方法文章

符合GMP标准的临床试验用间充质干细胞来源小细胞外囊泡从大体积样本中的分离

DOI：

10.3791/67644

⸱

2025年3月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Southwest Hospital/Southwest Eye Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 2Key Lab of Visual Damage and Regeneration & Restoration of Chongqing, 3Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 4Institute of Pathology and Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University) and Key Laboratory of Tumor Immunopathology, 5Army 953 Hospital, Shigatse Branch of Xinqiao Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 6Jinfeng Laboratory, 7Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Army Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（MSC-sEVs）被认为是一种不良反应极小的无细胞治疗方式。本研究提供了一种结合血液透析与超速离心的制备方案，显著缩短了整个流程所需时间，并确保符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（MSC-sEVs）作为一种无细胞治疗手段，因其不良反应极小而备受关注。相比之下，传统的提取方法（如超速离心法和尺寸排阻色谱法）在耗时、成本和可扩展性方面存在局限性。为克服这些限制，我们提出了一种结合血液透析器与超速离心的技术方法。该方法采用截留分子量为100 kDa的血液透析装置膜，可选择性地浓缩sEVs，同时滤除大量蛋白质，从而提高sEVs的得率和纯度。初步纯化步骤之后再通过超速离心进一步精制sEV制剂。这两种技术的结合不仅显著缩短了整个流程所需时间，还确保了符合药品生产质量管理规范（GMP）的要求。本方法在从大体积样本中高效分离sEVs方面表现出显著优势，较传统方法实现了重要进步。该方案有望通过提供一种可规模化、成本效益高且符合GMP标准的解决方案，加速基于囊泡的治疗方法向临床应用的转化。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（MSC-sEVs）是一类具有多种组分的异质性囊泡，富含mRNA、微小RNA（micro-RNA）、细胞因子、脂质和代谢物等1。近年来，大量研究强调了MSC-sEVs作为一种无细胞治疗手段所具备的巨大治疗潜力，其不良反应极小2，在应对衰老、组织退变、癌症以及炎症性疾病等多种病症方面展现出广阔前景3,4,5,6。然而，sEV的大规模提取仍面临关键挑战，传统方法往往耗时耗力或经济成本过高。此外，确保可重复性对于基于囊泡的疗法在临床应用和转化中至关重要7。研究人员迫切需要一种不仅操作简便、高效，而且符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的纯化方法8。

传统的纯化方法，包括超速离心、超滤、尺寸排阻色谱、免疫亲和以及聚合物沉淀，已在先前的研究中得到广泛应用9。通常情况下，传统的sEV分离方法存在诸多局限性，例如产率低、纯度不足，以及难以满足严格的无菌标准。此外，已有研究报道了一些具有前景的新技术，如微流控系统10,11、无标记磁分离12和共价化学分离13，可在分离性能上实现显著提升。然而，由于这些先进技术需要专用设备，大多数研究团队难以采用。综上所述，从大量样本中高效分离符合GMP标准的sEV仍是当前面临的关键障碍，严重限制了众多团队在科研和临床应用中的进展。

超速离心法是目前最广泛采用的小细胞外囊泡（sEV）分离方法，被公认为金标准方法14,15。该技术利用密度和尺寸的差异来分离sEV。分离得到的sEV通常用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以去除残留的污染物。随后，一般使用适量PBS重新悬浮洗涤后的sEV，并通过调节PBS体积获得不同预期浓度的sEV。此外，有研究报道，采用超速离心法获得的血浆sEV纯度优于尺寸排阻色谱法（SEC）分离的血浆sEV，且超速离心获得的sEV中非囊泡细胞外颗粒（NVEPs）杂质含量更低。这也使得超速离心法在许多需要高浓度sEV的治疗应用中成为最广泛使用且难以替代的方法。然而，除了质量与纯度外，在大体积sEV提取过程中，效率也是不可忽视的因素。迄今为止，单次超速离心最多可支持约600 mL的样本体积，这意味着仅靠超速离心难以满足大规模提取的需求16。

血液透析装置由基于膜的模块构成，其中包含数千根中空纤维。血液在封闭的圆柱形腔室内流经这些纤维17。血液中的成分可根据其分子大小和离子浓度选择性地透过这些膜。在临床中，该装置被广泛用作人工肾，以清除患者血液中的代谢废物和多余液体18,19,20。换句话说，血液透析器也有潜力用于大体积样本的浓缩，其原理类似于切向流过滤（TFF）。根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）最新发布的指南，小细胞外囊泡（sEV）的浓缩适用于大体积样本，例如细胞培养上清液。经过数十年的发展，血液透析器已在医院中广泛应用，成熟的耗材供应充足，且拥有大量熟练的操作人员，这使得样本无菌条件更易于维持。

本研究介绍了一种基于血液透析器和超速离心机的sEV纯化方法，该方法符合药品生产质量管理规范（GMP）。我们选用截留分子量（MWCO）为100 kDa的透析器，已证实其可有效捕获sEV并滤除大量蛋白质22。超速离心步骤可进一步实现纯化。研究结果表明，血液透析器同样适用于sEV的浓缩。本方案使研究人员能够高效地从大体积样本中分离sEV。我们已在**中国临床试验注册中心**（ChiCTR，注册号：ChiCTR2200059018）完成临床试验注册，目前该试验仍在进行中，尚未完成。尽管现阶段尚无临床数据可供发表，但如本方案所述，建立一种可靠、大规模、高效且合规的sEV制备方法，是开展临床前及临床试验的前提条件。

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方案

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该方案已获得西南医院人类研究伦理委员会批准，并依照其规定执行。

1. 从培养基中去除细胞碎片

注意：以下操作应在符合药品生产质量管理规范（GMP）的环境中进行，特别是当样品可能直接暴露于环境时。

  1. 鉴于需要无微生物环境，确保滤器和橡胶管经过高压灭菌以实现有效灭菌。确保所有可能接触培养基的其他耗材均为无菌状态且包装密封。在超净工作台内进行去除细胞碎片的操作。
  2. 将0.45 µm和0.22 µm的过滤膜安装至滤器装置上。使用橡胶管将蠕动泵（见材料表）与滤器装置连接。将0.45 µm膜置于0.22 µm膜上方；否则可能降低过滤效率（图1）。注意区分微孔滤膜的正反面。
  3. 启动蠕动泵开始过滤。在泵的驱动下，含5%添加剂的间充质干细胞基础培养基（MSCBM）（见材料表）从一端进入滤器，过滤后的培养基从另一端收集，如（图1）所示。将过滤后的培养基收集至双通道引流袋中。通过优化蠕动泵流速并根据需要更换滤膜，以维持过滤系统的完整性。
  4. 过滤完成后，关闭引流袋的进样阀，并用封口膜（parafilm）（见材料表）进一步密封。随后进行下一步操作，或将过滤后的细胞培养基暂时保存于4 °C环境中。

2. 使用血液透析器浓缩过滤后的培养基

注意：在细胞培养中应避免使用含有酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），因为透析器中的漏血检测器会被激活或导致透析器设置中的漏血检测器关闭。

  1. 准备耗材。
    1. 在浓缩前准备好管路、100 kDa截留分子量的高通量聚砜膜、血液透析器、输液器、生理盐水溶液、输液袋、碘溶液和棉签（参见材料表）。
  2. 开启系统并进行自检。
    1. 检查血液透析器电源线的连接情况，然后打开主电源开关。
    2. 等待机器完成全部自诊断程序。
  3. 安装管路和透析器。
    1. 核对一次性使用管路和血液透析器的有效期，确保外包装完好无损，并检查管路有无破损。
    2. 按照体外循环中血液流动的方向安装管路，依次关闭分支阀门，形成闭合循环回路。
  4. 开始冲洗程序。
    1. 使用输液器将泵前管路上的生理盐水（不含肝素）连接至透析回路。将静脉收集端连接至废液袋。
      注意：生理盐水中不得含有肝素或其他抗凝剂。
    2. 将透析液供给/回流管路连接至透析器。
    3. 启动血液透析器，将流速设定为80–100 mL/min。排净透析回路和透析器内的所有空气，确保整个管路系统充满液体。
    4. 调节动脉室和静脉室的液面至约三分之二满。生理盐水依次流经动脉管路、透析器、静脉管路，最终进入废液袋。
  5. 开始超滤浓缩。
    1. 完成冲洗程序后，将装有滤过培养基的引流袋挂在输液架上，用浸有碘液的棉签对输出通道进行消毒，并通过输液器将引流袋的输出通道连接至泵前端口。
    2. 连接管路的动脉端口与静脉端口，建立隔离性超滤（ISO-UF，即无透析液流动的超滤）透析回路（图1）。
    3. 在透析机上设定超滤目标体积，使其与引流袋中液体的总体积相对应。将超滤的透析时间设为系统的最短可运行时间。参数设置成功后，启动超滤程序。
      注意：由于血液透析系统的计算机制，透析时间不会过短，而是维持在一个较为适中的速率。
  6. 收集浓缩液。
    1. 达到目标脱水量后，关闭动脉夹，将静脉端口连接至无菌输液袋。
    2. 打开带空气过滤器的一次性管路的泵前端口。以约50 mL/min的速度启动血泵，使管路内的液体再次从动脉管路流向静脉管路循环一次。将回路中所有浓缩液（约158 mL）重新回收至无菌输液袋中。
    3. 在浓缩后期，从透析液回流管路中收集废液。对废液样本进行与浓缩培养基相同的操作处理，以监测浓缩过程中是否发生sEVs的意外损失。
    4. 关闭所有阀门，取下输液袋、透析器及所有管路。关闭电源，并对机器表面进行擦拭消毒。

3. 使用超速离心机分离小细胞外囊泡（sEVs）

  1. 将浓缩的培养基转移至超速离心管中，然后进行平衡。
  2. 在临床级超速离心机（见材料表）中以 110,000 × g 离心 70 分钟，随后用无菌生理盐水洗涤沉淀物，并再次以 110,000 × g 离心 70 分钟。
  3. 将沉淀的小细胞外囊泡（sEVs）重悬于适量的无菌生理盐水中。
  4. 将 sEVs 转移至无菌管中用于进一步检测，或储存于 -80 °C 以备后续使用。

4. 所获sEVs的表征

  1. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
    1. 用 PBS（1 mL）稀释所获得的 sEVs（1 µL）（参见 材料表）。调节显微视野中可见的 sEVs 数量，使其保持在 50 至 200 个之间。
    2. 小心地将稀释后的样品注入样品孔中，避免引入气泡。
    3. 当视野中各位置的颗粒数量尽可能高且稳定时进行测量。分析参数如下：最大面积：1000，最小面积：10，最小亮度：30，轨迹长度：15，温度：25 °C，灵敏度：75。
    4. 每份样品至少测量三次。
  2. 蛋白质印迹分析（Western blotting）
    1. 用 PBS 稀释 sEVs 溶液。使用二喹啉酸（BCA）蛋白质检测试剂盒（参见 材料表）测定蛋白质浓度。
    2. 将 sEVs 在样品缓冲液中 100 °C 煮沸 5 分钟。
    3. 制备 12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶（参见 材料表）。组装电泳装置，将等量蛋白质样品加入 SDS-PAGE 凝胶的加样孔中。电泳电压设置为 80 V 浓缩，100 V 分离。
    4. 将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（参见材料表）在甲醇中活化 1 分钟，然后将其浸泡在转移缓冲液中，随后在 100 V 条件下转移 1 小时。
    5. 将 PVDF 膜浸入含 5% 牛血清白蛋白（BSA；参见材料表）的 TBST 缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）中，封闭 30 分钟。
    6. 将 PVDF 膜在摇床上与一抗于 4 °C 过夜孵育。所使用的一抗如下：人源抗 CD63 抗体（1:1000 稀释）、人源抗 CD9 抗体（1:1000 稀释）和人源抗 HSP70 抗体（1:1000 稀释）（参见 材料表）。
    7. 次日，用 TBST 溶液洗涤 PVDF 膜 5 次，每次 5 分钟，然后在室温（RT）下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:10000 稀释）（参见 材料表）孵育 1 小时。
    8. 再次用 TBST 洗涤 5 次后，使用化学发光检测试剂在化学发光成像系统中进行显影。
  3. 透射电子显微镜观察
    1. 将 20 µL 用 PBS 稀释的样品液滴滴于蜡纸上，然后将铜网（参见 材料表）置于液滴上，使样品覆盖铜网，并在室温下静置 20 分钟。
    2. 用滤纸吸去多余液体，然后将样品在 20 µL 含 2% 多聚甲醛、2% 戊二醛和 0.05 M 磷酸盐溶液的固定液中固定 2 分钟。
    3. 用双蒸水冲洗铜网三次，然后在室温下用 20 µL 2% 磷钨酸（PTA）染色 1 分钟。
    4. 用滤纸吸去多余液体，将铜网干燥过夜，随后进行透射电子显微镜分析（参见 材料表）。
      注：建议的透射电镜参数如下：曝光时间：1.0 s，高压电压：100.00 kV，束流：50 µA，光斑尺寸：1，模式：TEM。具体参数可根据仪器制造商的说明进行调整（参见 材料表）。

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结果

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小细胞外囊泡（sEVs）的形态学表征
在浓缩的最后阶段，按所述方法同时收集了废液。分别对浓缩培养基和废液进行超速离心。我们收集了沉淀物用于透射电子显微镜（TEM）分析。正如预期，浓缩培养基组中观察到大量杯状纳米囊泡（图2A、B）。然而，在废液组中未检测到典型的小细胞外囊泡（sEV）颗粒。这些结果证明，该方案能够在关键的浓缩步骤中有效分离sEVs，且无明显损失。

小细胞外囊泡（sEVs）蛋白标志物的表征
此外，采用蛋白质印迹（Western blot）分析对分离得到的sEVs中的蛋白标志物（CD9、CD81、HSP70）进行表征。在浓缩培养基组中观察到清晰的蛋白条带，而在废弃液体样本中未检测到相应条带（图2C）。综上，这...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分离sEVs的传统方法包括差速超速离心、尺寸排阻色谱和PEG沉淀法，每种方法都有其优缺点。尽管整合这些不同技术可能提高sEVs的得率或纯度，但额外的步骤往往增加了样品污染的风险。目前市场上已出现一些声称能够大规模提取sEVs并符合GMP标准的集成化系统21。然而，这些系统的广泛应用对经费提出了较高要求，尤其对于数量日益增长的EV研究团队而言构成显著的经济挑战。此外，这些新设备缺乏标准化的操作流程和公认的操作规范，可能带来一定程度的风险。GMP要求在方法学和设备上进行更多探索，以确保得率与纯度同时达标。

根据最近一项关于sEVs临床应用的综述23，35%的研究完全采用该方法；另有12.5%的研究将超速离心法与其他技术联合使用。其广泛应用也意味着超速离心机已成为相当一部分研究人员可获得的实验设备24。

从实际应用角度来看，超速离心技术有助于我们的方法从较大的细胞、细胞碎片和死细胞等其他成分...

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作获得了中国国家自然科学基金（822101167，资助对象：BB）和重庆市自然科学基金（CSTB2022NSCQ-MSX0020）的资助 至BB），重庆博士 "通过训练" 中国科学技术研究项目（CSTB2022BSXM-JCX0031，资助BB）和国家自然科学基金（82271132，资助YL）。我们感谢第三军医大学（陆军军医大学）第一附属医院肾内科以及西南医院病理研究所和西南癌症中心在设备和技术方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗CD63抗体SBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:1000 稀释
抗CD9抗体SBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:1000 稀释
抗HSP70抗体SBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:1000 稀释
双辛可宁酸蛋白检测试剂盒BeyotimeP0012
血液管路Fresenius Medical CareAP16641
5% 牛血清白蛋白Solarbio9048-46-8
细胞培养添加剂HeliosHPCPLCGL05在细胞培养基中占5%（v/v）
铜网PreciseRGRS GP-SMPG-1
透析器HelixoneFX8100 kDa 截留分子量
引流袋CZRUIDEYLD-01
山羊 抗兔 HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 稀释
山羊 抗兔 HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 稀释
山羊 抗兔 HRPSBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:10000 稀释
间充质干细胞基础培养基（MSCBM）DakeweDKW34-BM20500
微滤膜shanghaixingyaWKLM-50-100.45 μm 和 0.22 μm 
封口膜（Parafilm）Fisher Scientific1337416
蠕动泵LongerPumpYZ1515x
磷酸盐缓冲液（PBS）SolarbioP1022-500ml
Immun-Blot PVDF 膜BIO-RAD1620177
SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒BeyotimeP0012AC
SDS-PAGE 样品上样缓冲液BeyotimeP0015A
Super ECL Plus 蛋白印迹底物BIOGROUNDBG0001
TBST 缓冲液SolarbioT1081
超速离心管（38.5 mL）Beckman344058
Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统BIO-RAD
血液透析器NIKKISODBB-27
纳米颗粒追踪分析仪ZetaViewPMX120用于测量颗粒尺寸
分布及颗粒
浓度
透射电子显微镜JEOLJEM-1400PLUS推荐设置？曝光时间：1.0 s，高压电压：100.00 kV，束流：50 μA，光斑尺寸：1，模式：TEM。
超速离心机BECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti 摆桶转子

参考文献

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