. 兔的死亡率及一般状况评估
   1. 每周观察兔的存活情况并记录其一般状况，包括精神状态、活动模式、摄食和饮水情况，以及粪便和尿液排泄情况。
   2. 准确记录观察结果，并注明任何状况变化。
2. 兔的体重监测
   1. 在模型建立前、模型建立后以及组织采集前记录兔的体重。
   2. 确保体重记录准确，并注明任何显著变化。
3. 影像学评估
   1. 在模型建立前及模型建立后4周，对每只白兔获取整个腰椎椎体移植序列的矢状位1.5T T2加权磁共振成像。
   2. 观察椎间盘退变的程度。
   3. 采用Griffith等人提出的改良Pfirrmann分级系统¹⁵对椎间盘退变进行定量评估。由三位独立且不知分组情况的放射科医师根据既定标准（包括椎间盘高度、髓核信号强度和纤维环完整性）对T2加权MRI序列进行评估。
   4. 当评估结果差异超过一个等级时，通过共识确定最终分级。所有评估均使用标准化的DICOM图像浏览软件，并在经过校准的显示设置下进行。
4. 组织病理学评估与评分
   1. 建模4周后，通过静脉注射过量戊巴比妥钠（按照机构批准的方案）处死兔，并迅速在冰上采集L2-L3、L3-L4和L4-L5椎间盘¹⁵。
   2. 将L2-L3椎间盘固定于4%多聚甲醛中，其余样本储存于-80 °C。
   3. 将固定后的椎间盘浸入脱钙液（如10% EDTA）中，确保完全浸没。每2-3天更换一次脱钙液，以维持脱钙效果。
   4. 定期监测脱钙过程，直至完全脱钙，所需时间可能为数天至一周，具体取决于椎间盘的大小和厚度。
   5. 用流动水彻底冲洗脱钙后的椎间盘，以去除残留的脱钙液。
   6. 将椎间盘依次浸入梯度乙醇溶液中进行脱水处理，从70%乙醇开始，逐步提高至100%乙醇。每次脱水步骤持续1-2小时/梯度。
   7. 用石蜡（熔点56-58 °C）对脱水后的椎间盘进行浸蜡处理，时间不少于2小时，确保完全渗透。
   8. 将浸透的椎间盘包埋于石蜡块中，并调整位置以便切片。待石蜡块完全冷却并凝固。
   9. 使用切片机将包埋的椎间盘切成薄而均匀的切片（5-10 µm），并将切片贴附于载玻片上，用于后续分析，如组织学染色或免疫组织化学^12,13。
   10. 进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下采集图像，并依据IVD组织病理学分级标准进行HE染色评分¹²。
5. TUNEL检测
   1. 对椎间盘组织切片进行脱蜡和复水处理，随后进行抗原修复和细胞膜通透化处理。
   2. 按1:9比例加入试剂1（TdT）和试剂2（dUTP）的混合液，在湿盒中孵育。
   3. 用PBS缓冲液洗涤切片，加入DAPI染色液，室温避光孵育10分钟。
   4. 使用全自动全景扫描仪及配套处理软件采集图像。
6. 细胞因子检测
   1. 处死实验兔（步骤3.4.1），从腹主动脉采集血液样本。
   2. 将兔血液样本在25 °C下以2000 × g 离心10分钟，分离血清与血细胞。小心收集上清液（血清），确保不含细胞碎片。
   3. 按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清样本中TGF-β的表达水平。
   4. 根据ELISA试剂盒说明配制试剂和标准品。
   5. 将血清样本加入ELISA板的相应孔中。
   6. 根据试剂盒说明，在推荐的温度和时间内孵育反应板。
   7. 按说明洗涤反应板，去除未结合的试剂。
   8. 加入检测抗体及其他必要试剂，遵循试剂盒操作流程。
   9. 再次在指定的时间和温度下孵育反应板。
   10. 彻底洗涤反应板，去除过量试剂。
   11. 向各孔中加入底物溶液，并在推荐时间内孵育，以显色。
   12. 使用分光光度计在试剂盒说明指定的波长下测定各孔的光密度（OD）。
   13. 将OD值代入提供的计算公式，或利用标准品已知浓度绘制的标准曲线，计算样本中目标物的浓度。

4. 统计分析

1. 使用商业软件进行统计分析。
2. 连续变量以均值 ± 标准差表示。
3. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验组间差异。
4. 使用LSD检验进行两两比较。
5. 对重复测量数据采用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）进行分析。
6. 采用Spearman相关分析评估变量间的相关性。
7. 显著性水平设为 α = 0.05，将 P 值小于 0.05 视为具有统计学意义。

结果

手术过程未出现并发症。B组（经皮穿刺组）有1只兔子在手术后死亡。其余动物术后均恢复正常的进食和活动模式，并存活至实验结束。手术部位未观察到持续性出血或感染。

死亡率及一般状况评估
A组和C组的死亡率均为0%，而B组的死亡率为20%（表1）。A组兔子表现出正常的一般状况。在造模前，B组兔子的状况与假手术组相似。然而，造模后第二天，B组兔子出现活力下降、活动减少、倾向于蜷缩在笼子角落、摄食量显著减少、饮水量相对不变、毛发 duller、粪便排出量增加且粪便松软。随着时间推移，B组中有一只兔子死亡，其余兔子的摄食量逐渐恢复至造模前水平。但其活力、活动能力、毛发状态和粪便性状仍差于造模前水平。相比之下，自造模后第二周起，C组兔子在活力、活动能力、摄食量、毛发光泽度及粪便性状方面均优于B组。

体重评估
建模前各组兔子的体重相似。然而，在取样前，B组兔子的体重高于A组和C组（图3<...

讨论

本研究结果表明，经皮穿刺和经后腹膜穿刺两种方法均可有效诱导兔模型椎间盘退变（IVDD）。值得注意的是，根据对一般状况、死亡率、组织病理学评估、TUNEL 检测以及血清 TGF-β 水平的综合评价，经后腹膜穿刺模型在椎间盘中诱导出更广泛的退行性改变，同时保持了较低的死亡率。

手术损伤是建立椎间盘退变（IVDD）模型最常用的方法。自Lipson和Muir（1981年）首次成功利用手术刀环切法在兔体内建立IVDD模型以来¹⁶，多种损伤技术相继出现，包括针刺穿孔^12,14,17、纤维环切除¹⁸、全椎间盘切除术、部分及完全髓核切除术¹⁹、髓核抽吸^20,21

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3 T 兽用磁共振成像（MRI）	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
医用酒精	LIRCON	20230107
苯唑西林钾	江西科达动物药业	140051251
止血钳	SHINVA	20211239
注射器	CONPUVON	20153151307
手术刀片	Hons Medincal	20210615
医用吸水棉球	Cofoe	20210006
医用缝合针	上海小医医疗器械	20192020430
髓核穿刺针	扬州江洲医疗器械	20190902	用于椎间盘穿刺
生理盐水	NeilMed	C1210504D2
聚维酮碘溶液	四川伊济思医疗科技	20221209
准微量电子天平	Explorer
兔解剖手术台	振华生物医学	ZH-BXT-3Z
剃毛器	AUX
统计分析软件	IBM	SPSS
无菌纱布	Cofoe	20202140675
外科手套	DR.LERSH	20172140028
手术刀	Hons Medinca	20210019
手术镊	SHINVA	20210233
USB-C 数据传输线	KINI
白光摄影显微镜	Nikon	Eclipse Ci-L